Name: Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a gerar organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando biorreatores de uso único. Este método escalável e reprodutível permite estudar desenvolvimento neural e doenças cerebelares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho contou com o apoio da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 através do Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Projeto Nº 007317, PD/BD/105773/2014 para T.P.S e PD/BD/128376/2017 para D.E.S.N.), projetos co-financiados pelo FEDER (POR Lisboa 2020 —Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 20 2020) e FCT através da concessão PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 e CEREBEX Geração de Organoides Cerebelares para Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. O financiamento também foi recebido do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia, sob o Acordo de Subvenção nº 739572 — O Centro de Descobertas para Medicina Regenerativa e de Precisão H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Passagem e manutenção de iPSCs humanos na cultura monocamadas
<ol><li>Preparação de placas<ol>
<li>Descongele a matriz de membrana do porão (ver Tabela de Materiais) estocar a 4 °C e preparar alíquotas de 60 μL. Congele as alíquotas a -20 °C.</li>
		<li>Para revestir os poços de uma placa de 6 poços, descongele uma alíquota da matriz de membrana do porão no gelo. Uma vez descongelado adicione 60 μL a 6 mL de DMEM-F12. Levemente resuspend por pipetting para cima e para baixo.</li>
		<li>Adicione 1 mL de solução de matriz de membrana de porão diluída a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar na RT por pelo menos 1 h antes de passar ou armazenar a 4 °C por até 1 semana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passagem de colônias iPSC com EDTA<ol>
<li>Mantenha iPSCs na cultura monocamadas em 6 placas de poço na incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2. NOTA: Neste protocolo, foram utilizadas três linhas iPSC humanas distintas: F002.1A.1321, linha iPSC episômica humana (iPSC6.2)22e obtida comercialmente iPS-DF6-9-9T.B (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Antes da passagem, incubar as placas armazenadas (etapa 1.1) em temperatura ambiente (RT) por 15 minutos e preparar o meio mTesR1(Tabela 1).</li>
		<li>Aspire a solução da placa usando uma pipeta sorológica e adicione imediatamente 0,5 mL de mTeSR1 médio a cada poço.</li>
		<li>Aspire o meio gasto do poço contendo iPSCs e lave uma vez usando 1 mL de 0,5 mM EDTA por poço.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 0,5 mM EDTA a cada poço e incubar na RT por 5 min.</li>
		<li>Aspire EDTA e remova as células dos poços adicionando suavemente mTeSR1 médio e pipetting as colônias usando uma micropipette P1000. Colete as células em um tubo cônico. NOTA: Não encoste as células para cima e para baixo mais de 3x.</li>
		<li>Adicione 1 mL de suspensão celular (diluído 1:4) a cada poço para que cada poço contenha 1,5 mL de meio após a suspensão da célula ser adicionada. Volte as células para a incubadora a 5% de CO2, 37 °C.</li>
		<li>Substitua o médio gasto diariamente e a cada 3 dias, quando 75%-80% de confluência é alcançada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Semeadura de iPSCs humanos no bioreator
<ol><li>Incubar iPSCs cultivados como monocamadas em mTeSR1 suplementados com 10 μM de inibidor de ROCHA Y-27632 (ROCKi). Adicione 1 mL de meio suplementado a cada poço a partir de uma placa de cultura de tecido de 6 poços e incubar por 1h a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2. NOTA: O ROCKi é usado para proteger iPSCs dissociados da apoptose23.</li>
	<li>Após 1h de incubação, aspire o meio gasto de cada poço e lave 1x com 1 mL de 1× PBS por poço.</li>
	<li>Adicione 1 mL do meio de desprendimento celular (ver Tabela de Materiais) a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C por 7 minutos até que as células se desprendem facilmente dos poços com suave agitação.</li>
	<li>Pipeta o desprendimento celular médio para cima e para baixo com uma micropipette P1000 até que as células se desprendem e dissociam em células únicas. Adicione 2 mL de cultura celular completa a cada poço para inativar a digestão enzimática e pipetar as células suavemente em um tubo cônico estéril.</li>
	<li>Centrífuga a 210 × g por 3 min e remova o supernaspe.</li>
	<li>Resuspenque a pelota celular em meio de cultura (ou seja, mTeSR1 suplementado com 10 μM de ROCKi) e conte os iPSCs com um hemócito usando corante azul trypan.</li>
	<li>Semente 15 × 106 células únicas no bioreator (volume máximo de 100 mL) com 60 mL de mTeSR1 suplementado com 10 μM de ROCKi a uma densidade celular final de 250.000 células/mL.</li>
	<li>Insira o vaso contendo os iPSCs na unidade base universal colocada na incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2. NOTA: A agitação do bioreator é mantida por 24 horas, definindo o controle universal da unidade base para 27 rpm para promover a agregação de iPSC.</li>
</ol>3. Diferenciação e maturação de agregados derivados do iPSC humanos em organoides cerebelares
<ol><li>Defina o dia da semeadura de células únicas como o dia 0.</li>
	<li>No primeiro dia, coletar 1 mL da amostra de agregados do iPSC utilizando uma pipeta sorológica. Mantenha o bioreator sob agitação como antes, colocando a unidade base universal com o bioreator contendo os agregados em um fluxo estéril antes da coleta da amostra. Aplaque a suspensão da célula em uma placa de 24 poços de fixação ultra-baixa. Verifique se os agregados derivados do iPSC são formados.</li>
	<li>Adquira imagens com um microscópio óptico usando uma ampliação total de 40x ou 100x para medir o diâmetro agregado.</li>
	<li>Meça a área dos agregados em cada imagem usando o software FIJI.<ol>
<li>Selecione "Analisar | Defina medidas" da barra de menu e clique em "Área" e "OK".</li>
