Ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis

Este protocolo pode ser usado para investigar se os anestésicos voláteis interrompem algumas sinopses mais do que outras, para determinar se seus efeitos são do tipo celular ou específicos da via e para determinar quais efeitos ocorrem no nível da população. A principal vantagem desta técnica é a especificidade com a qual podemos avaliar os efeitos dos anestésicos voláteis. Podemos direcionar vias e tipos de células específicos em ensaios simultâneos de atividade populacional.

Comece preparando o bloco de tecido para seccionamento. Levante suavemente o cérebro da cavidade craniana e coloque-o no papel de filtro. Faça um corte ao longo do plano sagital do cérebro paralelo à linha média e coloque o bloco de tecido neste plano sagital.

Guie o papel de filtro sobre o modelo de bloqueio e alinhe o cérebro com o contorno do modelo subjacente. Faça um corte paralelo no plano coronal conforme indicado pelas linhas do gabarito, adicionando uma pequena gota de fatiar aCSF para manter o papel de filtro úmido se necessário. Coloque o bloco de tecido em quatro graus Celsius cortando aCSF e aplique uma pequena quantidade de cola no estágio de amostra gelada.

Levante o bloco de tecido do aCSF fatiado e retire o excesso de solução com a ponta de uma toalha absorvente. Cole o plano coronal posterior do bloco de tecido no estágio da amostra com a superfície dorsal do cérebro voltada para a lâmina de safira. Colete fatias de cérebro coronal de 500 micrômetros de espessura e coloque-as em uma malha de náilon a 34 graus Celsius, cortando aCSF.

Deixe o recipiente atingir a temperatura ambiente. Para preparar sacos experimentais de aCSF com isoflurano dissolvido, adicione 600 mililitros de aCSF experimental e 600 mililitros de mistura de gás 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono a um saco de gás politetrafluoretileno vazio. Rotule este controle de bolsa.

Adicione 300 mililitros de aCSF experimental a outro saco de gás politetrafluoretileno e rotule este saco como isoflurano. Prossiga com a preparação da bolsa de isoflurano de acordo com as instruções do manuscrito. Configure os protocolos de simulação de luz atribuindo aleatoriamente formas de onda a cada perfil.

Cada perfil com sua forma de onda atribuída corresponde a um pulso de disparo de uma entrada TTL digital ou uma tentativa. Quando terminar, salve a sequência de perfil. Para colocar a sonda multicanal na lâmina de tecido cerebral ex vivo, perfunda o aCSF experimental borbulhado de três a seis mililitros por minuto e transfira a fatia do cérebro contendo a área de interesse para a grade de malha na câmara de perfusão do microscópio.

Ancore a fatia do cérebro com uma harpa de platina. Gire a grade de malha de modo que a linha de contatos do eletrodo na extremidade distal da sonda multicanal fique aproximadamente perpendicular à superfície da casca. Sob iluminação de campo amplo e controle preciso do micromanipulador, abaixe a sonda multicanal em direção à superfície da fatia.

Engate o cubo de filtro apropriado para visualização da proteína repórter fluorescente expressa nos terminais axônicos das aferências corticais. Se necessário, gire a fatia para alinhar com mais precisão a sonda com a superfície da casca. Posicione a sonda logo acima do plano da fatia 200 micrômetros abaixo da posição final do alvo ao longo do eixo x, deixando pelo menos um canal fora da área de tecido que está sendo registrada.

Insira lentamente a sonda na fatia ao longo de seu eixo longitudinal. Para minimizar os danos ao tecido, avance a sonda apenas até o ponto em que as pontas afiadas fiquem visíveis abaixo da superfície do tecido. Mude a fonte experimental de aCSF para a solução de controle ensacada e identifique a célula marcada com fluorescência para gravação de patch clamp direcionada.

Restrinja a abertura ao menor diâmetro e engate a objetiva de imersão em água de alta potência, tomando cuidado para evitar o contato entre a sonda multicanal e a lente objetiva. Coloque o tecido em foco. Centralize a luz sobre uma área de tecido adjacente, mas não sobreposta, à sonda multicanal.

Ativar o conjunto de filtros adequado para permitir a obtenção de imagens das células que expressam o marcador fluorescente dependente de Cre. Levante a lente objetiva para criar amplo espaço para abaixar uma pipeta de remendo. Carregue uma pipeta de remendo com solução interna e monte-a no suporte do eletrodo.

Use uma seringa de um mililitro para aplicar pressão positiva correspondente a aproximadamente 0,1 mililitro de ar. Abaixe a pipeta de adesivo na solução, focando a ponta sob orientação visual, e obtenha o registro de toda a célula da célula alvo. Os animais utilizados neste protocolo expressaram proteína repórter fluorescente tdTomato em interneurônios positivos para somatostatina ou parvalbumina.

Esses interneurônios foram direcionados para clampeamento de patch sob orientação visual com o cubo de filtro apropriado acionado. Potenciais pós-sinápticos foram observados em interneurônios em resposta a um trem de quatro pulsos de luz de dois milissegundos. Potenciais de campo locais também foram registrados.

A densidade da fonte de corrente e a atividade de várias unidades foram extraídas dos potenciais de campo locais. A amplitude dos sumidouros de corrente extraídos da densidade da fonte de corrente aumentou em função da intensidade da luz. Uma equação logística não linear de três parâmetros foi ajustada aos dados para comparações entre os caminhos.

A amplitude do potencial pós-sináptico também aumentou com a amplitude do sumidouro de corrente. As respostas sinápticas às entradas tálamo-corticais e cortico-corticais foram medidas durante as condições de controle, isoflurano e recuperação. As respostas pós-sinápticas dos estímulos somatostatina e córtico-corticais e os sumidouros de corrente evocada foram suprimidos em condições de isoflurano.

Ao preparar as fatias do cérebro, manter a saúde do tecido é fundamental. É importante manter o tecido fresco durante todo o procedimento de corte, trabalhando rapidamente sem danificar o tecido. As gravações extracelulares multicanal podem ser pós-processadas de várias maneiras.

Por exemplo, a filtragem passa-alta do sinal de banda larga isola a atividade de pico da população, enquanto os cálculos de densidade de fonte atual destacam a atividade sináptica. Juntas, essas técnicas nos permitiram explorar os efeitos anestésicos em componentes isolados específicos de circuitos corticais, fornecendo informações sobre os mecanismos subjacentes à perda de consciência in vivo.