Name: Ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a ativar vias talamocorticais e corticocorticais em fatias cerebrais ex vivo usando optogenética. Este método permite investigar como anestésicos voláteis modulam respostas sinápticas e atividade de populações neuronais.

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Os autores agradecem bryan Krause pelo apoio técnico e orientação sobre este projeto.
Este trabalho foi apoiado pela International Anesthesia Research Society (IMRA to AR), National Institutes of Health (R01 GM109086 to MIB) e pelo Departamento de Anestesiologia, Faculdade de Medicina e Saúde Pública, Universidade de Wisconsin, Madison, WI, EUA.

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<li>Redinbaugh, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamus+Modulates+Consciousness+Via+Layer-Specific+Control+of+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex.</a> Neuron. 105 (4), 0896(2020).</li>
<li>Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REBUS+and+the+Anarchic+Brain%3A+Toward+a+Unified+Model+of+the+Brain+Action+of+Psychedelics%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics.</a> Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).</li>
<li>Mak-McCully, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+cortical+and+thalamic+activity+during+non-REM+sleep+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans.</a> Nature communications. 8 (1), 15499(2017).</li>
<li>Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consciousness+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Consciousness and anesthesia.</a> Science. 322 (5903), 876-880 (2008).</li>
<li>Sanders, R. D., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+trespass+in+anesthetic+and+sedative+states%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states.</a> Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).</li>
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<li>Nourski, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+Predictive+Coding+across+Awareness+States+under+Anesthesia%3A+An+Intracranial+Electrophysiology+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study.</a> Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+disrupts+functional+interactions+between+sensory+and+high-order+processing+of+auditory+verbal+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Brain+Mapping%22%5BJournal%5D)">Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory.</a> Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).</li>
<li>Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cortical+network+activity+by+the+general+anesthetic+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane.</a> British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).</li>
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<li>Ferrarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+in+cortical+effective+connectivity+during+midazolam-induced+loss+of+consciousness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).</li>
<li>Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+inhibition+of+frontal-to-parietal+feedback+connectivity+is+a+neurophysiologic+correlate+of+general+anesthesia+in+surgical+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients.</a> PLoS.One. 6 (10), 25155(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Properties+in+Transitions+of+Consciousness+during+Propofol-induced+Sedation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16791(2017).</li>
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<li>Banks, M. I., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+actions+of+volatile+anesthetics+on+GABAA+IPSCs%3A+dissociation+of+blocking+and+prolonging+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects.</a> Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).</li>
<li>Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+measures+of+volatile+anesthetics+in+the+aqueous+phase+using+calcium+sensitive+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste manuscrito, é descrito um protocolo para avaliação de respostas intra e extracelulares a caminhos aferentes seletivamente ativados em fatias cerebrais ex vivo.
O uso de ferramentas optogenéticas e esquemas paralelos de gravação permite que os investigadores testem respostas de populações locais a diferentes insumos de regiões cerebrais distantes, enquanto registram simultaneamente de populações-alvo de interneurons. O uso da tecnologia optogenética permite que terminais de axônio de proj...

