Name: Síntese de Nanopartículas de ouro modificada Aptamer-PEI-g-PEG carregadas com doxorubicina para entrega de drogas direcionadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a síntese de nanopartículas de ouro modificadas com aptâmero PEI-g-PEG carregadas com doxorrubicina para entrega direcionada de fármacos em células cancerígenas. Este método minimiza a toxicidade sistêmica e aumenta a eficácia terapêutica.

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Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31700840); o Principal Projeto de Pesquisa Científica da Província de Henan (18B430013, 18A150049). Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Estudiosos de Nanhu para Jovens Estudiosos da XYNU. Os autores gostariam de agradecer ao estudante de bacharel Zebo Qu, da Faculdade de Ciências da Vida em XYNU, por seus trabalhos úteis. Os autores gostariam de reconhecer o Centro de Análise & Testes da XYNU para o uso de seus equipamentos.

ATENÇÃO: Certifique-se de consultar todas as folhas de dados de segurança do material relevante (MSDS) antes de usar todos os produtos químicos. Vários dos produtos químicos usados para preparar copolímeros e nanopartículas são agudamente tóxicos. As nanopartículas também têm perigos potenciais. Certifique-se de usar todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção individual, incluindo luvas, jaleco, capuzes, calças de comprimento integral e sapatos de dedos próximos.
1. Síntese de polietileno glicol de carboxil duplo (CT-PEG)33
<ol><li>Adicione 1,46 g (14,6 mmol) de anidrido succinico (SA) e 209 mgs (1,71 mmol) de 4 dimetilaaminopirridina (DMAP) a um frasco fundo redondo de 100 mL.</li>
	<li>Adicione 15 mL de tetrahidrofurano anidrofurano (THF) ao frasco usado na etapa 1.1 e coloque uma rolha de vidro. Mantenha o frasco a 0 °C por 30 min.</li>
	<li>Adicione 4,28 g (4,28 mmol) de polietileno glicol (PEG) e 1,8 mL (12,8 mmol) de trietilamina (TEA) a um novo frasco.</li>
	<li>Adicione 15 mL de THF anidro ao frasco usado na etapa 1.3 e coloque uma rolha de vidro. Transfira a solução lentamente para o frasco usado na etapa 1.2, usando uma seringa sob atmosfera de nitrogênio.</li>
	<li>Mexa a solução a 0 °C por 2h e continue a reação à temperatura ambiente (RT) durante a noite.</li>
	<li>Utilizando um evaporador rotativo (40 °C, 0,1 MPa), concentre a solução de reação e remova o solvente THF.</li>
	<li>Na RT, dissolva a solução de reação da etapa 1.6 em 15 mL de 1,325 g/mL de diclorometano (DCM), em seguida, adicione 15 mL de éter de dietil frio (Et2O) para obter o produto de precipitação (diacíclico polietilenoglicol). Remova o solvente através de papel filtro. NOTA: O passo de precipitação pode ser repetido 3x.</li>
	<li>Seque os precipitados sob vácuo em RT por 48 h.</li>
</ol>2. Síntese do copolímero PEI-g-PEG
<ol><li>Adicione 305,47 mg de CT-PEG da etapa 1.8 e 5 mL de sulfóxido de dimetila (DMSO) a um frasco e mexa no RT para garantir que o CT-PEG seja totalmente dissolvido no DMSO.</li>
	<li>Dissolver 49,46 mg de 1-(3-dimetilaminapropyl)-3-etilcarbodimídeo hydrochloride (EDC) em 5 mL de DMSO, em seguida, adicione a solução ao frasco usado na etapa 2.1 e mexa por 30 min na RT.</li>
	<li>Dissolver 29,69 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) em 5 mL de DMSO e adicionar a solução ao frasco utilizado na etapa 2.1. Continue mexendo no RT por 3 h.</li>
	<li>Dissolva 28,6 μL de polietileneimina (PEI) em 10 mL de DMSO e adicione a solução dropwise ao frasco usado na etapa 2.1. Mexa por 3 dias, pelo menos.</li>
	<li>Transfira a solução reagida da etapa 2.4 para um saco de diálise (corte de peso molecular de 1.000 [MWCO]). Coloque o saco de diálise em um béquer de 1 L com 500 mL de água ultrapura como o dialise. Troque a água ultrauso a cada 12 h por 3 dias.</li>
	<li>Transfira a solução na etapa 2.5 para outra bolsa de diálise (10.000 MWCO). Coloque o saco de diálise em um béquer de 1 L com 500 mL de água ultrapura como o dialise. Troque a água ultrauso a cada 12 h por 3 dias.</li>
	<li>Concentre a solução a partir da etapa 2.6 usando um evaporador rotativo (40 °C, 0,1 MPa) e congele a amostra para obter o pó PEI-g-PEG.</li>
</ol>3. Síntese de PEI-g-PEG@AuNPs
<ol><li>Dissolva 5 mg de PEI-g-PEG preparado (passo 2.7) em 5 mL de água ultrapura em um novo frasco e ajuste com uma rolha de vidro.</li>
	<li>Adicione 100 mL de solução HAuCl4 de 0,3 mM ao frasco e mexa a solução por 3 h na RT. NOTA: A cor da solução deve mudar imediatamente de amarelo para laranja.</li>
	<li>Adicione 1 mL de solução NaBH4 de 1 mg/mL ao frasco e mexa a solução por 3 h na RT. NOTA: A solução de reação deve instantaneamente virar borgonha.</li>
