Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

Este protocolo demonstra um modelo de infecção por aspergillus de larva de peixe-zebra, que podemos usar para investigar as respostas imunes inatas a esse fungo. A principal vantagem do modelo de larva de peixe-zebra é que podemos visualizar as interações do patógeno da célula imune e a progressão da infecção dentro de um animal hospedeiro vivo durante uma infecção de vários dias. Os achados deste modelo podem ser aplicáveis à descoberta de novos alvos terapêuticos para tratar a aspergilose invasiva em pacientes imunocomprometidos.

A microinjeção de esporos em larvas de peixe-zebra é uma técnica difícil que requer prática considerável antes que resultados consistentes e reprodutíveis possam ser alcançados. Para realizar microinjeções, use a configuração fornecida com um injetor de pressão, unidade de pressão de vácuo, pedal, suporte de micropipeta, micromanipulador e um suporte e placa magnéticos. Tudo conectado a uma fonte de ar comprimido.

Abra a válvula de ar comprimido. E ligue o microinjetor. Defina a pressão para cerca de 25 psi, o reforço para 60 milissegundos e a unidade de pressão de vácuo para 1 psi.

Use uma ponta de pipeta microcarregadeira para carregar a agulha de microinjeção com três a cinco micro litros de PBS ou suspensão de esporos com vermelho de fenol. Em seguida, monte a agulha no micromanipulador. Aspergillus fumigatus é um patógeno oportunista de humanos.

Existe o risco de perfuração da pele com a agulha carregada. A agulha deve estar bem presa ao microinjetor, e os pesquisadores devem sempre usar luvas e prestar muita atenção aos movimentos das mãos ao redor da agulha para evitar perfurações. Posicione o micromanipulador de forma que a extremidade da agulha fique visível sob o microscópio estéreo com a menor ampliação.

Zoom para ampliação de 4x, mantendo a agulha à vista. Em seguida, use uma pinça afiada para prender a ponta da agulha. Pressione o pedal de injeção para visualizar o tamanho da gota.

E continue cortando a agulha até que cerca de três nanolitros de suspensão de esporos saiam. Quando estiver pronto, mova o micromanipulador e a agulha para fora do caminho para evitar bater acidentalmente na agulha enquanto organiza as larvas na placa de injeção. Despeje a tricaína E3 da placa de injeção.

E transfira cerca de 24 larvas anestesiadas de dois dias para a placa com o mínimo de E3 possível. Em seguida, organize as larvas de acordo com a direção para a qual estão voltadas, colocando todas as larvas voltadas para a direita em uma fileira e todas voltadas para a esquerda em uma fileira abaixo. Com o microscópio ajustado para a menor ampliação, traga o micromanipulador de volta, de modo que a agulha fique perto das larvas em um ângulo de 30 a 60 graus.

Amplie a ampliação mais alta. E use botões de ajuste fino para ajustar ainda mais a posição da agulha. Injete a suspensão de esporos no líquido próximo às larvas para verificar se 30-70 esporos estão saindo da agulha.

Em seguida, mova a placa de modo que a agulha fique diretamente acima e posicionada perto das primeiras larvas. Começando com as larvas que estão voltadas para a agulha. Insira a agulha através do tecido ao redor da vesícula ótica e perfure-a no ventrículo do rombencéfalo, movendo a placa conforme necessário para obter a orientação correta da larva.

Verifique visualmente se a extremidade da agulha está no centro do ventrículo do rombencéfalo. Em seguida, pressione o pedal para injetar esporos e retraia suavemente a agulha. Depois de injetar todas as larvas em ambas as fileiras, mova a agulha para fora do caminho novamente.

E amplie para uma ampliação menor. O corante vermelho de fenol ainda deve ser visível no rombencéfalo de cada larva. Descarte todas as larvas com injeções malsucedidas e transfira as larvas restantes para uma placa de Petri, lavando-as da placa com E3 fresco. Enxágue a larva duas vezes com E3 e certifique-se de que ela se recupere da anestesia.

Imediatamente após a injeção, transfira oito das larvas para tubos individuais de 1,7 mililitro e eutanasia-as. Prepare 1 mL de PBS com ampicilina e canamicina. Remova o máximo de líquido possível dos tubos com as larvas.

