Name: In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Fluorescente Sílica Nanopartículas em Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprenda a avaliar nanopartículas funcionais para terapia contra câncer usando embriões de zebrafish. Este método permite selecionar candidatos ideais para ensaios clínicos futuros em modelos in vivo.

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Os autores agradecem à Srta. Kaylee Smith, Sra. Lauren Kwok e Sr. Alexander Floru por revisarem o manuscrito. H.F. reconhece o apoio de subvenções do NIH (CA134743 e CA215059), da American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) e da Fundação St. Baldrick. F.J.F.L. reconhece uma bolsa de estudos do Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinar Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). O I.S reconhece o suporte à NSF (conceder CBET 1605405) e o NIH R41AI142890.

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Boston University School of Medicine sob o protocolo #: PROTO201800543.
1. Geração de embriões de zebrafish Casper
<ol><li>Escolha peixes casper adultos com pelo menos 3 meses de idade para reprodução natural para gerar embriões transparentes de zebrafish Casper.</li>
	<li>Encha tanques de acasalamento de duas câmaras com água de peixe à noite, separe os tanques superiores usando divisores, coloque um peixe macho em um lado da câmara e um ou dois peixes fêmeas para o outro lado da câmara, e deixe os peixes separados durante a noite por divisórias.</li>
	<li>Retire os divisores na manhã seguinte às 8:00 da manhã quando as luzes estiverem acesas. Adicione plantas de enriquecimento artificial e incline ligeiramente a câmara superior para criar uma área rasa de água. Deixe o peixe procriar por 3-4 h.</li>
	<li>Levante as câmaras superiores dos tanques de acasalamento que contêm os peixes e devolva-os aos tanques originais.</li>
	<li>Colete ovos localizados nas câmaras inferiores despejando a água através de uma rede de malha. Transfira ovos para uma placa de Petri estéril a uma densidade não superior a 200 ovos por prato. Remova qualquer ovo morto ou não fertilizado e encha o prato 2/3 cheio com água de peixe fresco. NOTA: Os ovos fertilizados e saudáveis devem ser translúcidos e redondos. Todos os ovos nublados, brancos ou desfigurados devem ser removidos. A água dos peixes é obtida de tanques de peixes na instalação de peixes.</li>
	<li>Incubar embriões na incubadora a 28,5 °C durante a noite.</li>
	<li>Branquear os embriões na manhã seguinte usando o protocolo padrão, conforme descrito no Livro zebrafish16, e colocar os embriões de volta à incubadora (passo opcional).</li>
	<li>Tire os embriões de 24 hpf da incubadora à tarde e descorrionato os embriões usando pronase.<ol>
<li>Retire o máximo de água de peixe possível dos embriões na placa de Petri e adicione algumas gotas da solução de pronase (1 mg/mL na água do peixe) ao prato. Gire suavemente a placa de Petri. Uma vez que os acordes mostram sinais de desintegração, pipeta os embriões para cima e para baixo algumas vezes para quebrar os acordes para liberar os embriões.</li>
		<li>Adicione água de peixe fresco imediatamente na placa de Petri para terminar o processo uma vez que a maioria dos embriões estão fora dos acordes. Enxágüe os embriões 3x mais usando água de peixe para remover os acordes flutuantes. Devolva os embriões à incubadora.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de células cancerígenas humanas para transplante
<ol><li>Coloque a temperatura da incubadora para exatamente 35,5 °C. Monitore a incubadora para garantir uma temperatura consistente e estável usando um termômetro dentro da incubadora.</li>
	<li>Autoclave 1 L de água de peixe em uma garrafa de vidro. Faça uma solução de 3% de agarose adicionando 3 g de agarose de grau de eletroforese a 100 mL de água de peixe autoclaved e microwaving até que a ágarose seja completamente dissolvida.<ol>
<li>Despeje a solução de agarose quente em uma placa de Petri até que esteja 3/4 cheia. Coloque o molde de microinjeção na agarose. Certifique-se de que o molde não está em contato com a parte inferior da placa de Petri e nenhuma bolha se forma por baixo.</li>