	<li>Dialise o produto de reação usando um saco de diálise (1.000 MWCO) durante 3 dias, conforme descrito na etapa 2.5 para obter a solução PEI-g-PEG@AuNPs.</li>
</ol>4. Síntese de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
<ol><li>Adicione 1 mL de solução DOX de 2,2 mg/mL e 20 mL de solução PEI-g-PEG@AuNPs a um novo frasco e ajuste com uma rolha de vidro.</li>
	<li>Dissolva 0,727 mg de EDC em 1 mL de água ultrauso e adicione a solução EDC ao frasco utilizado na etapa 4.1.</li>
	<li>Dissolva 0,437 mg de NHS em 1 mL de água ultrapura. Adicione a solução NHS ao frasco e mexa no RT por 1h.</li>
	<li>Dilífique o produto de reação usando um saco de diálise (1.000 MWCO) durante 3 dias, conforme descrito na etapa 2.5 para obter a solução DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.</li>
</ol>5. Síntese de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
<ol><li>Adicione 20 mL de solução DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e 4OD de AS1411 (OD = densidade óptica; 1OD ≈ 33 μg) a um novo frasco.</li>
	<li>Dissolva 28,76 mg de EDC em 1 mL de água ultrauso e adicione a solução EDC ao frasco usado na etapa 5.1.</li>
	<li>Dissolva 17,27 mg de NHS em 1 mL de água ultrapura. Adicione a solução NHS ao frasco usado na etapa 5.1 e mexa a reação por 1 h no RT.</li>
	<li>Dilífique o produto de reação usando um saco de diálise (1.000 MWCO) durante 3 dias, conforme descrito na etapa 2.5 para obter AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.</li>
</ol>6. Caracterização da amostra
<ol><li>Dissolva o polímero CT-PEG (etapa 1.8) e o copolímero PEI-g-PEG (etapa 2.7) em tubos de clorofórmio-d em tubos de ressonância magnética nuclear (RMR), respectivamente. Analise as amostras usando um espectrômetro NMR de 600 MHz equipado com um ímã supercondutor de 14,09 T e uma sonda de alta resolução de banda larga Z de 5,0 mm 600 MHz para confirmar a estrutura química34.</li>
	<li>Disperse AuNPs, DOX e AS1411, e prepare pei-g-PEG@AuNPs (etapa 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (etapa 4.4) e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (etapa 5.4), respectivamente em água ultrapura. Em seguida, transfira para cuvetas e registos ultravioleta-visível (UV-vis) usando um espectrômetro UV-vis.</li>
	<li>Conecte um adesivo de dupla face (~2 mm x 2 mm) à folha de alumínio e mergulhe a solução de amostra (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) na fita inteira uniformemente. Analise as amostras usando um analisador de espectroscopia de fotoeletrâncro de raios-X.</li>
	<li>Disperse as soluções PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, respectivamente em água ultrauso. Em seguida, transfira para cuvetas e avalie a distribuição de tamanho usando dispersão dinâmica de luz.</li>
	<li>Disperse as soluções PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs em água ultrauso (uma gota de amostra por 5 mL de água ultrauso para cada amostra). Sonicate por 2 h. Mergulhe a rede de cobre em soluções de amostra e seque sob uma lâmpada infravermelha. Caracterize a morfologia usando um microscópio eletrônico de transmissão.</li>
	<li>Injete 1 mg de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs em um de diálise MWCO de 20 kDa, em seguida, coloque em 80 mL de salina tamponada de fosfato (PBS) com 5% de albumina de soro bovino (BSA). Mexa a 37 °C.</li>
	<li>Nos pontos de tempo predeterminados, colete alíquotas de 100 μL e substitua por PBS fresco. Use um espectrofotômetro UV-vis para medir a intensidade de fluorescência do DOX das alíquotas.</li>
</ol>7. Ensaio CCK-8 de nanopartículas AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
<ol><li>Cultivar células A549 no meio modificado da Águia (DMEM) modificado de Dulbecco ( DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal, penicilina U/mL de 100 U/mL e 100 μg/mL estreptomicina sob uma atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2 a 37 °C. Substitua o meio de cultura a cada 2 dias. Use células na passagem 5 para a proliferação celular e ensaios de citotoxicidade para avaliar quantitativamente a citotoxicidade das nanopartículas AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.</li>
	<li>Adicione 100 μL de solução de nanopartículas em cada poço que contabilizando 1 mL de meio celular. Depois de cultivar por 24h e 48 h, remova a mídia de cultura das placas de cultura celular, em seguida, adicione 300 μL de mídia de cultura fresca e 30 μL de soluções de kit-8 (CCK-8) de contagem celular imediatamente para cada poço. Incubar por 4h em uma incubadora de CO2 a 37 °C.</li>
	<li>Transfira 200 μL de soluções de reação da etapa 7.2 para uma placa de poço 96. Leia a densidade óptica (OD) de cada poço a 570 nm com um leitor de microplacas.</li>
	<li>Observe a morfologia das células a 24 h e 48 h sob um microscópio.</li>
</ol>

