Name: Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a detectar cílios primários em fibroblastos por imunofluorescência para biologia celular. Este método confiável utiliza microscopia confocal para visualizar estruturas essenciais à sinalização celular e estudo de distúrbios associados.

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Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Defesa da República Tcheca - Plano de desenvolvimento de organizações de longo prazo Aspectos Médicos de Armas de Destruição Em Massa da Faculdade de Ciências da Saúde Militar da Universidade de Defesa; o Ministério da Educação, Juventude e Esporte, República Tcheca (Projeto de Pesquisa Específica Nº: SV/ FVZ201703) e PROGRES Q40/06. Obrigado também a Daniel Diaz por sua gentil assistência na revisão da língua inglesa.

1. Preparação de meios culturais, soluções e pratos
<ol><li>Autoclave as tampas (22 x 22 mm). Prepare 6 placas de poço. Descongele o soro bovino fetal (FBS) e a penicilina/estreptomicina antibiótico e aqueça a cultura temperatura média a ambiente (TR). Use trypsin-EDTA (0,25%) e 1x PBS (salina tamponada com cálcio e magnésio) para passagem das células.</li>
	<li>Prepare fresco 4% paraformaldeído (PFA) em dH2O (800 mgs de PFA em 20 mL de dH2O). O PFA deve estar preparado para cada experimento. Mexa e aqueça a solução a 55 °C por 30 min no capô. Esfrie na RT. Adicione 1 M de hidróxido de sódio até que a solução fique clara (pH = 7,2-7,4). Guarde a 4 °C por até 1 semana. Nota: PFA é tóxico; use sempre equipamentos de proteção individual adequados e prepare-se na capa química.</li>
	<li>Prepare 500 mL de mídia cultural, DMEM (meio da Águia Modificada de Dulbecco) contendo 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 2% glutamina.</li>
	<li>Prepare 13 mL de solução de gelatina de 1% em dH2O (130 mg de gelatina em 13 mL de dH2O). Use 2 mL de gelatina de 1% para cada poço em uma placa de 6 poços. Mantenha-se estéril.</li>
	<li>Limpe a capa de fluxo laminar usando 70% de etanol. Coloque o material necessário dentro do capô de fluxo laminar antes de iniciar o experimento.</li>
</ol>2. Cultura celular para coloração imunocitoquímica
<ol><li>Descongele as células (neste estudo C2C12, MEF, NHLF e fibroblastos de pele) usando técnicas padrão e as emplaque em um frasco T75 complementado com ~10-12 mL da mídia preparada. Incubar a 37 °C/5% de CO2/90% de umidade relativa (RH) até que as células atinjam 70% de confluência.</li>
	<li>Remova as células da incubadora e coloque-as na coifa de fluxo laminar. Remova a mídia de cultura e enxágue as células brevemente 2x com 1x PBS. Adicione ~2 mL de 0,25% trypsin-EDTA no frasco T75 e incubar a 37 °C por ~5 min. Verifique periodicamente o microscópio invertido para monitorar o descolamento celular. NOTA: O tempo de incubação depende da linha celular e, portanto, deve ser determinado empiricamente.</li>
	<li>Resuspenque suavemente as células em 10 mL de mídia cultural, pipetting cuidadosamente para criar uma única suspensão celular. Enxágüe o frasco novamente, se necessário.</li>
	<li>Coloque a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e centrífuga por 5 min a ~200 x g. Decante o supernatante, adicione 10 mL de mídia cultural, e levemente resuspenque a pelota. Pegue 20 μL da suspensão celular e misture em uma proporção de 1:1 com azul trypan e conte em um citômetro seguindo o método padrão.</li>
	<li>Coloque uma mancha de cobertura dentro de cada poço de uma placa de 6 poços usando pinças. Cubra as tampas com gelatina despejando ~2 mL nos poços. Isso ajudará as células a se anexarem às tampas. Retire a solução de gelatina e deixe secar o ar por alguns minutos. As tampas estão prontas para o cultivo das células. Comece o cultivo imediatamente.</li>
	<li>Semente 100.000 fibroblastos em cada poço e adicione 2 mL de mídia cultural. Incubar as células por 24 h a 37 °C/5% DE CO2/90% RH. Neste ponto, as células podem ser tratadas de acordo com as necessidades do usuário. Os tratamentos para induzir a ciliação foram descritos anteriormente4,5. NOTA: O número inicial de semeadura depende do tempo de duplicação das células e deve ser determinado em conformidade.</li>