		<li>Deixe a solução solidificar e remova cuidadosamente o molde da placa. Encha a placa com água de peixe autoclaved e armazene a placa a 4 °C. Pré-aquecimento a placa de agarose e água de peixe na incubadora de 35,5 °C antes de colher células HeLa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Puxe 1,0 mm O.D. x 0,78 mm borossilicate capilares de vidro em um puxador de pipeta usando as seguintes configurações: pressão em 500, calor em 560, puxar em 100, velocidade em 100 e tempo/atraso em 200. Guarde agulhas na massa em uma grande placa de Petri que foi limpa com uma toalha de etanol. ATENÇÃO: As agulhas puxadas são muito afiadas e frágeis. Tenha cuidado ao manusear.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de metanos de tricaine (MS222, 4 mg/mL) dissolvendo MS222 em água de peixe autoclaved. Vórtice bem antes de usar. Solução de estoque MS222 Diluir 1:100 em água de peixe (ou seja, adicionar 200 μL de solução de estoque MS222 a 20 mL de água de peixe a uma concentração final de 40 μg/mL) para anestesiar embriões para os seguintes procedimentos.</li>
	<li>Cultura hLabel HeLa cells, transduzindo-as com PLenti6.2_miRFP670 lentivírus usando o protocolo descrito17. Colheita RFP+ Células HeLa 30 min-1 h antes do transplante. NOTA: As células HeLa humanas foram cultivadas em uma incubadora de cultura tecidual de até 70% de confluência em meio de crescimento completo (médio DMEM com 10% de FBS) a 37 °C suplementado com 5% de CO2.<ol>
<li>Remova o meio celular HeLa por aspiração em uma capa de cultura de tecido. Enxágue brevemente a camada celular com PBS estéril para remover todos os traços do soro.</li>
		<li>Adicione 3,0 mL de solução Trippsin-EDTA estéril a um frasco T-75 e coloque as células de volta na incubadora de cultura tecidual de 37 °C por 3-5 minutos para facilitar a digestão enzimática. Observe o frasco sob o microscópio até que ~80% das células fiquem suspensas.</li>
		<li>Adicione 6-8 mL de meio de crescimento completo no frasco. Colete as células em um tubo estéril de 15 mL por pipetação suave. Centrífuga a 135 x g por 5 min.</li>
		<li>Aspire as células HeLa supernascidas e resuspendas em 3 mL de meio de crescimento completo. Repita o passo de lavagem acima 2x. Resuspend as células em 1 mL de meio de crescimento completo e conte as células sob o microscópio usando um hemótmetro.</li>
		<li>Gire as células novamente, remova o supernascer e resuspenja as células em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL a uma concentração de 5 x 107 células/mL. Mantenha as células aquecidas segurando o tubo em uma mão ao transportar para a instalação de peixes. NOTA: Mantenha sempre as células aquecidas armazenando as células dentro da incubadora de 35,5 °C antes ou durante a injeção dos embriões.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transplante de células cancerígenas humanas
<ol><li>Limpe a área de trabalho usando toalhas de etanol antes do transplante (por exemplo, tesoura, pinças, pipetas plásticas, lâminas de barbear).</li>
	<li>Alinhe embriões dentro das ranhuras da placa de agarose usando uma pipeta de plástico. Coloque embriões ao lado com o anterior voltado para a frente. NOTA: Certifique-se de que a água do peixe cubra os embriões. Reserve alguns embriões para não injetar células cancerígenas e use como controles.</li>
	<li>Ligue a fonte de ar e o microinjetor. Tire as células HeLa da incubadora e pipeta as células para cima e para baixo 20-30x usando uma ponta P200. Carregue 3 μL de mistura celular imediatamente em uma agulha usando uma ponta de carregamento de gel com uma extremidade de corte. Insira cuidadosamente a ponta na extremidade inferior afiada da agulha. Se necessário, agite a agulha para garantir que a mistura celular se mova para baixo da agulha para encher a ponta afiada.<ol>
<li>Insira a agulha no suporte da agulha. Use um par de pinças para abrir cuidadosamente a ponta da agulha. Ajuste a pressão e a duração do tempo no microinjetor para empurrar todas as bolhas de ar dentro da ponta da agulha. Reduza o tempo de duração da pressão e da injeção até que o tamanho das gotículas de injeção seja ~1 nL.</li>