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<li>Pichiorri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+NCL+targeting+affects+breast+cancer+aggressiveness+through+miRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).</li>
<li>Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+erosion+properties+of+PEG-containing+polyanhydrides%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides.</a> Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).</li>
<li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+Vaginal+Hydrogels+as+a+Multi-Drug+Carrier+for+Contraception%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception.</a> Applied Sciences. 9 (8), 1638(2019).</li>
<li>Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-responsive+biodegradable+star-shaped+block+copolymers+for+vaginal+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels.</a> Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).</li>
<li>Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+conjugates+of+doxorubicin+bound+through+an+amide+and+hydrazone+bond%3A+Impact+of+the+carrier+structure+onto+synergistic+action+in+the+treatment+of+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O espectro de 1H NMR (Figura 2) confirma a síntese bem sucedida do copolímero CT-PEG e do copolímero PEI-g-PEG. Os pesos moleculares de PEG e PEI foram de 1.000 e 1.200, respectivamente. Além disso, o sistema catalítico EDC/NHS foi usado para sintetizar o copolímero PEI-g-PEG através de reações de amida. Deve-se notar que se os pesos moleculares de PEG e PEI mudaram para sintetizar o copolímero PEI-g-PEG, então o tempo de reação e o sistema catalítico precisam ser reavaliados. Alé...

