Um modelo epitelial de interface ar-líquido para exposição de inalação realista e repetida a partículas aéreas para testes de toxicidade
13 de maio de 2020
Descrito é o método de cultura celular e exposição de um modelo brônquico in vitro para exposição realista e repetida de inalação a partículas para testes de toxicidade.
Este protocolo descreve como cultivar e expor células epiteliais brônquicas humanas através do ar. Este é um modelo mais realista para estudar a exposição do pulmão a partículas inaladas. As células pulmonares preparadas com esses métodos se assemelham ao ambiente real no pulmão. As células produzirão muco, formarão uma barreira apertada, permanecendo viáveis por várias semanas. Este método pode ser usado para estudar os efeitos tóxicos de partículas transportadas pelo ar. Também pode ser usado para estudar doenças infecciosas das vias aéreas e medicamentos tomados por inalação. Ao tentar este protocolo pela primeira vez, lembre-se de que gerar um ágil requer conhecimento especializado. Também requer equipamento dedicado para medição. Comece diluindo as células em meio de cultura de células pré-aquecido ou CCM, até uma concentração de 500.000 células por mililitro para inserções de 6 poços. E 250.000 células por mililitro para pastilhas de 12 poços. Coloque uma placa de cultura de células com insertos em condições assépticas e encha o lado lateral basal com CCM pré-aquecido. Cubra a placa e incuba-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Cultivar as células em condições submersas por sete dias, para permitir que atinjam a confluência, trocando o CCM a cada dois ou três dias. Para medir a resistência elétrica transepitelial, use um voltohímetro epitelial carregado, complementado com um conjunto de eletrodos de pauzinhos. Limpe os eletrodos com etanol 70%. Coloque o eletrodo mais longo no meio de cultura externo, até que toque o fundo do prato. E o eletrodo mais curto na mídia, sem tocar na membrana. Comece a coletar medições no inserto vazio sem células. Aguarde até que a medição se estabilize e anote a resistência em ohms. Esta medida é a resistência da membrana de inserção sem células ou resistência em branco. Repita a medição para cada pastilha e subtraia a resistência em branco para obter a resistência real e multiplique pela área de superfície da pastilha. Remova o meio do lado apical das inserções e adicione CCM pré-aquecido ao lado basolateral do poço. O meio deve tocar a membrana por baixo, mas não vazar para a parte superior da inserção. Cultive as células na interface ar-líquido na incubadora, a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por sete dias. Troca do meio basolateral a cada dois ou três dias. Pouco antes da exposição às partículas, prepare uma suspensão de 1% de nanopartículas. Pré-umedeça os NPs com 96% de etanol. Adicione água pura a uma concentração final de 1%NPs.Coloque o frasco em um copo no gelo. Sonicar a suspensão durante 16 minutos, agitar o frasco com a dispersão, ligar o frasco a uma bomba peristáltica através de um pequeno tubo e ajustar o fluxo para 25 mililitros por hora. Um dia antes da exposição, ligue a estação de exposição automatizada ou AES e deixe o gabinete atingir uma temperatura de 37
Visão Geral
Este estudo tem como foco o desenvolvimento de um modelo bronquial in vitro para simular exposições repetidas por inalação a partículas no ar, destinado a testes de toxicidade. As células epiteliais brônquicas humanas cultivadas demonstram longa viabilidade e produção realista de muco, tornando o modelo adequado para estudos toxicológicos e pesquisas sobre doenças infecciosas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Toxicologia
- Biologia respiratória
- Modelos in vitro
Antecedentes
- A necessidade de modelos realistas de exposição pulmonar
- Importância do estudo de partículas inaladas
- Aplicações na pesquisa de doenças infecciosas e na entrega de fármacos
Métodos Utilizados
- Técnicas de cultivo celular para células epiteliais brônquicas humanas
- Condições de cultivo em interface ar-líquido
- Medição da resistência elétrica transepitelial
Resultados Principais
- As células formam uma barreira compacta e produzem muco
- A viabilidade é mantida por várias semanas sob condições controladas
- O método foi validado para uso em avaliações toxicológicas
Conclusões
- O modelo desenvolvido imita efetivamente a exposição pulmonar a partículas inaladas
- Implicações significativas para testes de toxicidade e pesquisa respiratória
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Modelos realistas in vitro de epitélio brônquico são essenciais para testes preditivos de toxicidade por inalação e pesquisas sobre entrega respiratória de fármacos. O sistema de interface ar-líquido (ALI) com células Calu-3 permite estudos de exposição repetida e em baixa dose que imitam de perto as condições das vias aéreas humanas, proporcionando maior confiança translacional na avaliação precoce de compostos. Essa abordagem atende à necessidade de modelos fisiologicamente relevantes e reprodutíveis nos fluxos de trabalho de biofármacos respiratórios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a desmistificação mecanicista dos efeitos de compostos inalados no epitélio das vias aéreas.
- Apoia a validação funcional de alvos ao manter junções apertadas e produção de muco por períodos prolongados.
- Facilita a confiança preditiva em avaliações de toxicidade respiratória e segurança.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema validado e reproduzível para medição quantitativa da integridade da barreira epitelial.
- Permite a padronização de ensaios para exposições repetidas a partículas em baixa concentração.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos atmosféricos sob condições de fluxo contínuo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos de vias aéreas relevantes para doenças em estudos translacionais de biomarcadores.
- Garante a continuidade do descobrimento in vitro aos fluxos de trabalho de toxicologia por inalação pré-clínicos.
- Reduz o risco de falhas em estágios avançados ao modelar cenários de exposição realistas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo brônquico de interface líquido-ar se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico para terapêuticas respiratórias e toxicologia da inalação.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre a função de barreira das vias aéreas e a toxicidade de partículas.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis de resistência transepitelial e viabilidade.
- Análises: Permite o monitoramento contínuo da concentração de exposição e da dose administrada.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a estudos pré-clínicos de inalação com desfechos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada adaptável para diversos estudos com partículas aéreas e fármacos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista nos testes de toxicidade respiratória.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade para protocolos de exposição repetida.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência do capital no desenvolvimento de portfólios respiratórios.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos e formulações inalatórios.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células em interface ar-líquido e na medição da barreira epitelial.
- Necessita de instrumentação dedicada para exposição em fluxo contínuo e monitoramento de resistência.
- Exige padronização entre equipes para protocolos de exposição e análise de dados.
- Adaptável a diversos tipos e concentrações de partículas aerotransportadas, dentro das limitações do modelo.
- Depende da manutenção da viabilidade celular e da integridade das junções apertadas durante períodos prolongados de cultura.