		<li>Coloque a placa de injeção sob o microscópio em uma posição apropriada para ter o lado da gema dos embriões voltados para a agulha. Anestesiar os embriões adicionando cinco gotas da solução MS222 diluída (40 μg/mL).</li>
		<li>Posicione o injetor e deixe que a agulha toque na cavidade perivitelline de cada embrião.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injete a mistura celular nos embriões na área vascularizada sob a cavidade perivitelline pressionando o pedal do pé.</li>
	<li>Use a mão nondominante para mover a placa de injeção para o próximo embrião. Use a mão dominante para estender e retrair o injetor enquanto pressiona o pedal do pé simultaneamente para continuar a injeção. Pipeta algumas gotas de água de peixe estéril em embriões que foram injetados. Uma vez que a injeção de todos os embriões na placa é concluída, lave os embriões com água de peixe estéril, coloque-os em uma placa de Petri estéril e mova-os imediatamente para a incubadora de 35,5 °C.</li>
	<li>Depois de 3h, examine os embriões injetados e remova os mortos.</li>
	<li>Devolva os embriões vivos à incubadora de 35,5 °C e incuba-os por 20-24 h para permitir que as células HeLa se espalhem do local da injeção para outras partes do corpo. NOTA: Os embriões são mantidos na incubadora de 35,5 °C para permitir a sobrevivência e migração de células cancerígenas humanas porque as células não se sairam bem a 28,5 °C, a temperatura dos embriões de peixes são normalmente incubadas.</li>
</ol>4. Injeção de nanopartículas ou veículo
<ol><li>Anestesiar os embriões transplantados na manhã seguinte com cinco gotas de solução MS222 diluída. Não adicione muito MS222, porque isso vai matar os embriões. Sob um microscópio fluorescente, pegue cuidadosamente embriões com metástase traseira de células RFP+ HeLa e coloque-os em uma nova placa de Petri com água de peixe estéril.</li>
	<li>Faça as agulhas de injeção como descrito anteriormente na seção 2 usando as seguintes configurações: pressão a 500, calor a 645, puxar a 60, velocidade em 50 e tempo/atraso em 100.</li>
	<li>Siga os procedimentos nas etapas 3.1-3.3 para alinhar embriões e veículo de carga (por exemplo, H2O) ou a solução de nanopartículas na agulha.</li>
	<li>Injete 0,5 nL de solução de nanopartículas de 1 mg/mL atrás do olho e continue a injeção conforme descrito nas etapas 3.5-3.6(Figura 1B). Este local atrás dos olhos é enriquecido com capilares, permitindo que as nanopartículas entrem em circulação.</li>
	<li>Seguindo um procedimento semelhante, injete o veículo (por exemplo, H2O) que foi usado para suspender as nanopartículas em embriões com células HeLa transplantadas e aquelas sem (ou seja, controles) (Figura 1A, C).</li>
	<li>Incubar todos os embriões injetados a 35,5 °C.</li>
</ol>5. Imagem e rastreamento de nanopartículas e células cancerosas
<ol><li>Examine embriões injetados sob um microscópio fluorescente em 0, 30, 60, 90, 120, 180 e 210 min pós-injeção de nanopartículas para monitorar sua distribuição em circulação e o grau de direcionamento de células cancerosas. O direcionamento de células cancerígenas por nanopartículas pode ser observado já em 30 minutos de pós-injeção, dependendo do tipo de nanopartícula testada.</li>
	<li>Pipeta 2-3 embriões em uma placa de Petri e imobilizá-los adicionando cinco gotas de solução MS222 diluída (40 μg/mL). Uma vez que os embriões parem de nadar, remova a maior parte da água para permitir que os embriões deitem-se em seus lados.</li>
	<li>Use uma pipeta com uma escova fina e macia presa à extremidade para alinhar os embriões para que eles se deitem de lado com o anterior voltado para a frente e apenas um olho visível.</li>
	<li>Imagem os embriões em vermelho, azul e canais de campo brilhante em baixa ampliação (2x) para capturar todo o embrião e repetir em maior ampliação (6,4x) para capturar a área da cauda. Concentre o embrião sob o canal vermelho para evitar o sangramento das nanopartículas. NOTA: Os embriões não devem se mover durante a imagem. Qualquer movimento levará a imagens embaçadas e à incapacidade de sobrepor imagens de diferentes canais.</li>
	<li>Adicione água de peixe fresco aos embriões imediatamente após a imagem e devolva-os à incubadora. Repita os passos 5.2-5.4 para a imagem dos embriões em diferentes pontos de tempo.</li>
</ol>