Sendo o maior problema de saúde pública em todo o mundo, o câncer é amplamente caracterizado como tendo uma baixa taxa de cura, alta taxa de recidiva e alta taxa de mortalidade1,2. Os métodos anti-câncer convencionais atuais incluem cirurgia, quimioterapia e radioterapia3, entre os quais a quimioterapia é o tratamento primário para pacientes com câncer na clínica4. Os medicamentos anticancerígenos usados clinicamente incluem paclitaxel (PTX)5 e doxorubicina (DOX)6,7. O DOX, um medicamento antineoplásico, tem sido amplamente aplicado na quimioterapia clínica, devido às vantagens da citotoxicidade do câncer e da inibição da proliferação de células cancerosas8,9. No entanto, o DOX causa cardiotoxicidade10,11, e a curta meia-vida do DOX restringe sua aplicação na clínica12. Portanto, os transportadores de drogas degradáveis são necessários para carregar o DOX e liberar subeqüentemente de forma controlada para uma área alvo.
As nanopartículas têm sido amplamente utilizadas em sistemas de entrega de medicamentos direcionados e têm várias vantagens no tratamento do câncer (ou seja, proporção superfície-volume considerável, tamanho pequeno, capacidade de encapsular várias drogas e química de superfície incapaz, etc.) 13,14,15. Em particular, as nanopartículas de ouro (AuNPs) têm sido amplamente utilizadas em aplicações biológicas e biomédicas, como a terapia fototérmica do câncer16,17. As propriedades únicas dos AuNPs, como síntese fácil e funcionalização geral da superfície, têm excelentes perspectivas no campo clínico da terapiaoncológica 18. Além disso, os AuNPs têm sido utilizados para identificar estratégias de entrega de medicamentos, diagnosticar tumores e superar a resistência em muitos estudos19,20.
Não obstante, os AuNPs precisam ser mais adaptados para superar a resistência medicamentosa através da alta liberação local em lesões tumorais por meio de uma maior permeação e retenção (EPR), como as propriedades de segmentação e acessibilidade. Os AuNPs funcionais de polímeros apresentaram vantagens únicas, como a melhoria da solubilidade da água de medicamentos anticâncer hidrofóbicos e o tempo de circulação prolongado21,22. Vários polímeros biocompatíveis têm sido usados para revestimentos AuNP, como polietileno glicol (PEG), polietileneimina (PEI), ácido hialurônico, heparina e goma xantana. Em seguida, a estabilidade, assim como a carga útil, de AuNPs é melhorada bem23. Especificamente, o PEI é um polímero altamente ramificado que é composto por muitas unidades repetitivas de aminas primárias, secundárias e terciárias24. PEI tem excelente solubilidade, baixa viscosidade e alto grau de funcionalidade, que é adequado para revestimento em AuNPs.
Por outro lado, os medicamentos anticâncicos precisam ser entregues diretamente às células cancerosas com maior eficiência de carregamento e com menor toxicidade para o tratamento de tumores metastáticos primários e avançados25. Ligantes-alvo têm grande potencial para sistemas de entrega direcionados a medicamentos anticâneos26. Sua seletividade para a ligação de moléculas-alvo confere especificidade de especificidade de medicamentos anticâncer e aumenta o enriquecimento medicamentoso em tecidos doentes27. Mais ligantes incluem anticorpos, polipeptídeos e pequenas moléculas. Comparados com outros ligantes, os aptamers de ácido nucleico podem ser sintetizados in vitro e são fáceis de modificar. AS1411 é um oligonucleotídeo de 26 bp fosfodiester não modificado que forma uma estrutura G-tetramer dimeric estável para se ligar especificamente a um receptor de proteína nuclear de alvo superexpresso em células cancerosas28,29,30. AS1411 inibe a proliferação de muitas células cancerígenas, mas não afeta o crescimento de células saudáveis31,32. Como resultado, o AS1411 tem sido usado para fabricar um sistema ideal de entrega de medicamentos direcionado.
Neste estudo, um copolímero PEI-g-PEG é sintetizado através de uma reação de amida, então as nanopartículas de ouro revestidas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs) são fabricadas. Além disso, o DOX e o AS1411 estão sequencialmente ligados ao PEI-g-PEG@AuNPs preparado, como mostrado na Figura 1. Este protocolo detalhado destina-se a ajudar os pesquisadores a evitar muitas das armadilhas comuns associadas à fabricação de novas PEI-g-PEG@AuNPs carregadas com DOX e AS1411.

