Síntese de Nanopartículas de ouro modificada Aptamer-PEI-g-PEG carregadas com doxorubicina para entrega de drogas direcionadas

Devido à resistência e toxicidade dos medicamentos, o uso de doxorrubicina é limitado na clínica. Este protocolo fornece um transportador degradável para manter a liberação deste agente terapêutico. A vantagem desse método é que o transportador sintetizado pode ser usado para entregar o medicamento diretamente às células cancerígenas, induzindo a morte celular apenas nas células cancerígenas.

Para a síntese de CT-PEG, adicione primeiro 1,46 gramas de anidrido succínico e 209 miligramas de 4-dimetilaminopiridina a um balão de fundo redondo de 100 mililitros. Em seguida, adicionar 15 mililitros de tetra-hidrofurano anidro ao balão e colocar uma rolha de vidro no balão, antes de incubar a reacção durante 30 minutos a zero graus Celsius. Durante a incubação, adicionar 4,208 gramas de PEG, 1,8 mililitros de trietilamina e 15 mililitros de tetrahidrofurano anidro a um novo balão e fechar o balão com uma rolha de vidro.

No final da incubação, utilizar uma seringa sob atmosfera de azoto para transferir lentamente a segunda solução para o primeiro balão. Agitar a nova solução durante duas horas a zero graus Celsius, antes de continuar a reacção à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, use um evaporador rotativo a 40 graus Celsius e 0,1 megapascals para concentrar a solução de reação e remover o solvente tetrahidrofurano.

Após uma hora, dissolva a solução de reação em 15 mililitros de 1,325 grama por mililitro de diclorometano à temperatura ambiente, antes de adicionar 15 mililitros de éter dietílico frio para obter o produto de precipitação diácida PEG. Em seguida, remover o solvente através de papel de filtro e secar o precipitado sob vácuo durante 48 horas à temperatura ambiente. Para a síntese do copolímero PEI-g-PEG, adicione 305,47 miligramas do precipitado CT-PEG e cinco mililitros de DMSO a um novo frasco e agite a reação à temperatura ambiente até que o CT-PEG esteja totalmente dissolvido.

Em seguida, dissolver 49,46 miligramas de EDC em cinco mililitros de DMSO e adicionar a solução ao balão. Agitar a reacção durante 30 minutos à temperatura ambiente, antes de dissolver 29,69 miligramas de N-hidroxisuccinimida e cinco mililitros de DMSO e adicionar a solução resultante ao balão. Continue a mexer a reação por três horas em temperatura ambiente.

Perto do final da incubação, dissolver 28,6 microlitros de PEI em 10 mililitros de DMSO e adicionar a solução gota a gota ao frasco. Agite a reação em temperatura ambiente por pelo menos três dias. No final da incubação, transfira a solução reagida para uma bolsa de diálise com um corte de 1000 pesos moleculares e coloque a bolsa em um béquer de um litro contendo 500 mililitros de água ultrapura como dialisato.

No final da diálise, transfira a solução para uma bolsa de diálise com um corte de 10.000 pesos moleculares e coloque a bolsa em um béquer de um litro com 500 mililitros de água ultrapura como dialisado. No final da segunda diálise, use um evaporador rotativo a 40 graus Celsius e 0,1 megapascals para concentrar a solução e liofilizar a amostra para obter o pó de PEI-g-PEG. Para o revestimento de nanopartículas de ouro com o produto PEI-g-PEG, dissolva cinco miligramas do PEI-g-PEG preparado em cinco mililitros de água ultrapura em um novo frasco e encaixe o frasco com uma rolha de vidro.

Adicionar 100 mililitros de solução de cloreto áurico 0,3 milimolar ao balão e agitar a solução durante três horas à temperatura ambiente. As cores devem mudar imediatamente de amarelo claro para amarelo escuro. No final da incubação, adicionar ao balão um mililitro de um miligrama por mililitro de solução de boro-hidreto de sódio.

A cor deve mudar imediatamente de amarelo escuro para amarelo dourado e mexer a solução por mais três horas em temperatura ambiente. Em seguida, dialise o produto da reação com uma bolsa de diálise de corte de 1000 pesos moleculares por três dias, conforme demonstrado para obter a solução de nanopartículas de ouro revestida com PEI-g-PEG. Para enxertia de doxorrubicina nas nanopartículas de ouro revestidas com PEI-g-PEG.

Adicione um mililitro de 2,2 miligramas por mililitro de solução de doxorrubicina e 20 mililitros da solução de nanopartículas de ouro revestida com PEI-g-PEG a um novo frasco e encaixe o frasco com uma rolha de vidro. Em seguida, dissolver 0,727 miligramas de EDC num mililitro de água ultrapura e adicionar a solução de EDC ao balão. Dissolva 0,437 miligramas de N-hidroxisuccinimida em um mililitro de água ultrapura e adicione a solução de N-hidroxisuccinimida ao frasco por uma hora de incubação com agitação em temperatura ambiente.

No final da incubação, dialisar o produto da reação em uma bolsa de diálise de corte de 1000 pesos moleculares por três dias, conforme demonstrado para obter a solução de nanopartículas de ouro revestidas com doxorrubicina g-PEI-g-PEG. Para enxertia do aptâmero AS1411 no Adicione 20 mililitros da solução de nanopartículas de ouro revestidas com doxorrubicina DOX-g-PEI-g-PEG a uma concentração de aproximadamente quatro densidades ópticas de AS1411.

Dissolver 28,76 miligramas de EDC num mililitro de água ultrapura e adicionar a solução de EDC ao balão. Dissolva 17,27 miligramas de N-hidroxisuccinimida em um mililitro de água ultrapura e adicione a solução de N-hidroxisuccinimida ao frasco por uma hora de incubação com agitação à temperatura ambiente. Em seguida, dialise o produto da reação em uma bolsa de diálise de corte de 1000 pesos moleculares por três dias, conforme demonstrado para obter nanopartículas de ouro revestidas com AS1411-g-Doxorrubicina-g-PEI-g-PEG.

A espectroscopia de RMN de prótons pode ser usada para confirmar a síntese bem-sucedida do polímero CT-PEG e dos copolímeros PIE-g-PEG. A espectroscopia ultravioleta pode ser conduzida para determinar a funcionalização bem-sucedida e o carregamento gradual do copolímero preparado em nanopartículas de ouro. A espectroscopia eletrônica de fotos de raios-X pode ser usada para investigar a ligação química do copolímero em nanopartículas de ouro.

O espalhamento dinâmico de luz pode ser realizado para determinar a distribuição de tamanho das nanopartículas preparadas. Nesta análise, a microscopia eletrônica de transmissão revelou nanopartículas não agrupadas com morfologia uniforme. A análise da viabilidade celular revelou uma diminuição no número de células A549 ao longo do tempo e em resposta ao aumento das concentrações de nanopartículas.

Em comparação com o grupo doxorrubicina livre, o número de células aumentou, no entanto, indicando uma toxicidade reduzida. Além disso, a análise do perfil de liberação de doxorrubicina revela que a liberação sustentada de doxorrubicina de nanopartículas funcionalizadas causou uma diminuição nas células A549. A preparação do copolímero PEI-g-PEG e as etapas de enxerto AS1411 são importantes para o sucesso da implementação do procedimento.

O mesmo transportador de medicamentos pode ser alcançado enxertando AS1411 antes de enxertar medicamentos, mas a eficiência de carregamento de medicamentos será diminuída.