Em seguida, adicione 90 microlitros de PBS com antibióticos. Homogeneizar as larvas em um TissueLyser a 1800 oscilações por minuto, por seis minutos. Em seguida, gire-os para baixo a 17.000 vezes G por 30 segundos.

Pipete a suspensão homogeneizada de cada tubo até o meio de uma placa GMM rotulada e espalhe-a usando um espalhador descartável em forma de L. Tomando cuidado para evitar espalhar contra a borda. Incube as placas de cabeça para baixo a 37 graus Celsius por dois a três dias.

Em seguida, conte o número de colônias formadas. Divida as larvas injetadas restantes em dois pratos de 3,5 milímetros. Um para tratamento medicamentoso e outro para o controle.

Remova o máximo de líquido possível e adicione E3 com o controle do veículo a um prato. E E3 com o tratamento de interesse do outro. Use uma pipeta para transferir cada larva para um poço em uma placa de 96 poços.

E monitorar sua sobrevivência por sete dias. No dia da imagem, prepare uma placa de Petri de 3,5 milímetros com PTU de 100 micromolares e outra com tricaína E3. Adicione a tricaína E3 nas câmaras de um dispositivo Z-wedge E use uma micropipeta P100 para remover as bolhas de ar das câmaras e do canal de retenção.

Em seguida, remova todo o excesso de tricaína E3 fora das câmaras. Pipete uma larva e transfira-a para o prato com o E3 PTU. Em seguida, transfira para a tricaína E3, com o mínimo de líquido possível.

Após 30 segundos, transfira as larvas anestesiadas para a câmara de carregamento do dispositivo de ferimento e aprisionamento. Remova a tricaína E3 da câmara de ferimento e solte-a na câmara de carregamento para mover a cauda das larvas para o canal de restrição. Certifique-se de que a larva esteja posicionada em seu lado lateral, dorsal ou dorsolateral para que o rombencéfalo possa ser visualizado com uma lente objetiva invertida.

Depois de obter imagens da larva com um microscópio confocal, libere a tricaína E3 na câmara de ferimento para empurrar a larva do canal de restrição para a câmara de carregamento. Pegue a larva e transfira-a de volta para o prato com tricaína E3. Em seguida, transfira para o prato com E3 PTU com o mínimo de líquido possível.

Enxágue em PTU e transfira-o de volta para a placa de 48 poços. Os esporos de Aspergillus foram microinjetados no rombencéfalo de larvas de peixe-zebra, um resultado de infecção foi monitorado. Muito pouca morte foi observada nas larvas do tipo selvagem, com 80 a 100% das larvas sobrevivendo durante todo o experimento.

Uma diminuição significativa da sobrevivência foi observada em larvas imunossuprimidas. Quando as unidades formadoras de colônias de larvas do tipo selvagem infectadas foram quantificadas, observou-se persistência de esporos e depuração lenta ao longo do tempo. O número de esporos que sobreviveram um, dois, três, cinco e sete dias após a infecção foi normalizado para o número de esporos injetados, a fim de comparar a persistência e a depuração entre as réplicas.

Quando os macrófagos foram marcados, o agrupamento de micrófagos em cerca de 50% das larvas foi tipicamente observado a partir de dois a três dias após a infecção. O recrutamento de neutrófilos foi retardado, ocorrendo principalmente após a germinação de um fungo. Enquanto a carga fúngica persistiu durante todo o experimento na maioria das larvas.

A eliminação foi observada em alguns cinco dias após a infecção. Em outro subconjunto de larvas, foi observada a disseminação de fungos para áreas fora do rombencéfalo. A área ao redor da vesícula ótica é um local onde essa disseminação foi encontrada.

A germinação fúngica foi tipicamente observada por cinco dias em 60% das larvas. A área do aglomerado de fagoócitos, o recrutamento de macrófagos e o recrutamento de neutrófilos variaram ao longo do tempo em todas as larvas. Com algumas tendências ao longo do experimento e outras se resolvendo com o tempo.

Este procedimento pode ser combinado com a manipulação genética do peixe-zebra, como o CRISPR, para determinar a necessidade de vias específicas do hospedeiro em uma resposta imune inata bem-sucedida ao aspergillus. Este protocolo permitiu a visualização das interações das células imunes inatas do aspergillus em tempo real, em hospedeiros vivos e intactos.