<ol><li>Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+carriers+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).</li>
<li>Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+nanoparticles+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer.</a> Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).</li>
<li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Target+Therapy%22%5BJournal%5D)">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7(2018).</li>
<li>Chinen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+Probes+for+the+Detection+of+Cancer+Biomarkers%2C+Cells%2C+and+Tissues+by+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemal+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence.</a> Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).</li>
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<li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%3A+a+gene+expression+profiling%2C+in+situ+hybridization+and+immunological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li>
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<li>Peerzade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+fluorescent+silica+nanoparticles+for+in+vivo+targeting+of+xenografted+human+tumors+and+cancer+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish.</a> Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).</li>
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</ol>

A I.S. declara interesse na NanoScience Solutions, LLC (beneficiária da bolsa STTR NIH R41AI142890). Todos os outros autores não declaram conflitos de interesse.

O protocolo descrito aqui utiliza o zebrafish como um sistema in vivo para testar a capacidade das nanopartículas de reconhecer e atingir células cancerígenas metastáticas. Vários fatores podem impactar a execução bem sucedida dos experimentos. Primeiro, os embriões precisam ser totalmente desenvolvidos a 48 hpf. O estágio correto de desenvolvimento dos embriões permite que eles resistam e sobrevivam ao transplante de células cancerígenas humanas. Embriões com menos de 48 cv têm uma taxa de sobrevivência significativamen...