<table><tbody><tr><td>4-Dimetilaminopiridina</td><td>Macklin</td><td>D807273</td><td></td></tr><tr><td>A549 célula</td><td></td><td>ATCC CCL-185TM</td><td></td></tr><tr><td>AS1411</td><td>BBI Life Sciences Corporation</td><td></td><td>5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGGG) FL-AS1411 (AS1411 marcado com fluoróforo)</td></tr> <tr><td>Tetrahidrofurano anidro (THF)</td> <td>SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de contagem de células-8 ( CCK-8)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>96992-500TESTS-F</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Medicina tradicional chinesa</td><td>80047318</td><td></td></tr><tr><td>éter dietílico (Et2O)</td> <td>SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Macklin</td><td>D806645</td><td></td></tr><tr><td>meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de doxorrubicina</td><td>Rhawn</td><td>R017518</td><td></td></tr><tr><td>Éter absoluto</td><td>Medicina tradicional chinesa</td><td>80059618</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão por emissão de campo</td><td>FEI Company Tecnai</td><td>G2 F 20</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ouro (III) trihidratado</td><td>Rhawn</td><td>R016035</td><td></td></tr><tr><td>Laser Instrumento de tamanho de partícula</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>ZetasizerNanoZS / Leitor de Microplacas Masterszer3000E</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida Cloridrato</td><td>Macklin</td><td>N808856</td><td></td></tr><tr><td>N-Hidroxisuccinimida</td><td>Macklin</td><td>H6231</td><td></td></tr><tr><td>Software de RMN</td><td>Delta 5.2.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear</td><td>JEOL</td><td>JNM-ECZ600R / S3</td><td></td></tr><tr><td>Origem 8.5</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900929-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilenoglicol)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>81188</td><td>BioUltra, média Mn ~ 1000</td></tr><tr><td>Solução de poli (etilenoimina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>482595</td><td>Mn médio ~ 1200, 50% em peso em H2O</td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio, pó</td><td>Acros</td><td>C18930</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85886-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido succínico</td><td>Medicina tradicional chinesa</td><td>30171826</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Medicina tradicional chinesa</td><td>40058161</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Medicina tradicional chinesa</td><td>80134318</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro UV/VIS/NIR</td><td>Lambda950</td><td>Lambda950</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de Fotoelétrons de Raios-X</td><td>Thermo&ensp; Pescador Científico</td><td>K-ALPHA 0.5EV</td><td></td></tr></tbody></table>

síntese de nanopartículas de ouro modificada aptamer-pei-g-peg carregadas com doxorubicina para entrega de drogas direcionadas

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Devido à resistência e toxicidade de medicamentos em células saudáveis, o uso de doxorubicina (DOX) tem sido limitado na terapia clínica do câncer. Este protocolo descreve a concepção de poli (etilenimina) enxertada com polietileno glicol (PEI-g-PEG) nanopartículas de ouro funcionalizadas (AuNPs) com aptámero carregado (AS1411) e DOX através de reações de amida. O AS1411 é especificamente ligado a receptores de nucleoslinas direcionados em células cancerosas para que o DOX alveja células cancerígenas em vez de células saudáveis. Primeiro, o PEG é carboxilado, depois enxertado em PEI ramificado para obter um copolímero PEI-g-PEG, que é confirmado pela análise de 1H NMR. Em seguida, as nanopartículas de ouro revestidas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs) são sintetizadas, e DOX e AS1411 são covalentemente ligados aos AuNPs gradualmente através de reações de amida. O diâmetro do AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs é de ~39,9 nm, com potencial zeta de -29,3 mV, indicando que as nanopartículas estão estáveis em água e meio celular. Ensaios de citoxicidade celular mostram que os AuNPs carregados de DOX recém-projetados são capazes de matar células cancerígenas (A549). Esta síntese demonstra o delicado arranjo de copolímeros PEI-g-PEG, aptamers e DOX em AuNPs que são obtidos por reações sequenciais de amida. Tais AuNPs funcionalizados aptamer-PEI-g-PEG fornecem uma plataforma promissora para a entrega de medicamentos direcionados na terapia contra o câncer.