		<li>Selecione "Arquivo | Abra" na barra de menu para abrir um arquivo de imagem armazenado. Selecione a ferramenta de seleção de linha apresentada na barra de ferramentas e crie uma linha reta sobre a barra de escala apresentada na imagem. Selecione "Analisar | Definir escala" a partir da barra de menu.</li>
		<li>Em "Distância conhecida"adicione a extensão da barra de escala da imagem em μm. Defina a "Unidade de comprimento" como μm. Clique em "Global" para manter as configurações e "OK". Selecione Seleção Oval na barra de ferramentas.</li>
		<li>Para cada agregado delineie a área com a ferramenta oval. Selecione "Analisar | Medida". Calcule seu diâmetro com base na área medida, considerando que os agregados são aproximadamente esféricos usando <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61143/61143equ01.jpg"> com A como área do agregado.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando o diâmetro médio dos agregados for de 100 μm, substitua 80% do meio gasto por mTeSR1 fresco sem ROCKi. Quando os agregados atingirem 200-250 μm de diâmetro, substitua todo o meio gasto por gfCDM (Tabela 1), permitindo que os organoides se instalem na parte inferior do bioreator. NOTA: Se o diâmetro agregado médio exceder 350 μm não iniciar o protocolo de diferenciação. Repita a semeadura de células únicas. Geralmente, leva cerca de 1 dia para o agregado atingir um diâmetro médio de 100 μm.</li>
	<li>Insira o bioreator contendo os agregados na unidade base universal colocada na incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.</li>
	<li>Diminua a agitação do bioreator para 25 rpm.</li>
	<li>No dia 2, repita as etapas 3.2, 3.3 e 3.4 para avaliar o diâmetro agregado. Adicione 30 μL de FGF2 (concentração final, 50 ng/mL) e 60 μL de SB431542 (concentração final, 10 μM) a 60 mL de meio de diferenciação gfCDM(Tabela 1). Substitua todo o meio gasto do bioreator pelo gfCDM suplementado. Repita o passo 3.6. NOTA: SB431542 é crucial para inibir a diferenciação mesemndodérmica, induzindo a diferenciação neural24. FGF2 é usado para promover a caudalização do tecido neuroepiteliol25.</li>
	<li>No dia 5, repetimos as etapas 3.2, 3.3, 3.4 e 3.8. NOTA: O tamanho agregado deve aumentar durante o protocolo de diferenciação. No entanto, o diâmetro só é crítico quando a diferenciação começa, pois esse parâmetro pode influenciar a eficácia da diferenciação.</li>
	<li>No dia 7, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Diluir FGF2 e SB431542 a 2/3: Adicionar 20 μL de FGF2 e 40 μL de SB431542 a 60 mL de meio de diferenciação gfCDM. Substitua todo o meio gasto do bioreator por gfCDM suplementado. Repita o passo 3.6 e aumente a agitação do bioreator para 30 rpm.</li>
	<li>No dia 14, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Adicione 60 μL de FGF19 (concentração final, 100 ng/mL) a 60 mL de meio de diferenciação gfCDM. Substitua todo o meio gasto do bioreator por gfCDM complementado com FGF19. Repita o passo 3.6. NOTA: O FGF19 é usado para promover a polarização das estruturas de cérebro médio26.</li>
	<li>No dia 18, repetimos as etapas 3.2, 3.3, 3.4 e 3.11.</li>
	<li>No dia 21, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Substitua todo o meio gasto do bioreator por meio neurobásal completo(Tabela 1). Repita o passo 3.6. NOTA: O meio neurobásal é um meio basal utilizado para manter a população celular neuronal dentro do organoide7.</li>
	<li>No dia 28, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Adicione 180 μL de SDF1 (concentração final, 300 ng/mL) a 60 mL de meio neurobásal completo. Substitua todo o meio gasto do bioreator por meio neurobásal completo complementado com SDF1. Repita o passo 3.6. NOTA: O SDF1 é usado para facilitar a organização de camadas celulares distintas27.</li>
	<li>No dia 35, repetimos as etapas 3.2, 3.3 e 3.4. Substitua todo o meio gasto do bioreator por meio brainphys completo(Tabela 1). Repita o passo 3.6. NOTA: BrainPhys é um meio neuronal que suporta neurônios sinapticamente ativos28.</li>
	<li>Substitua 1/3 do volume total a cada 3 dias por meio brainphys completo até o dia 90 de diferenciação.</li>
</ol>4. Preparação de organoides para criosectioning e imunohistoquímica
<ol><li>Coleta de organoides para imunossuagem<ol>
<li>Coletar 1 mL de amostra de organoides médios contendo uma pipeta sorológica do bioreator a um tubo cônico de 15 mL. NOTA: Os organoides devem ser coletados em diferentes momentos para avaliar a eficácia da diferenciação, incluindo os dias 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 e 90.</li>
		<li>Retire o supernatante e lave uma vez com 1 mL de 1× PBS. NOTA: Não centrifugar os organoides. Deixe os organoides se estabelecerem na parte inferior do tubo pela gravidade.</li>
		<li>Remova o supernasce e adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído (PFA). Incubar a 4 °C por 30 min. Remova o PFA gasto e adicione 1 mL de 1× PBS.</li>
		<li>Armazene os organoides em 1 mL de 1× PBS a 4 °C até o processamento para criosectioning. NOTA: Armazene os organoides em 1x PBS por no máximo 1 semana após a fixação.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de organoides para criosectioning<ol>
<li>Remova o supernatante dos organoides armazenados. Adicione 1 mL de sacarose de 15% (w/v, diluída em 1× PBS), misture bem por um giro suave e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Prepare uma solução de 15% de sacarose/7,5% de gelatina(Tabela 2) e mantenha a 37 °C durante a preparação para evitar que a gelatina se solidifique.</li>
		<li>Retire a solução de 15% de sacarose, adicione 1 mL de 15% de sacarose/7,5% de gelatina aos organoides e misture rapidamente por redemoinho suave. Incubar a 37 °C por 1 h.</li>
		<li>Adicione 15% de solução de sacarose/7,5% de gelatina a um recipiente plástico até a metade do seu volume. Aguarde a solidificação na RT.</li>
		<li>Após uma incubação de 1 h, coloque cuidadosamente uma gota de sacarose/gelatina contendo os organoides na gelatina solidificada com uma pipeta Pasteur. Deixe solidificar na RT por cerca de 15 minutos. Certifique-se de evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Coloque 15% de sacarose/7,5% de gelatina em cima dos organoides até que o recipiente esteja cheio. Aguarde a solidificação completa na RT.</li>