O desenvolvimento de nanopartículas capazes de detectar, direcionar e destruir células cancerígenas é de grande interesse tanto para físicos quanto para pesquisadores biomédicos. O surgimento da nanomedicina levou ao desenvolvimento de várias nanopartículas, como aquelas conjugadas com ligantes de alvo e/ou quimioterapia1,,2,,3. As propriedades adicionadas das nanopartículas permitem sua interação com o sistema biológico, detectando e monitorando eventos biológicos com alta eficiência e precisão, juntamente com aplicações terapêuticas. As nanopartículas de óxido de ouro e ferro são usadas principalmente em tomografia computadorizada e aplicações de ressonância magnética, respectivamente. Enquanto as atividades enzimáticas das nanopartículas de óxido de ferro e ouro permitem a detecção de células cancerosas através de assins de assinso colorimétricos, as nanopartículas fluorescentes são adequadas para aplicações de imagem in vivo4. Entre elas, as nanopartículas fluorescentes ultra-francas são particularmente benéficas, devido à sua capacidade de detectar cânceres precocemente com menos partículas e toxicidades reduzidas5.
Apesar dessas vantagens, as nanopartículas requerem experimentação utilizando modelos in vivo animais para seleção de nanomateriais adequados e otimização do processo de síntese. Além disso, assim como as drogas, as nanopartículas dependem de modelos animais para testes pré-clínicos para determinar sua eficácia e toxicidades. O modelo pré-clínico mais utilizado é o rato, que é um mamífero cuja manutenção tem um custo relativamente alto. Para estudos de câncer, camundongos geneticamente modificados ou camundongos xenógrafos são tipicamente usados6,,7. A duração desses experimentos geralmente se estende de semanas a meses. Em particular, para estudos de metástase do câncer, as células cancerígenas são injetadas diretamente no sistema circulatório dos camundongos em locais como veias traseiras e baços8,,9,,10. Esses modelos representam apenas os estágios finais da metástase quando as células tumorais extravasam e colonizam órgãos distantes. Além disso, devido a problemas de visibilidade, é particularmente desafiador monitorar a migração de células tumorais e o direcionamento de nanopartículas de células tumorais em camundongos.
O zebrafish (Danio rerio) tornou-se um poderoso sistema vertebrado para a pesquisa do câncer devido à sua alta fecundidade, baixo custo, desenvolvimento rápido, transparência óptica e conservações genéticas11,12. Outra vantagem do zebrafish sobre o modelo de camundongos é a fertilização dos ovos de peixe ex utero, o que permite que os embriões sejam monitorados durante todo o seu desenvolvimento. O desenvolvimento embrionário é rápido em zebrafish, e dentro de 24 horas de pós-fertilização (hpf), o plano corporal vertebrado já formou13. Por 72 hpf, os ovos são eclodidos do acorde, transitando do embrionário para o estágio de fritura. A transparência do zebrafish, a cepa Casper em particular14,oferece uma oportunidade única para visualizar a migração de células cancerígenas e seu reconhecimento e direcionamento por nanopartículas em um animal vivo. Finalmente, os zebrafish desenvolvem seu sistema imunológico inato em 48 hpf, com o sistema imunológico adaptativo ficando para trás e ficando funcional apenas aos 28 dias após a fertilização15. Esta lacuna de tempo é ideal para o transplante de vários tipos de células cancerígenas humanas em embriões de zebrafish sem experimentar rejeições imunológicas.
Descrito aqui é um método que aproveita a transparência e o rápido desenvolvimento do zebrafish para demonstrar o reconhecimento e direcionamento das células cancerígenas humanas por nanopartículas fluorescentes in vivo. Neste ensaio, células cancerígenas cervicais humanas (células HeLa) geneticamente projetadas para expressar uma proteína fluorescente vermelha foram injetadas na área vascularizada na cavidade perivitelline de 48 hpf embriões. Após 20-24 h, as células HeLa já haviam se espalhado pelos embriões através do sistema circulatório de peixes. Embriões com metástase aparente foram microinjetados com ~0,5 nL de uma solução de nanopartículas logo atrás do olho, onde está localizado o rico leito capilar. Usando esta técnica, as nanopartículas de sílica fluorescentes ultrabright podem atingir células HeLa tão rapidamente quanto 20-30 min de pós-injeção. Devido à sua simplicidade e eficácia, o zebrafish representa um modelo in vivo robusto para testar uma variedade de nanopartículas por sua capacidade de atingir células cancerígenas específicas.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>KSE scientific</td><td>BMK-A1705</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>1.0 mm O.D. x 0,78 mm</td><td></td></tr><tr><td>Computador e monitor</td><td>ThinkCentre</td><td>X000335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>vendido pela Fisher</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de peixes</td><td>VWR</td><td>35960-056</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Marca Fishersci</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Microloader ponta</td><td>Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td>vendido pela Fisher</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MMPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de agulhas</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente Olympus MVX-10 Olympus MVX-10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 ponta</td><td>Fishersci marca</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true" target="_blank">07-200-293</a></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Solução de Sal Tamponada com Fosfato de Dulbecco 1X)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>vendido pela placa de Petri Fisher</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>SB93102</td><td>vendido pela Fisher</td></tr><tr><td>Pipeta de plástico Marca</td><td>Fishersci</td><td>50-998-100</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.addgene.org/113726/" target="_blank">pLenti6.2_miRFP670</a></td><td>Addgene</td><td>13726</td><td></td></tr><tr><td>Bomba pneumática pico</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYSPV820</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche-Sigma-Fisher</td><td>50-100-3275</td><td>Produto Roche fabricado pela Sigma- vendido pela Fisher</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Fishersci marca</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>SZ51 microscópio de dissecação</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine metanossulfonato</td><td>Western Chemicals</td><td>NC0872873</td><td>vendido por Fisher</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td>vendida pela pinça Fisher</td></tr><tr><td></td><td>Fishersci marca</td><td>12-000-122</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent fluorescente sílica nanopartículas em zebrafish