1 A espectroscopia H NMR foi utilizada para confirmar a síntese bem sucedida de polímeros CT-PEG e copolímeros PEI-g-PEG(Figura 2). A Figura 2a mostra que o sinal de próton de metileno em δ = 3,61 ppm e sinal de próton carboxil em δ = 2,57 ppm confirmam a síntese bem sucedida dos polímeros CT-PEG. A Figura 2b mostra que o sinal de próton de metileno de PEG em δ = 2,6 ppm e sinal de próton de PEI...

Neste protocolo, as nanopartículas de ouro modificadas AS1411-g-PEI-g-PEG são sintetizadas através de reações de meio-médio de três etapas. Em seguida, a doxorubicina é carregada e entregue às células cancerígenas alvo para a terapia contra o câncer.

Síntese de Nanopartículas de ouro modificada Aptamer-PEI-g-PEG carregadas com doxorubicina para entrega de drogas direcionadas

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Devido à resistência e toxicidade dos medicamentos, o uso de doxorrubicina é limitado na clínica. Este protocolo fornece um transportador degradável para manter a liberação deste agente terapêutico. A vantagem desse método é que o transportador sintetizado pode ser usado para entregar o medicamento diretamente às células cancerígenas, induzindo a morte celular apenas nas células cancerígenas.Para a síntese de CT-PEG, adicione primeiro 1,46 gramas de anidrido succínico e 209 miligramas de 4-dimetilaminopiridina a um balão de fundo redondo de 100 mililitros. Em seguida, adicionar 15 mililitros de tetra-hidrofurano anidro ao balão e colocar uma rolha de vidro no balão, antes de incubar a reacção durante 30 minutos a zero graus Celsius. Durante a incubação, adicionar 4,208 gramas de PEG, 1,8 mililitros de trietilamina e 15 mililitros de tetrahidrofurano anidro a um novo balão e fechar o balão com uma rolha de vidro.No final da incubação, utilizar uma seringa sob atmosfera de azoto para transferir lentamente a segunda solução para o primeiro balão. Agitar a nova solução durante duas horas a zero graus Celsius, antes de continuar a reacção à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, use um evaporador rotativo a 40 graus Celsius e 0,1 megapascals para concentrar a solução de reação e remover o solvente tetrahidrofurano.Após uma hora, dissolva a solução de reação em 15 mililitros de 1,325 grama por mililitro de diclorometano à temperatura ambiente, antes de adicionar 15 mililitros de éter dietílico frio para obter o produto de precipitação diácida PEG. Em seguida, remover o solvente através de papel de filtro e secar o precipitado sob vácuo durante 48 horas à temperatura ambiente. Para a síntese do copolímero PEI-g-PEG, adicione 305,47 miligramas do precipitado CT-PEG e cinco mililitros de DMSO a um novo frasco e agite a reação à temperatura ambiente até que o CT-PEG esteja totalmente dissolvido.Em seguida, dissolver 49,46 miligramas de EDC em cinco mililitros de DMSO e adicionar a solução ao balão. Agitar a reacção durante 30 minutos à temperatura ambiente, antes de dissolver 29,69 miligramas de N-hidroxisuccinimida e cinco mililitros de DMSO e adicionar a solução resultante ao balão. Continue a mexer a reação por três horas em temperatura ambiente.Perto do final da incubação, dissolver 28,6 microlitros de PEI em 10 mililitros de DMSO e adicionar a solução gota a gota ao frasco. Agite a reação em temperatura ambiente por pelo menos três dias. No final da incubação, transfira a solução reagida para uma bolsa de diálise com um corte de 1000 pesos moleculares e coloque a bolsa em um béquer de um litro contendo 500 mililitros de água ultrapura como dialisato.No final da diálise, transfira a solução para uma bolsa de diálise com um corte de 10.000 pesos moleculares e coloque a bolsa em um béquer de um litro com 500 mililitros de água ultrapura como dialisado. No final da segunda diálise, use um evaporador rotativo a 40 graus Celsius e 0,1 megapascals para concentrar a solução e liofilizar a amostra para obter o pó de PEI-g-PEG. Para o revestimento de nanopartículas de ouro com o produto PEI-g-PEG, dissolva cinco miligramas do PEI-g-PEG preparado