</ol>3. Mancha imunofluorescente de cílio primário in vitro
<ol><li>Aqueça o paraformaldeído de 4% para RT. Prepare as pipetas pasteur, 1x PBS (RT), recipiente de resíduos, tubos cônicos de 15 mL, micropipettos (0,5-10 μL, 20-200 μL e 100-1.000 μL) e pontas. Pegue as células da incubadora e coloque-as no banco. NOTA: O procedimento de coloração não precisa ser realizado em condições estéreis. Todas as soluções devem estar na RT.</li>
	<li>Remova a mídia de cada poço. Deixe a tampa dentro do poço. Lave delicadamente as células 3x com 2 mL de 1x PBS. Usando uma pipeta Pasteur, adicione 2 mL de 4% pfa em cada poço para corrigir as células. Incubar por 10 min no RT. Remova o PFA e lave 3x com 1x PBS. NOTA: Use sempre um volume suficiente para cobrir toda a mancha durante os períodos de incubação. Nunca deixe as células secarem. Nunca despeje nenhuma das soluções diretamente no deslizamento de tampas.</li>
	<li>Prepare 0,5% Triton X-100 em 13 mL de 1x PBS 10 min antes de usar. Adicione 2 mL em cada poço. Incubar por 15 minutos. Lave suavemente 4x com 1x PBS. NOTA: Triton X-100 é insolúvel em PBS na RT. Aqueça a solução Triton X-100 de 0,5% a 37 °C em um banho de água para dissolvê-la.</li>
	<li>Descongele o soro de cabra 5 min antes do uso. Diluir o soro de cabra em 1x PBS em uma razão de 1:20 como uma solução de bloqueio. Adicione 150 μL a cada deslizamento de cobertura e incubar por 20 minutos na RT. NOTA: Prolongar o período de bloqueio até 60 min, se necessário. Não lave as células depois de bloquear com soro de cabra.</li>
	<li>Descongele os anticorpos primários (ou seja, tubulina alfa anti-acetilada e tubulina anti-gama) 5 minutos antes do uso. Diluir os anticorpos separadamente em 1x PBS da seguinte forma: tubulina alfa anti-acetilada do rato em uma proporção de 1:800 e tubulina anti-gama de coelho em uma proporção de 1:300. Remova a solução de bloqueio. Não lave. Adicione 150 μL de ambas as diluições de anticorpos às tampas e incubar por 60 min na RT. NOTA: Se a incubação durante a noite usar 500-1.000 μL das soluções primárias de anticorpos, sele a placa de 6 poços com filme de parafina e armazene a 4 °C. Alternativamente, use 150 μL de anticorpos e incubar em uma câmara de umidade.</li>
	<li>Remova os anticorpos primários. Lave as tampas muito suavemente 3x com 2 mL de 1x PBS. Prepare os anticorpos secundários em 1x PBS diluindo separadamente o anti-rato de ovelha Cy3 e o anti-coelho de cabra Alexa Fluor488 em uma proporção de 1:300. Adicione 150 μL de ambas as diluições de anticorpos secundários às tampas. Incubar por 45 min no RT no escuro. NOTA: Incubar no escuro para evitar fotobleaching. Outras combinações de anticorpos secundários podem ser usadas conforme necessário.</li>
	<li>Prepare uma solução DAPI (4', 6-diamidino-2-fenildole) de acordo com as instruções do fabricante. Armazene as alíquotas em excesso a -20 °C. Diluir 10 μL de uma alíquota de estoque (1:5.000) em 50 mL de 1x PBS. Adicione 2 mL desta diluição às tampas. Incubar por 5 min no RT no escuro. NOTA: É importante incubar as células no escuro para evitar fotobleaching. A diluição do DAPI pode ser armazenada a 4 °C por até 1 mês.</li>
	<li>Prepare 2 agulhas, lâminas, pinças e mídia de montagem. Rotule os slides.</li>
	<li>Remova a solução DAPI dos poços. Lave 3x com 1x PBS. Coloque uma gota de mídia de montagem em cada slide. Use a agulha para levantar suavemente a mancha de cobertura do fundo do poço. Gire a tampa usando a pinça e coloque-a suavemente sobre a gota da mídia de montagem. Remova cuidadosamente todas as bolhas.</li>
	<li>Proteja os slides da luz e armazene-os durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Use um microscópio fluorescente ou confocal com alta ampliação para visualizar o cílio primário. NOTA: Os slides podem ser armazenados no escuro a 4 °C por até 2 meses.</li>
</ol>