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Desenvolver nanopartículas capazes de detectar, atingir e destruir células cancerígenas é de grande interesse no campo da nanomedicina. Modelos in vivo animais são necessários para fazer a ponte da nanotecnologia à sua aplicação biomédica. O camundongo representa o modelo animal tradicional para testes pré-clínicos; no entanto, os ratos são relativamente caros de manter e têm longos ciclos experimentais devido à prole limitada de cada mãe. O zebrafish emergiu como um poderoso sistema modelo para pesquisas biomédicas e de desenvolvimento, incluindo pesquisas sobre câncer. Em particular, devido à sua transparência óptica e rápido desenvolvimento, os embriões de zebrafish são adequados para o monitoramento in vivo em tempo real do comportamento das células cancerígenas e suas interações com seu microambiente. Este método foi desenvolvido para introduzir sequencialmente células cancerígenas humanas e nanopartículas funcionalizadas em embriões transparentes de zebrafish Casper e monitorar o reconhecimento in vivo e o direcionamento das células cancerosas por nanopartículas em tempo real. Este protocolo otimizado mostra que nanopartículas fluorescentes rotuladas, que são funcionalizadas com grupos de folato, podem reconhecer e atingir especificamente células cancerígenas colossticas do colo do útero, rotuladas com um fluorocromo diferente. O processo de reconhecimento e segmentação pode ocorrer já em 30 minutos de pós-injeção das nanopartículas testadas. Todo o experimento requer apenas a criação de alguns pares de peixes adultos e leva menos de 4 dias para ser concluído. Além disso, os embriões de zebrafish carecem de um sistema imunológico adaptativo funcional, permitindo o engrafamento de uma ampla gama de células cancerígenas humanas. Assim, a utilidade do protocolo aqui descrito permite o teste de nanopartículas em vários tipos de células cancerígenas humanas, facilitando a seleção de nanopartículas ideais em cada contexto específico de câncer para testes futuros em mamíferos e na clínica.

O esquema protocolar na Figura 1 ilustra os procedimentos gerais deste estudo. Peixes adultos machos e fêmeas transparentes foram criados para gerar embriões (seção 1). As células RFP+ HeLa foram injetadas na área vascularizada sob a cavidade perivitelline dos embriões de zebrafish a 48 hpf, com embriões não injetados como controles (seção 3). Para indivíduos com experiência em microinjeção, a taxa de sobrevivência dos embriões é frequentemente alta,...

Descrito aqui é um método para utilizar embriões de zebrafish para estudar a capacidade de nanopartículas funcionalizadas para atingir células cancerígenas humanas in vivo. Este método permite a avaliação e seleção de nanopartículas ideais para testes futuros em animais de grande porte e em ensaios clínicos.

