Geração de organoides intestinais derivados de hiPSC para aplicações de modelagem de doenças e desenvolvimento
8 de março de 2024
Este protocolo permite a diferenciação de células pluripotentes humanas em organoides intestinais. O protocolo mimetiza o desenvolvimento humano normal, diferenciando as células em uma população de endoderme definitivo, endoderme do intestino posterior e, em seguida, epitélio intestinal. Isso torna o protocolo adequado para estudar tanto o desenvolvimento intestinal quanto aplicações de modelagem de doenças.
Este método fornece instruções passo a passo sobre como gerar organoides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos por diferenciação em endoderme definitivo, epitélio intestinal posterior e, finalmente, a transferência para condições de cultura 3D. Os resultados obtidos de organoides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos demonstram maior traduzibilidade do que os dados de culturas monocelulares, ao mesmo tempo em que são mais práticos do que organoides derivados de tecidos primários, que podem ser difíceis de manter em cultura a longo prazo. Após a geração de células intestinais humanas a partir de iPSCs diferenciadas, use uma pipeta sorológica de 5 mililitros para separar a monocamada celular de cada poço da placa de 6 poços.
E junte as células em um único tubo de 15 mililitros para centrifugação. Ressuspender o pellet em meio de crescimento intestinal suplementado com fatores de crescimento. E adicionar o volume adequado de matriz extracelular de acordo com o número de poços a serem plaqueados.
Adicione 30 microlitros da suspensão celular ao centro do número apropriado de poços de uma placa de 48 poços. Garantir que o ECM seja colocado no centro do poço é muito importante para a estabilidade a longo prazo dessa amostra. Se a MEC tocar a parede do poço, ela pode entrar em colapso e as amostras podem ser perdidas.
Coloque a placa na incubadora de cultura celular por pelo menos 5 minutos. Quando a matriz extracelular estiver definida, adicionar 300 microlitros de meio de crescimento intestinal fresco suplementado com fatores de crescimento a cada poço e retornar a placa para a incubadora de cultura celular. Após 48 horas, utilizar microscópio de luz para verificar a formação de organoides nos poços.
Após 7 dias de cultura, aspirar o meio de cultura e substituí-lo por DPBS gelado. Use uma pipeta sorológica de 5 mililitros para separar mecanicamente os organoides e a esfera da matriz extracelular da placa. Em seguida, agrupe os organoides em um único tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Coletar os organoides por centrifugação e aspirar o sobrenadante até o topo da camada visível da MEC. Ressuspenda o pellet em 15 mililitros de DPBS gelado e centrifugue as células novamente. Depois de aspirar o sobrenadante, como demonstrado, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de PBS gelado e use uma pipeta P200 para interromper manualmente os organoides intactos.
Confirme uma dissociação completa dos organoides. Girar os organoides dissociados e ressuspender no volume necessário da matriz extracelular antes de plaquear em uma placa fresca de 48 poços, como demonstrado. Em seguida, retorne a placa à incubadora por 5 minutos.
Após 5 minutos, retirar a placa da incubadora e adicionar o meio basal intestinal com fatores de crescimento e inibidor de ROCK. Troque de mídia a cada 2-4 dias. Para desencadear uma resposta inflamatória nos organoides intestinais, substituir o sobrenadante em cada poço da cultura organoide por 300 microlitros de meio basal recém-preparado suplementado com 40 nanogramas por mililitro de TNF alfa.
Em seguida, retornar a placa à incubadora de cultura celular por 48 horas para replicar um ambiente pró-inflamatório. A expressão gênica pode ser monitorada ao longo da diferenciação do IPSC humano usando marcadores de pluripotência que são altamente expressos no dia 0 e são rapidamente regulados para baixo durante o processo de diferenciação definitiva da endoderme. No dia 2 de diferenciação, os genes definitivos da endoderme devem começar a ser expressos, e a expressão deve atingir o pico no dia 3.
Durante a especificação do intestino posterior, a expressão de CDX2 e HNF4alfa deve ser induzida e aumentar com o tempo. 48 horas após a transferência da folha de células 2D, as folhas de células devem começar a se auto-organizar em estruturas esferoides 3D mais compactadas que são inicialmente pequenas, mas que aumentam gradualmente em tamanho e complexidade nos próximos 7-10 dias de cultura. Os organoides não devem ser passados até que tenham atingido uma morfologia esferoide organoide clara com epitélio óbvio e com o lúmen voltado para o centro da estrutura.
Quando as estruturas atingem esse estágio, a imunocitoquímica pode ser realizada para confirmar a expressão de marcadores intestinais, como vilina e CDX2. Para modelar a inflamação, o TNF alfa pode ser adicionado ao meio de cultura de tecido por 24-48 horas, o que tipicamente resulta na expressão de marcadores pró-inflamatórios em conjunto com a regulação negativa de marcadores epiteliais intestinais. Organoides intestinais pluripotentes derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos podem ser usados para descoberta de drogas, modelagem de doenças, edição de genes, estudo do microambiente tumoral e perfil transcriptômico, proteômico e epigenético de qualquer doença de interesse.