		<li>Após a solidificação, incubar 20 min a 4 °C.</li>
		<li>Corte a gelatina em um cubo contendo os organoides no centro e fixe o cubo de gelatina em um pedaço de papelão com uma gota de composto O.C.T.</li>
		<li>Coloque 250 mL de isopentane em um copo de 500 mL e encha um recipiente apropriado com nitrogênio líquido. Usando fórceps e luvas grossas, coloque cuidadosamente o copo contendo isopentane na superfície do nitrogênio líquido e esfrie a isopine a -80 °C.</li>
		<li>Quando -80 °C for atingido, coloque o cubo de gelatina no copo contendo isopentane até congelar, mantendo a temperatura em -80 °C. Dependendo do tamanho do cubo, pode levar de 1 a 2 min. NOTA: Evite temperaturas abaixo de -80 °C ou tempo de congelamento excessivo, pois pode causar rachaduras no cubo.</li>
		<li>Quando congelado, armazene rapidamente o cubo de gelatina a -80 °C e armazene até que a criosectioning.</li>
	</ol></li>
	<li>Criosectioning de organoides<ol>
<li>Ligue o criostat e defina as temperaturas de espécime (OT) e criocâmara (TC) a -25 °C.</li>
		<li>Quando ambas as temperaturas estabilizarem, fixe o cubo de gelatina contendo os organoides na amostra usando composto O.C.T.</li>
		<li>Defina a espessura da seção a 12 μm.</li>
		<li>Corte o cubo e colete 3-4 fatias em slides de microscópio de adesão (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Armazenar a -20 °C até usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunostaining de fatias organoides<ol>
<li>Coloque os slides do microscópio contendo seções organoides em um frasco de copling com 50 mL de PBS 1x pré-armado, segurando até 10 slides de costas para trás. NOTA: Todas as seções organoides devem ser submersas com líquido.</li>
		<li>Incubar por 45 min a 37 °C para degelatinizar slides.</li>
		<li>Lave 1x com 50 mL de 1× PBS por 5 min na RT: Transfira os slides para um frasco de copling contendo PBS fresco de 1×.</li>
		<li>Transfira os slides para um frasco de copling contendo 50 mL de glicina recém-preparada(Tabela 2) e incubar por 10 minutos na RT.</li>
		<li>Transfira os slides para um frasco de copling contendo 50 mL de triton de 0,1%(Tabela 2) e permeabilize por 10 min na RT.</li>
		<li>Lave com 1× PBS por 5 min 2x.</li>
		<li>Prepare o prato de imunostaining com papel 3 mm embebido em PBS de 1×. Seque lâminas com um tecido ao redor das fatias e coloque-as em papel de 3 mm. Com uma pipeta Pasteur, cubra toda a superfície dos slides com solução de bloqueio(Tabela 2) com ~0,5 mL por slide. Incubar por 30 min na RT.</li>
		<li>Remova a solução de bloqueio em excesso e seque as lâminas com um tecido ao redor das fatias. Coloque 50 μL do anticorpo primário(Tabela 3) diluído na solução de bloqueio sobre as seções e cubra com as tampas. Coloque as fatias em um prato de imunostaining previamente preparado. Incubar durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Transfira os slides para um frasco de copling com 50 mL de TBST (Tabela 2),deixe as tampas caírem e lave com TBST por 5 min 3x.</li>
		<li>Coloque 50 μL do anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio sobre as seções e cubra com as tampas. Coloque as fatias no prato de imunostaining previamente preparado. Incubar por 30 min no RT, protegido da luz.</li>
		<li>Transfira os slides para um frasco de copling novamente e lave com 50 mL de TBST por 5 min 3x.</li>
		<li>Seque as lâminas com um tecido ao redor das fatias e coloque as fatias em um prato de imunossuagem previamente preparado. Adicione 0,5 mL de solução DAPI sobre toda a superfície dos slides com uma pipeta Pasteur. Incubar por 5 min na RT.</li>
		<li>Repita o passo 4.4.9.</li>
		<li>Seque cuidadosamente as lâminas com um tecido. Adicione 50 μL de montagem média gota por gota ao longo do slide e, em seguida, abaixe cuidadosamente uma mancha de cobertura em cada slide, dobrando-a ligeiramente para evitar bolhas.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li>
<li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li>
<li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA%2F+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li>
<li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li>
<li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li>
<li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li>
<li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cerebellum%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232(2015).</li>
<li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li>
<li>Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Single-Use+Bioreactors+for+Scale-Up+of+Anchorage-Dependent+Cell+Manufacturing+for+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies.</a> Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).</li>
<li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoids%2C+organoids+and+gastruloids%3A+new+approaches+to+understanding+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li>
<li>Lou, Y. R., Leung, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li>
<li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li>
<li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293(2011).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Activin%2FNodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li>
<li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li>
<li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li>
<li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li>
<li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li>
<li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li>
<li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li>
<li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li>
<li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li>
<li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li>
</ol>