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Fluorescente Sílica Nanopartículas em Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Este procedimento permite que os pesquisadores avaliem e selecionem nanopartículas ideais para estudos em animais de grande porte e ensaios clínicos. Este método simples ajuda a determinar se a nanopartícula pode atingir as células cancerígenas humanas in vivo e, se sim, quão eficiente é o alvo. Demonstrando os procedimentos estarão o Dr. Xiodan Qin, um pós-doutor, e o Sr. Andrew Lam, um técnico de pesquisa do nosso laboratório.Encha dois tanques de acasalamento de câmara com água de peixe à noite e separe os tanques superiores usando divisores. Coloque um zebrafish macho em um lado da câmara e uma ou duas fêmeas zebrafish em outro lado da câmara. Remova os divisores às 8:00 da manhã seguinte.Adicione plantas de enriquecimento artificial e incline ligeiramente a câmara superior para criar uma área rasa de água. Deixe o zebrafish se reproduzir por três a quatro horas e coletar os ovos da câmara inferior derramando a água através de uma rede de malha. Transfira os ovos para uma placa de Petri com no máximo 200 ovos por prato.Remova qualquer ovo morto ou não fertilizado. Encha o prato dois terços cheio de água de peixe fresco, e coloque-o na incubadora. Após 24 horas, retire o prato da incubadora e retire o máximo de água possível do prato.Adicione algumas gotas de um miligrama por solução de pronase mililitro e gire suavemente o prato. Quando os acordes mostram sinais de desintegração, pipeta os embriões para cima e para baixo algumas vezes para quebrar os acordes e liberar os embriões. Uma vez que a maioria dos embriões estão fora dos acordes, adicione imediatamente água de peixe fresco para encerrar o processo.Enxágüe os embriões com água de peixe três vezes para remover os acordes flutuantes Devolva os embriões à incubadora. Faça uma solução de 3% de agarose adicionando três gramas de agarose de grau de eletroforênese a 100 mililitros de água de peixe autoclaved. Micro-ondas a ágarose e água até que a agarose seja completamente dissolvida.Para criar a placa de injeção, despeje a solução de agarose quente em uma placa de Petri até que esteja três quartos cheia e coloque o molde de micro injeção na agarose. Depois que a agarose se solidificar, remova cuidadosamente o molde. Encha a placa de injeção resultante com água de peixe autoclaved e armazene-a a quatro graus Celsius.Para fazer as agulhas de injeção, puxe capilares de vidro borossilicato de um milímetro de diâmetro externo por 0,78 milímetros em um puxador de pipeta. Guarde as agulhas de injeção em massa em uma grande placa de Petri que foi limpa com uma toalha de etanol. Antes de colher as células HeLa, reaqueça a placa de injeção e a água de peixe na incubadora a 35,5 graus Celsius.30 minutos a uma hora antes do transplante, colher as células HeLa. Trabalhando em uma capa de cultura de tecido, remova o meio do frasco por aspiração. Enxágüe as células com PBS estérei para remover todos os traços do meio.Adicione três mililitros de trippsina estéril EDTA ao frasco e incuba-o a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Observe o frasco sob o microscópio para monitorar o progresso da digestão enzimática. Quando aproximadamente 80% das células forem suspensas, adicione seis a oito mililitros de meio de crescimento ao frasco.Colete as células por pipetação suavemente e transfira-as para um tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 135 vezes G por cinco minutos. Aspire o supernasce e resuspenda as células HeLa em três mililitros de meio de crescimento completo.Depois de repetir as etapas de lavagem duas vezes, resuspense as células em um mililitro de meio de crescimento completo. Em seguida, conte as células sob o microscópio usando um hemótmetro. Depois de centrifugar as células novamente, remova o supernante.Resuspend as células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro a uma concentração de cinco vezes 10 para a sétima célula por mililitro. Mantenha as células aquecidas segurando o tubo em uma mão ao transportar para a instalação de peixes. Usando uma pipeta de plástico, coloque os embriões de zebrafish na placa de injeção.Coloque embriões em seus lados com o anterior voltado para a frente alinhados às ranhuras na placa. Ligue a fonte de ar e o micro injetor. Depois de recuperar as células HeLa da incubadora, pipeta as células para cima e para baixo 20 a 30 vezes usando um P200.Usando uma ponta de carregamento de gel com uma extremidade cortada, carregue imediatamente três microliters da suspensão da célula HeLa em uma das agulhas de injeção. Insira a agulha no suporte da agulha e coloque a placa de injeção sob o microscópio. Injete a mistura celular no embrião na área vascularizada sob a cavidade perivitelline pressionando o pedal do pé.Em seguida, pipeta algumas gotas de água