Anestésicos voláteis têm sido usados onipresentemente em uma variedade de ambientes clínicos e acadêmicos por mais de um século. Classes distintas de anestésicos têm alvos moleculares únicos, muitas vezes não sobrepostos 1,2,3, mas quase todos eles produzem inconsciência. Embora seus efeitos comportamentais sejam bastante previsíveis, os mecanismos pelos quais os anestésicos induzem a perda de consciência são amplamente desconhecidos. Os anestésicos podem, em última análise, influenciar tanto o nível quanto o conteúdo da consciência através de ações em circuitos corticotalâmicos, interrompendo a integração da informação em toda a hierarquia cortical 4,5,6,7,8,9. De forma mais ampla, a modulação de circuitos corticotalâmicos pode desempenhar um papel experimentalmente10 ou farmacologicamente11 estados alterados de consciência, e também pode ser implicada no sono12 e em distúrbios fisiodósiológicos da consciência13,14.
A esquiva dos mecanismos subjacentes à perda e ao retorno da consciência durante a anestesia pode ser atribuída parcialmente a ações não lineares e sinérgicas de anestésicos nos níveis celular, de rede e sistemas15. Isoflurane, por exemplo, suprime a atividade dentro das regiões cerebrais selecionadas 16,17,18, prejudica a conectividade entre regiões cerebrais distantes 19,20,21,22,23, e diminui as respostas sinápticas de forma específica da via24,25 . Quais efeitos dos anestésicos, do nível molecular ao dos sistemas, são necessários ou suficientes para efetuar a perda de consciência permanece incerto. Além das investigações clínicas substantivas da consciência utilizando técnicas não invasivas 19,20,26, é importante que os experimentalistas busquem desembaraçar as distintas interações celulares e de rede que subservem a experiência consciente.
Simplificando as interações complexas encontradas no cérebro intacto, as fatias cerebrais ex vivo permitem o estudo de componentes isolados dos sistemas dinâmicos do cérebro9. Uma preparação reduzida de fatias combina os benefícios de estruturas anatômicas relativamente intactas de circuitos neurais locais com a versatilidade de manipulações in vitro. No entanto, até recentemente, as restrições metodológicas têm impedido o estudo das propriedades sinápticas e de circuito de insumos de longo alcance em fatias cerebrais27,28; o caminho tortuoso dos tratos de fibra corticotalâmica tornou a ativação de vias independentes, mas impossíveis por estimulação elétrica.
Investigar os efeitos dos agentes anestésicos nas preparações de fatias cerebrais apresenta desafios adicionais. Sem um sistema respiratório e circulatório intacto, os agentes anestésicos devem ser aplicados no banho, e concentrações cuidadosamente combinadas com concentrações estimadas do local de efeito. Para muitos agentes anestésicos intravenosos, a lenta taxa de equilíbrio no tecido torna as investigações farmacológicas tradicionais laboriosas29,30. Investigar os efeitos de anestésicos voláteis de gás nas preparações ex vivo é mais tratável, mas também apresenta desafios. Estes incluem a conversão de doses de pressão parcial inaladas em concentrações aquosas, e a necessidade de um sistema de entrega modificado da droga para o tecido através de fluido espinhal cerebral artificial31.
Aqui, os métodos são descritos pelos quais os investigadores podem capitalizar as propriedades físico-químicas bem documentadas do anestésico volátil para entrega de drogas para fatias cerebrais ex vivo, ativar entradas específicas de caminhos e camadas para uma área cortical de interesse com alta resolução espacial, e realizar gravações simultâneas de laminar e registros de grampos direcionados de populações selecionadas de neurônios. Combinados, esses procedimentos permitem aos pesquisadores medir alterações induzidas por anestésicos voláteis em várias propriedades de resposta eletrofisiológica observável, do nível sináptico ao nível da rede local.