Os autores YH e SJ são funcionários da PBS Biotech. O autor BL é CEO e co-fundador da PBS Biotech, Inc. Esses autores colaboradores participaram do desenvolvimento dos bioreatores utilizados no manuscrito. Isso não altera a adesão dos autores a todas as políticas da revista sobre o compartilhamento de dados e materiais. Todos os outros autores não declaram conflito de interesses.

A necessidade de grandes números de células, bem como condições de cultura definidas para gerar tipos de células específicas para triagem de medicamentos e aplicações de medicamentos regenerativos tem impulsionado o desenvolvimento de sistemas de cultura escalável. Nos últimos anos, vários grupos relataram a geração escalável de progenitores neurais e neurônios funcionais32,,33,34, proporcionando avanços significativos no desenv...

O surgimento de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) representa uma excelente ferramenta para a medicina regenerativa e modelagem de doenças, pois essas células podem ser diferenciadas na maioria das linhagens celulares do corpo humano1,,2. Desde sua descoberta, a diferenciação do PSC utilizando diversas abordagens tem sido relatada para modelar diferentes doenças, incluindo distúrbios neurodegenerativos3,,4,5,6.
Recentemente, houve relatos de culturas 3D derivadas de PSCs semelhantes a estruturas cerebrais humanas; estes são chamados organoides cerebrais3,,7,,8. A geração dessas estruturas a partir de PSCs saudáveis e específicos para o paciente fornece uma oportunidade valiosa para modelar o desenvolvimento humano e distúrbios neurodesenvolvimentos. No entanto, os métodos utilizados para gerar essas estruturas cerebrais bem organizadas são difíceis de aplicar para sua produção em larga escala. Para produzir estruturas grandes o suficiente para recapitular a morfogênese tecidual sem necrose dentro dos organoides, os protocolos contam com o compromisso neural inicial em condições estáticas, seguido pelo encapsulamento em hidrogéis e cultura subsequente em sistemas dinâmicos3. No entanto, tais abordagens podem limitar a potencial escala da produção organoide. Embora tenham sido feitos esforços para direcionar a diferenciação do PSC para regiões específicas do sistema nervoso central, incluindo neurônios cortical, estriatal, midbrain e medula espinhal9,10,,11,12, a geração de regiões cerebrais específicas em condições dinâmicas ainda é um desafio. Em particular, a geração de neurônios cerebelares maduros em estruturas 3D ainda não foi descrita. Muguruma et al. foram pioneiros na geração de condições culturais que recapitulam o desenvolvimento cerebelar precoce13 e recentemente relataram um protocolo que permite que células-tronco embrionárias humanas gerem uma estrutura polarizada que lembra o cerebelo do primeiro trimestre7. No entanto, o amadurecimento dos neurônios cerebelares nos estudos relatados requer a dissociação dos organoides, a classificação de progenitores cerebelares e a cocultura com células alimentadoras em um sistema de cultura monocamada7,,14,,15,,16. Portanto, a geração reprodutível dos organoides cerebelares desejados para modelagem de doenças em condições definidas ainda é um desafio associado à cultura e à variabilidade da fonte alimentador.
Este protocolo apresenta condições ideais de cultura para expansão 3D e diferenciação eficiente de PSCs humanos em neurônios cerebelares usando bioreatores de roda vertical de uso único (ver Tabela de Materiais para especificações), a partir de agora chamados bioreatores. Os bioreatores são equipados com um grande propulsor vertical, que em combinação com um fundo em forma de U, fornecem uma distribuição mais homogênea de tesoura dentro do vaso, permitindo uma mistura suave, uniforme e suspensão de partículas com velocidades de agitação reduzidas17. Com este sistema, podem ser obtidos agregados celulares controlados por tamanho e tamanho, o que é importante para uma diferenciação mais homogênea e eficiente. Além disso, um número maior de organoides derivados do iPSC pode ser gerado de forma menos trabalhosa.
A principal característica dos organoides, que são estruturas multicelulares 3D geralmente formadas a partir de células-tronco, é a auto-organização de diferentes tipos de células que formam formas específicas como as vistas na morfogênese humana18,,19,,20. Portanto, a morfologia organoide é um critério importante a ser avaliado durante o processo de diferenciação. A crioseção de organoides e a imunostenção de fatias organoides com um conjunto específico de anticorpos permitem a visualização espacial de marcadores moleculares para analisar a proliferação celular, diferenciação, identidade populacional celular e apoptose. Com este protocolo, por meio de crioseções organoides imunossumunas, observa-se um compromisso neural inicial eficiente pelo7º dia de diferenciação. Durante a diferenciação, são observadas diversas populações celulares com identidade cerebelar. Após 35 dias neste sistema dinâmico, o neuroepithelium cerebelar organiza-se ao longo de um eixo apicobasal, com uma camada apical de progenitores proliferadores e neurônios pós-metóticos localizados basicamente. Durante o processo de maturação, dos dias 35 a 90 de diferenciação, podem ser vistos tipos distintos de neurônios cerebelares, incluindo células Purkinje (Calbindin+), células de grânulo (PAX6+/MAP2+), células Golgi (Neurogranin+), células de escova unipolar (TBR2+), e neurônios de projeção de núcleos cerebelares profundos (TBR1+). Além disso, uma quantidade não significativa de morte celular é observada nos organoides cerebelares gerados após 90 dias na cultura.
Neste sistema, organoides derivados do iPSC humano amadurecem em diferentes neurônios cerebelares e sobrevivem por até 3 meses sem a necessidade de dissociação e cocultura alimentador, fornecendo uma fonte de neurônios cerebelares humanos para modelagem de doenças.