de peixe estéril sobre o embrião. Para continuar o processo de injeção, use a mão não dominante para mover a placa de injeção para o próximo embrião e, em seguida, use a mão dominante para estender e retrair o injetor enquanto pressiona simultaneamente o pedal do pé. Finalize a injeção de todos os embriões na placa e lave os embriões com água de peixe estéril em uma placa de Petri estéril.Incubar imediatamente o prato a 35,5 graus Celsius. Depois de três horas, examine os embriões injetados e remova os mortos. No dia seguinte, faça agulhas de injeção para as nanopartículas e armazene-as em massa em uma grande placa de Petri.Trabalhando sob um microscópio fluorescente, pegue cuidadosamente embriões com metástases traseiras e coloque-os em uma nova placa de injeção com água de peixe estéril. Para cada zebrafish com uma metástase traseira, injete solução de nanopartículas ou água atrás do olho. Também injete solução de nanopartículas atrás dos olhos do zebrafish no grupo controle que não recebeu transplantes de HeLa e incuba todos os embriões injetados a 35,5 graus Celsius.Imediatamente após a injeção e novamente em intervalos de 30 a 60 minutos, transfira dois a três embriões para uma placa de Petri e imobilize-os adicionando cinco gotas de solução MS222 diluída. Uma vez que os embriões parem de nadar, remova a maior parte da água para permitir que os embriões deitem-se em seus lados. Usando uma pipeta com uma fina escova macia presa à extremidade, alinhe os embriões para que eles se deitem com o anterior voltado para a frente e apenas um olho visível.Usando ampliação 2X, capture imagens de todo o embrião nos canais vermelho, azul e Brightfield. Para capturar a área da cauda, imagem os embriões em 6.4X de ampliação. Concentre o embrião sob o canal vermelho para evitar o sangramento de nanopartículas.Imediatamente após a imagem, adicione água de peixe fresco aos embriões e devolva-os à incubadora. Embriões de zebrafish injetados e controlados foram imagens usando um microscópio fluorescente. Os pontos vermelhos são células cancerígenas do colossticas humanas, enquanto os pontos azuis representam as nanopartículas.Em um grupo controle, zebrafish que foram injetados com células cancerosas, mas não nanopartículas, as células HeLa fluorescentes eram visíveis no canal vermelho e nenhum sinal fluorescente específico foi detectado no canal azul. No outro grupo controle, os zebrafish foram injetados com nanopartículas, mas não com células cancerosas. Nanopartículas fluorescentes azuis foram distribuídas por todo o sistema circulatório.Nenhuma florescência vermelha específica era visível. Quando zebrafish com metástases traseiras foram injetados com nanopartículas, imagens sobrepostas dos canais vermelho e azul mostram a co-localização de células HeLa e nanopartículas. Depois de realizar este método, podemos analisar a carga tumoral e a sobrevivência das células cancerosas, os animais com e sem injetar nanopartículas para ajustar sua capacidade de matar células cancerígenas.Essa técnica pode facilitar a seleção da nanopartícula ideal que pode reconhecer especificamente a célula cancerígena in vivo levando à detecção precoce de câncer e metástase do câncer.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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zPDX-Análise de Invasividade: Investigando o Comportamento Invasivo de Células Cancerígenas Metastáticas em Xenoenxertos de Embrião de Peixe-Zebra

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Este método utiliza embriões de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular. células cancerosas fluorescentes são injectados para dentro do seio precardiac ou saco vitelino de embriões em desenvolvimento. invasão vascular e celular do cancro do extravasamento é avaliada através de microscopia de fluorescência da região da cauda de 24 a 96 horas mais tarde.

Teste da capacidade Vascular invasiva das células cancerosas no peixe-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

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Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

O objetivo deste método é gerar um modelo in vivo de angiogênese tumoral por xenoenxertos de células tumorais de mamíferos em um embrião de zebrafish que tem vasos sanguíneos com rótulo fluorescentamente. Por imagem do Xenoenxerto e vasos associados, uma medida quantitativa da resposta angiogênica pode ser obtida.

In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.

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Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

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In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Fluorescente Sílica Nanopartículas em Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Fluorescente Sílica Nanopartículas em Zebrafish

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