Este método pode ajudar muitos laboratórios a estabelecer organoides intestinais como um sistema modelo, fornecendo-lhes um método adicional para suas pesquisas.
Visão Geral
Esta pesquisa descreve um protocolo para a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em organoides intestinais, imitando o desenvolvimento humano normal. O método produz efetivamente endoderma definitivo, epitélio do intestino posterior e, por fim, estruturas intestinais funcionais, adequadas para o estudo do desenvolvimento intestinal e modelos de doenças.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
- Modelagem de Doenças
Antecedentes
- Células-tronco pluripotentes humanas podem ser diferenciadas em vários tipos celulares.
- Organoides intestinais funcionam como um modelo mais translacionável em comparação com culturas monocelulares.
- Existem desafios na manutenção de organoides derivados de tecidos primários.
Métodos Utilizados
- Diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em organoides.
- Condições de cultivo tridimensionais para estabilidade e crescimento de longo prazo.
- Monitoramento da expressão gênica e imunocitoquímica para marcadores intestinais.
Resultados Principais
- Geração de organoides intestinais a partir de iPSCs com estruturas epiteliais bem definidas.
- Modelagem bem-sucedida de respostas inflamatórias utilizando TNF alfa.
- Expressão robusta de marcadores intestinais confirmada por meio de diversos ensaios.
Conclusões
- O estudo fornece um método viável para a criação de organoides intestinais humanos.
- Essa técnica aprimora as capacidades de pesquisa em descoberta de fármacos e modelagem de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os organoides intestinais derivados de hiPSC fornecem um sistema de modelo escalável, reprodutível e relevante para humanos para a descoberta precoce de fármacos e investigação de mecanismos de doenças. A capacidade de recapitular a arquitetura epitelial intestinal complexa permite confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas para portfólios de doenças gastrointestinais. Esta plataforma sustenta a continuidade translacional desde a descoberta até a pesquisa pré-clínica, facilitando decisões de avanço ajustadas ao risco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em um contexto intestinal humano tridimensional fisiologicamente relevante.
- Apoia a validação funcional de alvos por meio da modelagem da diferenciação e polarização de células epiteliais.
- Facilita a desmistificação mecanicista de vias inflamatórias e fibroticas relevantes para a DII e distúrbios relacionados.
- Oferece uma plataforma para estudos comparativos utilizando hiPSCs derivadas de pacientes e de indivíduos saudáveis.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece culturas padronizadas e expansíveis de organoides adequadas para o desenvolvimento de ensaios quantitativos.
- Permite a medição reprodutível de expressão gênica e marcadores proteicos por meio de qPCR e imunocitoquímica.
- Permite a triagem de respostas inflamatórias a citocinas e mediadores bacterianos em um sistema controlado.
- Permite repassagens e manutenção em escala, apoiando fluxos de trabalho de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Modela fenótipos relevantes para doenças, incluindo respostas inflamatórias e fibroticas, para a descoberta translacional de biomarcadores.
- Permite o alinhamento de achados in vitro com bases genéticas derivadas de pacientes para validação pré-clínica.
- Apoia o avanço dos terapêuticos candidatos ajustado ao risco, visando patologias intestinais.
- Facilita a integração de análises transcriptômicas, proteômicas e epigenéticas para modelagem abrangente da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta plataforma de organoides conecta a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica ao fornecer um sistema relevante para humanos e reprodutível para testes de hipóteses e estudos mecanicistas.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação da hipótese nula e a elucidação de vias no desenvolvimento intestinal e em doenças.
- Triagem: Fornece organoides padronizados e prontos para ensaio, permitindo avaliação quantitativa de respostas inflamatórias e fibroticas.
- Análises: Permite medições robustas da expressão gênica e proteica para comparação entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Alinha modelos in vitro de doenças com fundos genéticos derivados de pacientes para a descoberta de biomarcadores e alvos terapêuticos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e escalonável, adaptável às diversas necessidades da pesquisa gastrointestinal.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho e permite a produção reprodutível e escalável de organoides.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas para doenças gastrointestinais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de hiPSCs, diferenciação e manipulação de organoides tridimensionais.
- Necessita acesso a infraestrutura especializada de cultura celular e plataformas analíticas para qPCR e imunocitoquímica.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de diferenciação e repicagem para garantir reprodutibilidade.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de hiPSCs ou fundos genéticos específicos de doenças.
- A estabilidade e escalabilidade em cultura de longo prazo dependem do manejo preciso da matriz extracelular e da suplementação com fatores de crescimento.