<table><tbody><tr><td>papel de 3MM</td><td>WHA3030861</td><td>Merck</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>A6964 -</td><td>meio do desprendimento da pilha</td><td>de 500mL Sigma</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-BARHL1 Anticorpo</td><td>HPA004809</td><td>Atlas Anticorpos</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindina D-28k Anticorpo</td><td>CB28</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr>Anticorpo <td>M4403</td><td>Sigma</td><td></td><td>Anti-N-Caderina</td></tr><tr><td></td><td>610921</td> anticorpo anti-NESTIN <td>de transdução</td><td></td>BD</tr><tr><td></td><td>MAB1259-SP</td><td>R& D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-OLIG2 Anticorpo</td><td>MABN50</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX6</td><td>PRB-278P</td><td>Anticorpo Covance</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>MAB2018</td><td>R& D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TBR1</td><td>AB2261</td><td>Anticorpo</td> anti-TBR2 Millipore <td></td></tr><tr><td></td><td>ab183991</td><td>Anticorpo Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>801213</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>T1147</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>BrainPhys Meio neuronal N2-A & SM1 Kit</td><td>5793 - 500mL</td><td>Tecnologias de células estaminais</td> Concentrado lipídico <td></td></tr><tr><td>quimicamente definido</td><td>11905031</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24x60mm</td><td>631-1575</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr>BSA <td>5470</td><td>purificado</td> por<td>cristalização Sigma</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>10236276001</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Dibutyryl cAMP</td><td>SC- 201567B -500mg</td><td>Frilabo</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>32500-035</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>A3840001</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele bovina</td><td>G9391</td> Frasco de vidro <td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>E94</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I</td><td>10566-016</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MB014001</td><td>Presunto NZYtech</td><td></td></tr><tr><td>' s F12</td><td>21765029</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Human Episomal iPSC Line</td><td>A18945</td><td>ThermoFisher</td><td>iPSC6.2</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>12440046</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>91077C</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>iPS DF6-9-9T. B</td><td></td><td>WiCell</td><td></td></tr><tr><td>Iso-pentano</td><td>PHR1661-2ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>A-92902</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>354230</td><td>Matriz de membrana basal</td><td>Corning</td></tr><tr><td>Monotioglicerol</td><td>M6154</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>475904</td><td>Meio de montagem</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>85850 -500ml</td> Tecnologias <td></td><td>de células-tronco</td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>17502048</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>12348017</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>158127</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>PBS-0.1 Recipiente de uso único</td><td>SKU: IA-0.1-D-001</td><td>PBS Biotech</td><td></td></tr><tr><td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td><td>SKU: IA-UNI-B-501</td><td>PBS Humano</td><td></td></tr><tr><td>recombinante BDNF</td><td>450-02</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante bFGF/FGF2</td><td>100-18B</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante FGF19</td><td>100-32</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante GDNF</td><td>450-10</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante SDF1</td><td>300-28A</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inibidor Y-27632</td><td>72302</td> Tecnologias <td></td><td>de células-tronco</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>S4317</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>S7903</td> Lâminas de microscópio <td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost</td><td>12372098</td><td>lâminas de microscópio de adesão</td><td>ThermoFisher</td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>25608-930</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL 1M</td><td>T3038-1L</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>9002-93-1</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>P1379</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>15575020</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr></tbody></table>

geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

O cerebelo desempenha um papel crítico na manutenção do equilíbrio e coordenação motora, e um defeito funcional em diferentes neurônios cerebelares pode desencadear disfunção cerebelar. A maior parte do conhecimento atual sobre fenótipos neuronais relacionados à doença é baseado em tecidos pós-morte, o que dificulta a compreensão da progressão e desenvolvimento da doença. Modelos animais e linhas celulares imortalizadas também têm sido usados como modelos para distúrbios neurodegenerativos. No entanto, eles não recapitulam totalmente a doença humana. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) têm grande potencial para modelagem de doenças e fornecem uma fonte valiosa para abordagens regenerativas. Nos últimos anos, a geração de organoides cerebrais a partir de iPSCs derivados do paciente melhorou as perspectivas de modelagem de doenças neurodegenerativas. No entanto, faltam protocolos que produzam um grande número de organoides e um alto rendimento de neurônios maduros em sistemas de cultura 3D. O protocolo apresentado é uma nova abordagem para a geração reprodutível e escalável de organoides derivados do iPSC humanos em condições quimicamente definidas usando bioreatores escaláveis de uso único, nos quais os organoides adquirem identidade cerebelar. Os organoides gerados são caracterizados pela expressão de marcadores específicos tanto no nível mRNA quanto no nível da proteína. A análise de grupos específicos de proteínas permite a detecção de diferentes populações de células cerebelares, cuja localização é importante para a avaliação da estrutura organoide. Criosectioning organoide e imunostaining de fatias organoides são usados para avaliar a presença de populações específicas de células cerebelares e sua organização espacial.

O protocolo foi iniciado pela promoção da agregação celular utilizando os bioreatores 0,1 L (Figura 1A). Foi realizada a inoculação de célula única dos iPSCs, com 250.000 células/mL semeadas em 60 mL de médio com velocidade de agitação de 27 rpm. Isso foi definido como o dia 0. Após 24 h, as células formaram eficientemente agregados em forma de esfóide (dia 1, Figura 1B), e a morfologia foi bem mantida até o dia 5, com um aumento gradual de tamanho, demonstrando...

Este protocolo descreve um sistema de cultura dinâmica para produzir agregados de tamanho controlado de células-tronco pluripotentes humanas e estimular ainda mais a diferenciação em organoides cerebelares sob condições quimicamente definidas e livres de alimentadores usando um bioreator de uso único.

Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Apresentamos pela primeira vez, uma nova abordagem para geração reprodutível e escalável, de células IPS derivadas de Organoides Cerebelares, e condições químicas definidas, utilizando bioreatores de uso único. Para obter células para semear o bio-reator, adicione um mililitro de meio de desprendimento celular, a cada poço de uma placa de seis poços de iPSC humanos. Incubar a placa a 37 graus Celsius por sete minutos, até que o tremor suave se desprende facilmente das células, do poço.Usando uma micropipette P 1000, in pipeta o meio de descolamento celular, para cima e para baixo, até que as células se dissociem em células únicas. Em seguida, adicione dois mililitros, de cultura celular completa ao cada poço, isso irá inativar a digestão enzimática. Em seguida, use a pipeta, para transferir suavemente as células para um tubo cônico estéril.Centrifugar o tubo a 210 vezes a gravidade por três minutos. Remova o supernasce e suspenda a pelota celular no meio da cultura. Conte as células usando um hemócito, e tinga azul trypan.Veja o vaso bioreator com iPSC's, a uma densidade de 250.000 células por mililitro. Insira o vaso bioreator, na Unidade Base Universal, em uma incubadora a 37 graus Celsius, 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono. Para promover a agregação do iPSC, defina a taxa de agitação da Unidade de Controle base para 27 RPM.No primeiro dia, sendo o dia zero o dia da semeadura do bioreator, coloque o bioreator e a Unidade Base em uma coifa de fluxo estéril, em seguida, use uma pipeta sorológica, para coletar uma amostra de um mililitro, da suspensão celular. Aplaque a suspensão da célula em um acessório ultra baixo, placa de 24 poços. Use um microscópio, para confirmar que os agregados derivados do iPSC se formaram.Se assim for, capture imagens dos agregados em 40 X ou 100 X.Continue culminando os iPSC's e o bioreator, até que o diâmetro médio dos agregados, seja de 100 micrômetros, depois substitua 80% do meio, por MT01 fresco sem inibidor de rocha. Quando os agregados, atingirem de 200 a 250 mímetros de diâmetro, deixe que todos os organoides se instalem, na parte inferior do bioreator, substitua todo o meio gasto, por meio de diferenciação gfCDM. Coloque a unidade base e o bioreator na incubadora e diminua a agitação para 25 RPM.Depois de remover o supernazio dos organoides armazenados, adicione um mililitro de 15% de sacarose à pelota, e misture bem girando suavemente. Depois de incubar os organoides durante a noite, a quatro graus Celsius, remova a solução de sacarose, em seguida, adicione um mililitro de 15%, 7,5% de gelatina, e misture rapidamente girando suavemente. Enquanto os organoides estão incubando a 37 graus Celsius encher um recipiente plástico no meio do caminho com a solução de 15% de sacarose 7,5% de gelatina, e permitir que ele se solidifique.Depois que os organoides tiverem sido incubados por uma hora, use uma pipeta Pasteur, para colocar uma gota da mistura de gelatina organoide de sacarose, em cima da sacarose solidificada e gelatina. Depois de esperar 15 minutos para que a gota se solidifique, encha o restante do recipiente plástico, com mais 15% de sacarose, 7,5%, permita solidificar completamente à temperatura ambiente e, em seguida, incuba-lo por 20 minutos a quatro graus Celsius. Corte a gelatina em um cubo, com os organoides no centro, fixe o cubo em um pedaço de papelão, com uma gota de composto OCT, em seguida, colocado 250 mililitros de Isopentane, em um copo de 500 mililitros, encha um recipiente apropriado, com nitrogênio líquido.Usando fórceps e luvas grossas, coloque cuidadosamente a xícara de Isopentane, na superfície do nitrogênio líquido. Isotoentano e nitrogênios líquidos são reagentes perigosos. O uso desses dois reagentes requer equipamentos de proteção individual, incluindo luvas grossas e ventilação adequada.Quando o Isopentane, esfriar para 80 graus Celsius negativos, coloque o cubo de gelatina no Isopentane até congelar. Um cubo bem congelado, produz um som metálico quando levemente tocado com fórceps, indicando que está pronto para ser armazenado. Lave os slides do microscópio contendo as seções organoides, com 50 mililitros 1X PBS por cinco minutos, depois transfira os slides para um frasco de Coplin, contendo PBS 1X fresco.Transfira os slides para um frasco de Coplin, contendo 50 mililitros de glicina recém-preparada e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente, em seguida, transfira os slides para um frasco de Coplin, contendo 50 mililitros de 0,1% Triton, e permeabilizado por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave os slides duas vezes com 1X PBS, por cinco minutos cada vez. Prepare o prato de imunostaining, com papel de três milímetros, embebido em 1X PBS.Seque as lâminas com um tecido ao redor das fatias e coloque-as no papel de três milímetros. Com uma pipeta Pasteur, cubra cada slide com 0,5 mililitros de solução de bloqueio. Depois de incubar por 30 minutos à temperatura ambiente, remova a solução de bloqueio em excesso e dirija os slides com um tecido, ao redor das fatias.Coloque 50 microliters de anticorpo primário diluído, em cada slide e cubra-os com deslizamentos de cobertura. Amarre os slides, no prato de imunostaining previamente preparado, e incuba-os a quatro graus Celsius. Após a incubação durante a noite, transfira os slides para um frasco de Coplin, com 50 mililitros de TBST, deixando os deslizamentos de cobertura caírem, depois lave os slides três vezes com TBST, por cinco minutos cada vez.Coloque 50 microliters, de anticorpo secundário diluído em cada slide, e cubra com os deslizamentos de cobertura. Coloque os slides, no prato de imunostaining previamente preparado, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Transfira os slides para um frasco Coplin novamente, e lave-os três vezes com 50 mililitros de TBST, por cinco minutos cada vez.Usando uma Pipeta Pasteur, a 0,5 mililitros de solução dappy, sobre toda a superfície de cada slide e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Após 24 horas no bioreator, os agregados em forma de esferoide eficientemente formados pelo iPSC. A morfologia foi bem mantida até o quinto dia, com um aumento gradual no tamanho.Demonstrando um alto grau de homogeneidade. Uma análise quantitativa por microscopia, também revelou distribuição normal, de tamanhos agregados até o primeiro dia, e ambas as linhas celulares atingiram o tamanho agregado ideal até o segundo dia. Após a alcançado a desejada diâmetro agregado, o compromisso neural foi induzido e, em seguida, a geração de diferentes progenitores cerebelares foi promovida.Durante a diferenciação, os organoides apresentaram uma epitelialização mais pronunciada semelhante às estruturas semelhantes a tubos neurais com espaço luminal. Além disso, a distribuição do diâmetro organoide foi homogênea durante o compromisso cerebelar inicial até o dia 14. A análise da imunofluorescência sustenta que um compromisso neural eficiente, dos organoides derivados do iPSC, já é alcançado, no sétimo dia de diferenciação.A imunostaining também demonstrou, o comprometimento cerebelar eficiente e a maturação eficiente dos organoides cerebelares. Além disso, após 80 dias no bioreator, a coloração morta viva de organoides mostrou alta viabilidade celular, e nenhuma evidência de áreas necrosas. Esta técnica representa uma importante ferramenta, para o estudo de vias patológicas, envolvida na degeneração do cerebelar observado e para avaliar o efeito terapêutico de novas drogas.