<table><tbody><tr><td>Lente objetiva de campo amplo 2,5x</td><td>Lente</td> objetiva de imersão em água <td>Olympus MPLFLN2,5X</td><td></td></tr><tr><td>40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>mistura de 95% O2/5% CO2</td><td></td> Sonda <td>Airgas</td> Z02OX95R2003045 <td></td></tr><tr><td>A16</td><td>Sonda NeuroNexus</td><td>A16x1-2mm-100-177-A16</td><td>de 16 canais</td></tr><tr><td>AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP</td><td>Karl Deisseroth Lab, UNC Monitor</td> de gás anestésico de núcleo <td></td><td></td>vetorial</tr><tr><td>(POET II)</td><td>Criticare</td><td>602-3A</td><td></td></tr><tr><td>ATP, sal de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>solução intracelular</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>007914</td><td>Camundongo tdTomato dependente de Cre</td></tr><tr><td>B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>008069</td><td>PV-Cre mouse</td></tr><tr><td>Belly Dancer Shaker</td><td>Thomas Scientific</td><td>1210H86-TS</td><td>para equilíbrio de sacos de gás selados</td></tr><tr><td>Solução de Betadine Marca</td><td>genérica</td> Bleach <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Marca</td><td></td> genérica <td>para eletrodo de grampo de remendo de cloração de prata</td></tr><tr><td>Bupivicaína</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSC20010</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Vidro capilar (gravações de patch clamp)</td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>KG-33</td><td>Borosilicato, ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm, Comprimento: 90,0 mm</td></tr><tr><td>Vidro capilar (injeções virais)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>3,5"</td></tr> <tr><td>Controle do micromanipulador júnior</td><td>Luigs e Neumann</td><td>SM8</td><td>para controle do micromanipulador júnior</td></tr><tr><td>Controle de manipuladores e mesa móvel</td><td>Luigs e Neumann</td><td>SM7</td><td>para controle de eletrodo multicanal e mesa de mudança</td></tr><tr><td>Digidata 1440A + Clampex 10</td><td>Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>Digitalizador e software</td></tr><tr><td>Tubulação E-3603</td><td>Fisher Scientific</td><td>14171208</td><td>para entrega de mistura de gás 95% O2/5% CO2 para a câmara de incubação + aplicação de pressão durante o patch clamping</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dot Scientific</td><td>DSE57060</td><td>solução intracelular</td></tr><tr><td>ERP-27 EEG Reference/Patch Panel</td><td>Agulha</td> de enchimento <td>aposentada</td><td></td>da Neuralynx</tr><tr><td></td><td>World Precision</td><td>Instruments 50821912</td><td>para pipetas de fixação de patch clamp</td></tr><tr><td>de enchimento Cubo de filtro para imagem EYFP</td><td>Olympus</td><td>U-MRFPHQ</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09801E</td><td>colocado sobre o modelo de fatia durante a preparação do bloco de tecido</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta flamejante/marrom</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>2.5x2.5 Caixa de filamento</td></tr><tr><td>Tubo de dispersão gasosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3953312C</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de vidro (100 mL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z314390</td><td>para enchimento de sacos selados a gás</td></tr><tr><td>Ácido glucônico, sal de potássio (K-gluconato)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSG37020</td><td>solução intracelular</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Dot Scientific</td><td>DSG32040</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>GTP, Sal de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877</td><td>solução intracelular</td></tr><tr><td>Adaptador de sonda de cabeça</td><td>Adaptador NeuroNexus</td><td>A16-OM16</td><td>para conectar sonda de 16 canais à entrada de cabeça</td></tr><tr><td>Pinça hemostática</td><td>VWR International</td><td>76192-096</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Dot Scientific</td><td>DSH75030</td><td>ACSF, solução intracelular</td></tr><tr><td>HS-16 Headstage</td><td>Neuralynx</td><td>Isoflurano</td> Patterson Veterinary aposentado <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico (70%)</td><td>VWR International</td><td>101223-746</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador júnior</td><td>Luigs e Neumann</td><td>210-100 000 0090-R</td><td>para manipulação de eletrodo de grampo de remendo</td></tr><tr><td>Módulo de controle de fonte de luz LED</td><td>Mightex</td><td>BLS-PL02_US</td><td>controle de fonte de luz optogenética</td></tr><tr><td>Amplificador de Lidocaína</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8</td><td>Fonte</td> de Alimentação <td>Lynx-8 Aposentada</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Neuralynx</td><td></td> Sulfato de Magnésio Aposentado <td></td></tr><tr><td>(MgSO4)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSM24300</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>mCherry, Texas Cubo de filtro vermelho</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>para imagem tdTomato repórter fluorescente</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-micropipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9044962</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de microsseringa</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Marca</td><td></td><td></td>genérica</tr><tr><td>MultiClamp 700A</td><td>Molecular Devices/Axon Instruments</td><td>700A</td><td>Amplificador</td></tr><tr><td>de nitrogênio (para mesa de ar)</td><td>Airgas</td><td>NI200</td><td></td></tr><tr><td>Malha de nylon</td><td>Fisher Scientific</td><td>501460083</td><td>esticada sobre ferradura de fio de platina achatado, corte de descanso em cima disso durante as gravações</td></tr><tr><td>Nylon, cortado da meia-calça</td> Peça pequena de <td>marca</td><td></td> genérica <td>para criar plataforma de fatia na câmara de incubação, fibras únicas para criar harpa de platina</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Pipeta</td><td></td> de NC1697520 <td></td>Científica Fisher</tr><tr><td></td><td>Dot Scientific</td><td>307</td><td>Para transferir tecido para o equipamento</td></tr><tr><td>Fio de platina</td><td>VWR International</td><td>BT124000</td><td>2 cm, achatado, para fazer harpa de platina</td></tr><tr><td>Polygon400</td><td>Mightex</td><td>DSI-E-0470-0617-000</td><td>sistema de entrega de luz optogenética, vem com software PolyScan2</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSP41000</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio (KH2PO4)</td> Lâmina <td>de</td> barbear <td>Dot Scientific</td> DSP41200 <td>ACSF</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de safira (para vibratome)</td><td>VWR International</td><td>100492-502</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-361445</td><td></td></tr><tr><td>Saco de gás selado</td><td>Fisher Scientific</td><td>109236</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de deslocamento para microscópio</td><td>Luigs e Neumann</td><td>380FMU</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (HCO3-)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS22060</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS23020</td><td>ACSF, solução intracelular</td></tr><tr><td>Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>013044</td><td>camundongo SOM-Cre</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico</td><td>Kopf</td><td>Modelo 902</td><td>Dual Small Animal</td></tr><tr><td>Super cola</td><td>Grampos</td><td>886833</td><td>fixar o bloco de tecido ao estágio da amostra durante a preparação da fatia</td></tr><tr><td>Broca cirúrgica</td><td>RAM Products Inc.</td><td>Seringa DIGITALMICROTORQUE</td><td>Microtorque II</td></tr><tr><td>(1 mL) com ponta LuerLock</td><td>Fisher Scientific</td><td>309628</td><td>para aplicação de pressão durante o patch clamping</td></tr><tr><td>Seringa (1 mL) com ponta deslizante</td><td>WW Grainger, Inc.</td><td>19G384</td><td>para enchimento de pipetas de braçadeira de remendo</td></tr><tr><td>Filtros de seringa</td><td>VWR International</td><td>66064-414</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo vibratório</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>toalhas Wypall</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-042-427</td><td></td></tr></tbody></table>

ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Anestésicos influenciam a consciência em parte através de suas ações em circuitos thalamocortical. No entanto, ainda não está claro até que ponto os anestésicos voláteis afetam componentes celulares e de rede distintos desses circuitos. As fatias cerebrais ex vivo fornecem um meio pelo qual os pesquisadores podem sondar componentes discretos de redes complexas e desembaraçar mecanismos potenciais subjacentes aos efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas. Para isolar potenciais efeitos de células e efeitos de drogas específicas em fatias cerebrais, os pesquisadores devem ser capazes de ativar independentemente vias de fibras diferentes, identificar populações não sobrepostas de células e aplicar anestésicos voláteis ao tecido em solução aquosa. Neste protocolo, são descritos métodos para medir respostas optogeneticamente evocadas a dois caminhos independentes a diferentes para o neocórtex em fatias cerebrais ex vivo. Respostas extracelulares são registradas para avaliar a atividade da rede e gravações de grampos de remendo de células inteiras direcionadas são realizadas em interneurônios somatostatina e parvalbumin-positivos. Descreve-se a entrega de concentrações fisiologicamente relevantes de isoflurane através de fluido espinhal cerebral artificial para modular as respostas celulares e de rede.

Uma linha do tempo de etapas descritas no protocolo é mostrada na Figura 1. As entradas corticais que chegam de áreas corticais de ordem superior ou de núcleos talâmicos não primários têm campos terminais parcialmente sobrepostos na camada 1 do córtex visual não primário24. Para isolar caminhos aferentes independentes thalamocortical ou corticocortical, um vetor viral contendo ChR2 e um repórter fluorescente eYFP em Po ou Cg foi injetado. As células dentro do raio de ...

As fatias cerebrais ex vivo podem ser usadas para estudar os efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas a diferentes entradas. A optogenética é empregada para ativar independentemente os afferents thalamocortical e corticocortical ao neocórtex não primário, e as respostas sinápticas e de rede são moduladas com isoflurano.

Ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

Este protocolo pode ser usado para investigar se os anestésicos voláteis interrompem algumas sinopses mais do que outras, para determinar se seus efeitos são do tipo celular ou específicos da via e para determinar quais efeitos ocorrem no nível da população. A principal vantagem desta técnica é a especificidade com a qual podemos avaliar os efeitos dos anestésicos voláteis. Podemos direcionar vias e tipos de células específicos em ensaios simultâneos de atividade populacional.Comece preparando o bloco de tecido para seccionamento. Levante suavemente o cérebro da cavidade craniana e coloque-o no papel de filtro. Faça um corte ao longo do plano sagital do cérebro paralelo à linha média e coloque o bloco de tecido neste plano sagital.Guie o papel de filtro sobre o modelo de bloqueio e alinhe o cérebro com o contorno do modelo subjacente. Faça um corte paralelo no plano coronal conforme indicado pelas linhas do gabarito, adicionando uma pequena gota de fatiar aCSF para manter o papel de filtro úmido se necessário. Coloque o bloco de tecido em quatro graus Celsius cortando aCSF e aplique uma pequena quantidade de cola no estágio de amostra gelada.Levante o bloco de tecido do aCSF fatiado e retire o excesso de solução com a ponta de uma toalha absorvente. Cole o plano coronal posterior do bloco de tecido no estágio da amostra com a superfície dorsal do cérebro voltada para a lâmina de safira. Colete fatias de cérebro coronal de 500 micrômetros de espessura e coloque-as em uma malha de náilon a 34 graus Celsius, cortando aCSF.Deixe o recipiente atingir a temperatura ambiente. Para preparar sacos experimentais de aCSF com isoflurano dissolvido, adicione 600 mililitros de aCSF experimental e 600 mililitros de mistura de gás 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono a um saco de gás politetrafluoretileno vazio. Rotule este controle de bolsa.Adicione 300 mililitros de aCSF experimental a outro saco de gás politetrafluoretileno e rotule este saco como isoflurano. Prossiga com a preparação da bolsa de isoflurano de acordo com as instruções do manuscrito. Configure os protocolos de simulação de luz atribuindo aleatoriamente formas de onda a cada perfil.Cada perfil com sua forma de onda atribuída corresponde a um pulso de disparo de uma entrada TTL digital ou uma tentativa. Quando terminar, salve a sequência de perfil. Para colocar a sonda multicanal na lâmina de tecido cerebral ex vivo, perfunda o aCSF experimental borbulhado de três a seis mililitros por minuto e transfira a fatia do cérebro contendo a área de interesse para a grade de malha na câmara de perfusão do microscópio.Ancore a fatia do cérebro com uma harpa de platina. Gire a grade de malha de modo que a linha de contatos do eletrodo na extremidade distal da sonda multicanal fique aproximadamente perpendicular à superfície da casca. Sob iluminação de campo amplo e controle preciso do micromanipulador, abaixe a sonda multicanal em direção à superfície da fatia.Engate o cubo de filtro apropriado para visualização da proteína repórter fluorescente expressa nos terminais axônicos das aferências corticais. Se necessário, gire a fatia para alinhar com mais precisão a sonda com a superfície da casca. Posicione a sonda logo acima do plano da fatia 200 micrômetros abaixo da posição final do alvo ao longo do eixo x, deixando pelo menos um canal fora da área de tecido que está sendo registrada.Insira lentamente a sonda na fatia ao longo de seu eixo longitudinal. Para minimizar os danos ao tecido, avance a sonda apenas até o ponto em que as pontas afiadas fiquem visíveis abaixo da superfície do tecido. Mude a fonte experimental de aCSF para a solução de controle ensacada e identifique a célula marcada com fluorescência para gravação de patch clamp direcionada.Restrinja a abertura ao menor diâmetro e engate a objetiva de imersão em água de alta potência, tomando cuidado para evitar o contato entre a sonda multicanal e a lente objetiva. Coloque o tecido em foco. Centralize a luz sobre uma área de tecido adjacente, mas não sobreposta, à sonda multicanal.Ativar o conjunto de filtros adequado para permitir a obtenção de imagens das células que expressam o marcador fluorescente dependente de Cre. Levante a lente objetiva para criar amplo espaço para abaixar uma pipeta de remendo. Carregue uma pipeta de remendo com solução interna e monte-a no suporte do eletrodo.Use uma seringa de um mililitro para aplicar pressão positiva correspondente a aproximadamente 0,1 mililitro de ar. Abaixe a pipeta de adesivo na solução, focando a ponta sob orientação visual, e obtenha o registro de toda a célula da célula alvo. Os animais utilizados neste protocolo expressaram proteína repórter fluorescente tdTomato em interneurônios positivos para somatostatina ou parvalbumina.Esses interneurônios foram direcionados para clampeamento de patch sob orientação visual com o cubo de filtro apropriado acionado. Potenciais pós-sinápticos foram observados em interneurônios em resposta a um trem de quatro pulsos de luz de dois milissegundos. Potenciais de campo locais também foram registrados.A densidade da fonte de corrente e a atividade de várias unidades foram extraídas dos potenciais de campo locais. A amplitude dos sumidouros de corrente extraídos da densidade da fonte de corrente aumentou em função da intensidade da luz. Uma equação logística não linear de três parâmetros foi ajustada aos dados para comparações entre os caminhos.A amplitude do potencial pós-sináptico também aumentou com a amplitude do sumidouro de corrente. As respostas sinápticas às entradas tálamo-corticais e cortico-corticais foram medidas durante as condições de controle, isoflurano e recuperação. As respostas pós-sinápticas dos estímulos somatostatina e córtico-corticais e os sumidouros de corrente evocada foram suprimidos em condições de isoflurano.Ao preparar as fatias do cérebro, manter a saúde do tecido é fundamental. É importante manter o tecido fresco durante todo o procedimento de corte, trabalhando rapidamente sem danificar o tecido. As gravações extracelulares multicanal podem ser pós-processadas de várias maneiras.Por exemplo, a filtragem passa-alta do sinal de banda larga isola a atividade de pico da população, enquanto os cálculos de densidade de fonte atual destacam a atividade sináptica. Juntas, essas técnicas nos permitiram explorar os efeitos anestésicos em componentes isolados específicos de circuitos corticais, fornecendo informações sobre os mecanismos subjacentes à perda de consciência in vivo.