<ol><li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+primary+cilia%3A+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells%2C+but+a+%22sleeping+beauty%22+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Primary+cilia%22">Primary cilia</a>. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).</li>
<li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li>
<li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li>
<li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).</li>
<li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li>
<li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+show+a+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li>
<li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption%2C+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li>
<li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase%2C+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li>
<li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cilium%3A+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy-Cilia+Axis%3A+An+Intricate+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905(2019).</li>
<li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtt%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).</li>
<li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li>
<li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+%28ACDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1(2019).</li>
<li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+JH+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22">Biochimica et Biophysica Acta</a>. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer%3A+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li>
<li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li>
<li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).</li>
<li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5(2017).</li>
<li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11(2015).</li>
<li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada arevelar.

Vários autores descreveram diversos métodos para detecção de cílios primários, às vezes também descrevendo vários métodos de fixação que podem afetar sua detecção6,,20,,21,22. Independentemente disso, é difícil encontrar um protocolo completo e simples para detecção. A disponibilidade pronta de tal método seria, sem dúvida, de grande assistência ao estudo da investigação cilia primária, especia...

Os cílios primários são estruturas sensoriais, solitárias, ligadas à membrana, não-mastile associadas à centriola mãe da célula. Cilias primárias são encontradas na maioria das células vertebrados, com exceção de glóbulos vermelhos, adipócitos1e hepatócitos2. Cilia primária são formadas como um axoneme alongado composto por microtúbulos, cujo componente principal é α-tubulina. O axoneme cresce a partir do corpo basal, que é estruturado a partir de γ-tubulin. O comprimento da cília primária varia entre 2-10 μm; no entanto, suas dimensões podem mudar durante a glicação, fome, hipóxia, estresse citotóxico, ou após a exposição à radiação ionizante3,4,5,,6,7. Geralmente, as células possuem apenas um cílio primário, que está envolvido na morfogênese e vias de sinalização celular importantes para a proliferação celular e diferenciação8,,9.
Os cílios primários são dinamicamente regulados durante a progressão do ciclo celular, especificamente durante as fases G0/G1, e resordiram antes de entrar em mitose em um processo associado à deacetilação de tubulina mediada por HDAC6 (histone deacetylase 6)10. O momento exato da resorção de cílios primários depende do tipo celular e da expressão de genes diretamente envolvidos nesse processo, como Aurora A, Plk1, TcTex-11,11,12,13. Dependendo do tipo celular, os cílios primários expressam diferentes tipos de receptores, canais de íons e vias de sinalização ativa. Estes incluem os receptores de sinalização mais importantes que afetam a proliferação e a sobrevivência, EGFR, PDGFR e FGFR. Também estão incluídas algumas das vias de sinalização que podem afetar a função de um ou mais órgãos, incluindo Hedgehog, Notch e Wnt. Graças a esses receptores e vias de sinalização, os cílios primários também executam uma função de quimioensory. Esta função permite que a cília primária detecte ligantes específicos para Notch, hormônios e substâncias biologicamente ativas, como serotonina ou somatostatina. Outras funções específicas exibidas por cílios primários de diferentes comprimentos incluem reação a mudanças de temperatura, gravidade e osmolalidade14.
O cílio primário pode ser visualizado através de diversos métodos, como visualização ao vivo, microscopia eletrônica de transmissão, imagem 3D ou por software para a detecção automática de cílios primários5,,15,,16,,17. No entanto, esses métodos são altamente especializados e a pesquisa em andamento precisa de métodos básicos, rápidos e fáceis para coloração de cílios primários em todas as etapas da pesquisa. Descrito é um método fácil e útil para a detecção de cílios primários em células cultivadas.