scalable-generation-mature-cerebellar-organoids-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um biorreator 3D de uso único. O biorreator facilita a formação de agregados iPSC, que então passam por tratamento com uma série de meios de cultura enriquecidos em fatores de crescimento e quimiocinas que induzem a diferenciação dos agregados iPSC em organoides cerebelares maduros. Posteriormente, os organoides são colhidos e criopreservados para análise...

Geração de organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas usando biorreatores de uso único

Este vídeo demonstra um protocolo para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em progenitores cerebelares. Envolve a transferência de colônias de células-tronco para uma placa de fixação ultrabaixa para formar corpos embrióides, promovendo a diferenciação com fatores de crescimento e, em seguida, transferindo os corpos embrióides para uma placa revestida com matriz para adesão. As etapas subsequentes envolvem a indução da migração celular e a adição de um meio de...

Uma técnica para gerar uma monocamada 2D de células cerebelares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas

Este vídeo demonstra a transformação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em organoides cerebrais esféricos. Usando inibidores específicos, as hPSCs são guiadas para se diferenciar em direção a uma linhagem neuronal, formando colônias neuroectodérmicas. Fatores especiais de crescimento são então introduzidos, o que estimula a auto-organização e proliferação das colônias, levando à formação de organoides cerebrais esféricos.

Geração de esferoides a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de fatias organoides cerebelares para identificar antígenos-alvo específicos expressos em vários neurônios cerebelares, que são indicativos de maturação organoide.

Imunomarcação de fluorescência de fatias organoides cerebelares

A modelagem do desenvolvimento do cérebro humano foi prejudicada devido à complexidade sem precedentes do tecido epitelial neural. Aqui, é descrito um método para a geração robusta de organoides cerebrais para delinear eventos iniciais do desenvolvimento do cérebro humano e modelar a microcefalia in vitro.

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

Organoids cerebrais representam um novo sistema de modelo para investigar mais cedo cérebro humano desenvolvimento em vitro. Este artigo fornece a metodologia detalhada para gerar eficientemente organoids dorsal homogênea do prosencéfalo-tipo de células-tronco pluripotentes induzidas humano incluindo passos críticos de caracterização e validação.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Neste estudo, fornecemos uma técnica detalhada para um sistema de cultura organoide cortical simples, mas robusto, usando culturas hPSC padrão sem alimentador. Este é um protocolo rápido, eficiente e reprodutível para gerar organoides que modelam aspectos da senescência cerebral in vitro.

Geração robusta e altamente reprodutível de organoides cerebrais corticais para modelar senescência neuronal cerebral in vitro

O presente protocolo explica a geração de uma monocamada 2D de células cerebelares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas para investigar os estágios iniciais do desenvolvimento cerebelar.

Modelagem do Desenvolvimento Cerebelar Humano In Vitro em Estrutura 2D

O presente protocolo fornece um procedimento passo a passo para a geração, manutenção e envelhecimento reprodutíveis de organoides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Este método permite cultivar e amadurecer organoides cerebrais por longos períodos, o que facilita a modelagem dos processos envolvidos no envelhecimento cerebral e na patogênese relacionada à idade.

Fabricação robusta de tecidos para cultura de longo prazo de organoides cerebrais derivados de iPSC para pesquisa de envelhecimento

Aprenda a gerar organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando biorreatores de uso único. Este método escalável e reprodutível permite estudar desenvolvimento neural e doenças cerebelares.

Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

Explorar mais vídeos