optogenetic-activation-afferent-pathways-brain-slices-modulation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve um método para obter imagens e registrar simultaneamente a atividade elétrica de fatias cerebrais transgênicas que contêm proteínas fluorescentes específicas de neurônios. O procedimento envolve a manutenção da fatia do cérebro em uma câmara de perfusão com líquido cefalorraquidiano artificial aerado, usando uma fonte de luz para excitar células marcadas com fluorescência e registrando os sinais elétricos com uma sonda multicanal e um grampo de remendo.

Monitoramento óptico e eletrofisiológico simultâneo de células neuronais em fatias cerebrais

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a conectividade sináptica entre o córtex pré-frontal medial (mPFC) e os neurônios da amígdala usando fatias agudas de cérebro de amígdala de camundongos. Os neurônios mPFC nesses camundongos expressam a canalrodopsina fundida a uma proteína fluorescente. As channelrodopsinas facilitam o influxo de íons e a geração de potencial de ação nos neurônios mPFC após a ativação da luz. Consequentemente, os neurônios mPFC liberam neurotransmissores que...

Visualização e mapeamento de vias neuronais em uma fatia de cérebro de amígdala

Este vídeo demonstra o procedimento para estudar a eficiência sináptica no córtex entorrinal lateral (LEC) estimulando optogeneticamente os axônios do córtex pré-frontal medial (mPFC) e registrando as respostas dos neurônios piramidais no LEC. Este método combina gravações de patch-clamp com ativação sináptica por estimulação de luz para estudar a plasticidade sináptica.

Estimulação optogenética e registro eletrofisiológico de eventos sinápticos em fatias de cérebro de rato

Descrevemos um método para caracterizar a topografia funcional e as propriedades sinápticas dos circuitos do prosencéfalo usando uma abordagem optogenética para fotoestimular populações neuronais in vitro.

Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

abordagens optogenética são amplamente utilizados para manipular a atividade neural e avaliar as consequências para o funcionamento do cérebro. Aqui, uma técnica que é descrita por expressão in vivo do activador channelrodopsina óptico, permite a análise ex vivo de propriedades sinápticos de longo alcance específico e conexões neurais locais em circuitos relacionados com o medo.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

Como implementado atualmente, a optogenética em primatas não humanos requer injeção de vetores virais no cérebro. Um método de injeção ideal deve ser confiável e, para muitas aplicações, capaz de atingir locais individuais de profundidade arbitrária que são facilmente e inequivocamente identificados na histologia pós-morte. Um método de injeção com essas propriedades é apresentado.

Injeções de vetores AAV para optogenética em cérebro de primata anestêm e acordado comportando-se não-humano

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Aprenda a ativar vias talamocorticais e corticocorticais em fatias cerebrais ex vivo usando optogenética. Este método permite investigar como anestésicos voláteis modulam respostas sinápticas e atividade de populações neuronais.

Ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis

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