<table><tbody><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>TPP</td><td>92406</td><td>Dimensões 128x86x22 mm</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-546-047</td><td>AffiniPure F(ab')? Fragmento de Cabra Anti-Coelho IgG</td></tr><tr><td>Anti-Tubulina &gama;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>Coelho Policlonal anti-Mouse IgG2a</td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td>Myoblast (mouse)</td></tr> <tr><td>Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td>Anti-Mouse IgG (molécula inteira) F (ab &prime;)2 fragmentos&ndash; Anticorpo Cy3 produzido em ovelhas</td></tr><tr><td>Dapi (4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&agudo; s Águia Modificada&agudo; s meio</td><td>Thermo Scientific</td><td>11960044</td><td>Alta glicose, Sem glutamina, Gibco</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato tampolado solução salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>com MgCl2 e CaCl2, filtrado estéril, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000044</td><td>filtrado estéril, Gibco</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEF</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1039</td><td>Fibroblasto embrionário de camundongo</td></tr><tr><td>Tubulina antiacetilada monoclonal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>Anticorpo monoclonal anti-acetilado da tubulina produzido em camundongo</td></tr><tr><td>NHLF</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td>Fibroblastos pulmonares primários (humanos)</td></tr> <tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina por mL em 0,9% de NaCl, ProLong Diamond</td></tr><tr><td>Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos de pele</td><td>gentilmente presenteado pela Charles University, Faculdade de Medicina em Hradec Kr&aacute; amor&eacute;.</td><td></td><td></td></tr> Capa <tr><td>de Lama Quadrada</td><td>Thermo Scientific</td><td>22X22-1.5</td><td>Vidro borossilicato, 22x22mm, Square</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200072</td><td>Filtrado Estéril, Gibco</td></tr></tbody></table>

detecção simples de cília primária por imunofluorescência

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Os cílios primários são dinamicamente regulados durante a progressão do ciclo celular, especificamente durante as fases G0/G1 do ciclo celular, sendo resorcridas antes da mitose. Cilia primária pode ser visualizada com métodos altamente sofisticados, incluindo microscopia eletrônica de transmissão, imagem 3D, ou usando software para a detecção automática de cílios primários. No entanto, a coloração imunofluorescente da cília primária é necessária para realizar esses métodos. Esta publicação descreve um protocolo para a fácil detecção de cílios primários in vitro, detectando tubulina alfa acetilada (axoneme) e gamma tubulin (corpo basal). Este protocolo de coloração imunofluorescente é relativamente simples e resulta em imagens de alta qualidade. O presente protocolo descreve como quatro linhas celulares (C2C12, MEF, NHLF e fibroblastos de pele) expressando cílios primários foram fixas, imunos detidas e imagens com um microscópio fluorescente ou confocal.

A coloração imunofluorescente da cília primária é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de alta qualidade. Nesses experimentos, os fibroblastos que expressavam cílios primários foram corrigidos, imunossuídos e imagedos em um microscópio fluorescente ou confocal seguindo o protocolo descrito acima. O cílio primário foi detectado usando acetilado α-tubulin e γ-tubulin. A avaliação da cília primária pode ser realizada em vários níveis e qualquer mudança nesse sentido pode estar ligada à exposição à ra...

Cílios primários são estruturas extracelulares associadas ao centriole. A detecção primária de cílios por coloração imunofluorescente é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de altíssima qualidade. Neste protocolo, os fibroblastos que expressavam cílios primários foram fixados, imunossuídos e imagedos em um microscópio fluorescente ou confocal.

Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Este protocolo permite a detecção rápida e fácil de cilias primárias em células cultivadas, dentro de uma variedade de esforços de pesquisa. O método poderia ser utilizado em desordem que afeta os corpos basais de cílios primários. Este procedimento também pode ser aplicado para coloração de cílios primários em tecido incorporado parafina ou para outros experimentos onde a fluorescência é necessária.Comece autoclaving 22 por 22 milímetros de cobertura e preparando materiais para o experimento. Descongele fbs e estreptomicina de penicilina, e aqueça a cultura temperatura média a ambiente. Passagem pelas células com trippsina EDTA e PBS.Prepare a solução fresca de 4% paraformaldeído, cultura média e 1%, de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, limpe a capa de fluxo laminar com 70% de etanol, e coloque todos os materiais necessários dentro. Paraformaldeído é extremamente perigoso.O EPI adequado deve ser usado o tempo todo, e só deve ser manuseado em um capuz químico. Depois de crescer as células desejadas para 70% de confluência, remova-as da incubadora e as coloque na coifa de fluxo laminar. Remova o meio de cultura e enxágue as células duas vezes com PBS.Adicione cerca de dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA ao frasco de cultura, e incuba-o a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique periodicamente as células no microscópio invertido para monitorar o desprendimento. Quando as células se separarem suavemente resususpensá-las em 10 mililitros de meio de cultura, pipetting cuidadosamente para criar uma única suspensão celular.Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros e centrífuga-a a 200 vezes g'por cinco minutos. Decante o supernascedor, em seguida, adicione 10 mililitros de cultura média, e levemente resuspend a pelota. Pegue 20 microliters da suspensão da célula e misture-a com o azul trypan em uma proporção de volume de um para um.Em seguida, conte as células usando hemocittometria padrão. Coloque um deslizamento de tampa dentro de cada poço de uma placa de seis poços, e cubra o deslizamento da tampa com dois mililitros da solução de gelatina, o que ajudará as células presas ao deslizamento da tampa. Retire a gelatina e deixe a placa secar por alguns minutos.Sementes 100.000 fibroblastos em cada poço e adicionar dois mililitros de cultura média. Em seguida, incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 90% de umidade relativa. Após a incubação, trate as células para induzir a ciliação.Aqueça o paraformaldeído de 4% à temperatura ambiente, e prepare uma pipeta de pastagem, ABS, um recipiente de resíduos, tubos cônicos de 15 mililitros, micro pipetas e pontas. Pegue as células da incubadora e coloque-as no banco do laboratório. Remova a mídia de cada poço, deixando o deslizamento da tampa.Lave suavemente as células três vezes com dois mililitros de PBS. Em seguida, adicione dois mililitros do PFA de 4%em cada poço para corrigir as células. Incubar a placa por 10 minutos em temperatura ambiente, depois retire o PFA e repita as lavagens com PBS.Adicione dois mililitros de 0,5% Triton X-100 a cada poço, e incubar a placa por 15 minutos. Em seguida, lave os poços quatro vezes com PBS. Para fazer a solução de bloqueio, descongele um soro de cabra por cinco minutos e dilua-o em PBS a uma proporção de um a 20.Adicione 150 microliters desta solução a cada deslizamento de cobertura e incubar a placa por 20 minutos. Descongele os anticorpos primários por cinco minutos, e dilui-os separadamente na PBS, como descrito no manuscrito do texto. Remova a solução de bloqueio dos deslizamentos de cobertura e adicione 150 microliters de ambas as soluções de anticorpos.Em seguida, incubar a placa por 60 minutos em temperatura ambiente. Remova os anticorpos primários e lave suavemente os deslizamentos de cobertura três vezes com dois mililitros de PBS. Diluir Cy3 Sheep Anti-Mouse e Alexa fluor 488 Goat anti-Rabbit na PBS, em uma proporção de um a 300, e adicionar 150 microliters de ambas as soluções de anticorpos secundários ao deslizamento de cobertura.Prepare uma solução DAPI de trabalho diluindo 10 microliters do estoque em 50 mililitros de PBS, e adicione dois mililitros desta diluição aos deslizamentos de cobertura. Incubar a placa por cinco minutos no escuro, em temperatura ambiente. Antes de colocar os deslizes de tampa nos slides, prepare duas agulhas, pinças e mídia de montagem, e rotule todos os slides.Remova a solução DAPI dos poços e lave-as três vezes com PBS. Coloque uma gota de mídia de montagem em cada slide. Use a agulha para levantar suavemente o deslizamento da tampa do fundo do poço.Em seguida, vire-o e coloque-o suavemente sobre a gota de mídia de montagem usando a pinça. Remova cuidadosamente todas as bolhas. Proteja os slides da luz e armazene-os durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte use um microscópio fluorescente ou confocal com uma alta ampliação para visualizar o cílio primário. Este protocolo foi usado para corrigir imunostain, e imagem várias linhas de células expressando cílios primários. Quando os míbios do rato foram expostos à radiação ionizante em várias doses, descobriu-se que doses mais altas induzem o aparecimento de múltiplas cílias primárias.Enquanto doses baixas resultaram no aparecimento de cílios primários únicos. Da mesma forma, quando os fibroblastos pulmonares humanos foram irradiados em baixa dose, a ília primária única foi detectada por imunofluorescência. Observou-se aumento da cília primária em fibroblastos embrionários de camundongos que estavam famintos, demonstrando que o estresse metabólico afeta os incidentes de ília primária.Quando os fibroblastos de pele foram tratados com 120 doxorubicina nanomolar, eles expressaram um único cílio primário. Doses mais altas induzem o aparecimento de múltiplas cílias primárias. Os fibroblastos tratados com 1,25 nanomolar Taxol também expressaram um único cílio primário.Mas várias cílias não foram detectadas após o tratamento com doses mais altas. Ao abrir este protocolo, certifique-se de seguir todos os regulamentos de EPI. Tenha em mente as necessidades culturais de sua linha de escolha celular e escolha seus anticorpos cuidadosamente.Este procedimento não pode ser seguido diretamente por outros procedimentos, uma vez que as células são irrecuperáveis. Em vez disso, experimentos paralelos devem ser programados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência

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