em cinco mililitros de água ultrapura em um novo frasco e encaixe o frasco com uma rolha de vidro.Adicionar 100 mililitros de solução de cloreto áurico 0,3 milimolar ao balão e agitar a solução durante três horas à temperatura ambiente. As cores devem mudar imediatamente de amarelo claro para amarelo escuro. No final da incubação, adicionar ao balão um mililitro de um miligrama por mililitro de solução de boro-hidreto de sódio.A cor deve mudar imediatamente de amarelo escuro para amarelo dourado e mexer a solução por mais três horas em temperatura ambiente. Em seguida, dialise o produto da reação com uma bolsa de diálise de corte de 1000 pesos moleculares por três dias, conforme demonstrado para obter a solução de nanopartículas de ouro revestida com PEI-g-PEG. Para enxertia de doxorrubicina nas nanopartículas de ouro revestidas com PEI-g-PEG.Adicione um mililitro de 2,2 miligramas por mililitro de solução de doxorrubicina e 20 mililitros da solução de nanopartículas de ouro revestida com PEI-g-PEG a um novo frasco e encaixe o frasco com uma rolha de vidro. Em seguida, dissolver 0,727 miligramas de EDC num mililitro de água ultrapura e adicionar a solução de EDC ao balão. Dissolva 0,437 miligramas de N-hidroxisuccinimida em um mililitro de água ultrapura e adicione a solução de N-hidroxisuccinimida ao frasco por uma hora de incubação com agitação em temperatura ambiente.No final da incubação, dialisar o produto da reação em uma bolsa de diálise de corte de 1000 pesos moleculares por três dias, conforme demonstrado para obter a solução de nanopartículas de ouro revestidas com doxorrubicina g-PEI-g-PEG. Para enxertia do aptâmero AS1411 no Adicione 20 mililitros da solução de nanopartículas de ouro revestidas com doxorrubicina DOX-g-PEI-g-PEG a uma concentração de aproximadamente quatro densidades ópticas de AS1411.Dissolver 28,76 miligramas de EDC num mililitro de água ultrapura e adicionar a solução de EDC ao balão. Dissolva 17,27 miligramas de N-hidroxisuccinimida em um mililitro de água ultrapura e adicione a solução de N-hidroxisuccinimida ao frasco por uma hora de incubação com agitação à temperatura ambiente. Em seguida, dialise o produto da reação em uma bolsa de diálise de corte de 1000 pesos moleculares por três dias, conforme demonstrado para obter nanopartículas de ouro revestidas com AS1411-g-Doxorrubicina-g-PEI-g-PEG.A espectroscopia de RMN de prótons pode ser usada para confirmar a síntese bem-sucedida do polímero CT-PEG e dos copolímeros PIE-g-PEG. A espectroscopia ultravioleta pode ser conduzida para determinar a funcionalização bem-sucedida e o carregamento gradual do copolímero preparado em nanopartículas de ouro. A espectroscopia eletrônica de fotos de raios-X pode ser usada para investigar a ligação química do copolímero em nanopartículas de ouro.O espalhamento dinâmico de luz pode ser realizado para determinar a distribuição de tamanho das nanopartículas preparadas. Nesta análise, a microscopia eletrônica de transmissão revelou nanopartículas não agrupadas com morfologia uniforme. A análise da viabilidade celular revelou uma diminuição no número de células A549 ao longo do tempo e em resposta ao aumento das concentrações de nanopartículas.Em comparação com o grupo doxorrubicina livre, o número de células aumentou, no entanto, indicando uma toxicidade reduzida. Além disso, a análise do perfil de liberação de doxorrubicina revela que a liberação sustentada de doxorrubicina de nanopartículas funcionalizadas causou uma diminuição nas células A549. A preparação do copolímero PEI-g-PEG e as etapas de enxerto AS1411 são importantes para o sucesso da implementação do procedimento.O mesmo transportador de medicamentos pode ser alcançado enxertando AS1411 antes de enxertar medicamentos, mas a eficiência de carregamento de medicamentos será diminuída.

synthesis-aptamer-pei-g-peg-modified-gold-nanoparticles-loaded-with

Research

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Chemistry

Química

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