Name: Abordagens Quantitativas para Pontuação in vivo Neuronal Aggregate e Extrusão organela em Grandes Vesículas Exofer em C. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda métodos quantitativos para pontuar exóferos neuronais in vivo em C. elegans usando microscopia de fluorescência. Esta abordagem permite estudar a eliminação de agregados celulares e mecanismos de doenças neurodegenerativas.

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Reconhecemos as seguintes subvenções do NIH: R01AG047101 e R37AG56510. Membros dos laboratórios Driscoll e Grant contribuíram extensivamente para o desenvolvimento e ajuste fino dos protocolos descritos, com experimentos rigorosos e forte comunicação.

<ol><li>Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Spread+of+Protein+Aggregates+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).</li>
<li>Davis, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+degradation+of+axonal+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular degradation of axonal mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).</li>
<li>Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Know+No+Boundaries%3A+Mechanisms+and+Functions+of+Intercellular+Mitochondrial+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107(2016).</li>
<li>Stahl, P. D., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Exosomes+and+Microvesicles+Integrators+of+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%2C+Md.%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis.</a> Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).</li>
<li>Melentijevic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-elegans+neurons+jettison+protein+aggregates+and+mitochondria+under+neurotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress.</a> Nature. 542 (7641), 367(2017).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+a+prion+domain+from+cell-to-cell+by+vesicular+transport+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 9 (3), 1003351(2013).</li>
<li>Tyson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+animal+model+defines+genetic+contributions+for+neuron-to-neuron+transfer+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).</li>
<li>Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+neuronal+huntingtin+aggregates+to+phagocytic+glia+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain.</a> Nature Communications. 6, 6768(2015).</li>
<li>Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+wastes+are+extracellularly+disposed+by+excretosomes%2C+nanotubes+and+exophers+in+mouse+HT22+cells+through+an+autophagic+vesicle+clustering+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism.</a> bioRxiv. 10 (1), (2019).</li>
<li>Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia-reoxygenation+regulates+mitochondrial+dynamics+through+the+hypoxia+response+pathway%2C+SKN-1%2FNrf%2C+and+stomatin-like+protein+STL-1%2FSLP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2.</a> PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+green+fluorescent+protein%3A+probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).</li>
<li>Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+sensory+cilia+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li>
<li>Weicksel, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+that+disrupts+a+key+event+during+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PloS One. 13 (3), 0193989(2018).</li>
<li>Toth, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+sprouting+and+synapse+deterioration+in+the+aging+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).</li>
<li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li>
<li>Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+dsRNA+feeding+libraries+to+generate+robust+loss-of-function+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50693(2013).</li>
</ol>

A caracterização dos mecanismos moleculares in vivo de eliminação de organelas agregadas e organelas na forma de grandes esferoféricos está em sua infância. Questões quanto à designação de cargas para expulsão, à coleta polarizada dessas cargas dentro da cela, à regulamentação da decisão de geração de exófilos, ao maquinário que media extrusões e à interação das exófilos com as máquinas degradativas em uma cela vizinha. Além disso, a visualização in vivo de conexões tubulares que podem passar materiais biológicos que incluem cálcio, agregados e mitocôndrias é interessante e subestudada biologia por si só. Questões de por que certas células são mais propensas a exopher produção do que outras também não são resolvidas, mas podem começar a ser geneticamente dissecadas com as abordagens descritas neste protocolo.
Descritas detalhadamente neste protocolo estão as abordagens para alcançar a pontuação reprodutível da produção de exóferos, com atenção à distinção de exóferos de somas celulares próximas, tempo de análises para capturar o pico de produção de exóferos e controle rigoroso das condições de crescimento para eliminar tensões não intencionais que podem modular níveis de exóferos. Tanto a distinção do grande exofer, quanto a "noite estrelada" dispersão na hipodermis circundante pode ser quantificada como evidência da produção de exóferos. Dito isto, os neurônios que expressam mCherry em condições basais estão mais frequentemente associados com 5-25% dos neurônios de um tipo específico produzindo uma exófia. A introdução controlada de condições de estresse poderia ser aplicada para aumentar a produção de exófação até 90% dos neurônios que produzem extrusões, particularmente úteis para telas genéticas ou farmacológicas para modificadores.
Na doença neurodegenerativa humana, grandes agregados podem ser transferidos de neurônios doentes para células vizinhas para promover a disseminação patológica. O mecanismo de exófero pode ocorrer através de um mecanismo conservado usado para extrusão agregada através de filos. Definir as moléculas in vivo que melhoram a eficiência desse processo (considerado controle mais eficaz da proteostase) ou bloqueiam pode ser aproveitado para influenciar o desenho de novas estratégias de combate a múltiplas doenças neurodegenerativas. Como tal, o protocolo descrito aqui poderia ser usado para telas de mutagênese genética clássica, telas RNAi em todo o genoma que sistematicamente derrubam genes para identificar melhoradores e supressores, ou para estudos de intervenção medicamentosa que identificam modificadores farmacológicos candidatos desse processo. A abordagem é simples, embora um pouco trabalhosa. As exóferas são tão grandes que podem ser vistas com um microscópio dissecando alta ampliação. Ainda assim, os neurônios C. elegans são relativamente pequenos e olhar para suas organelas ou suas membranas requerem imagens confocal de maior potência e é um processo lento. Opções para maior rendimento podem envolver abordagens de imagem de alto conteúdo em formato de placa multi-bem.
A aplicação de uma abordagem padronizada para a pontuação exófia deve fundamentar uma dissecção genética concertada do processo pelo qual os neurônios podem organizar e eliminar detritos celulares.

Os desafios neurotóxicos de agregados e mitocôndrias disfuncionais têm sido considerados intrínsecos por células, mas mais recentemente ficou claro que proteínas da doença humana desativadas originárias de um neurônio também podem se espalhar para células vizinhas, promovendo a patologia1. Da mesma forma, mitocôndrias mamíferas podem ser enviadas da célula de sua produção original para degradação transcelular2 ou para resgate de populações mitocondriais em células vizinhas desafiadas3. Vesículas de vários tamanhos têm sido geralmente observadas para transferir materiais celulares para células vizinhas ou para o ambiente fluido4. Algumas vesículas extrudadas se aproximam do tamanho da soma neuronal média (média do neurônio de toque soma ~ 6 μm) e podem acomodar grandes agregados e organelas.
Um exemplo marcante de grande extrusão vesícula que pode transportar agregados de proteínas e organelas ocorre em C. elegans touch receptor neurônios que expressam um alto número de cópia repórter construir codificação de um mCherry5propenso à agregação nociva, resistente à degradação . Extrusões dos neurônios sensíveis ao toque, chamados exophers, têm ~4 μm de diâmetro médio, incluem seletivamente mCherry ou outros agregados, e são entregues diretamente na hipodermis vizinha, que normalmente envolve os neurônios receptores de toque. A hipoderme tenta degradação à base de lysosome, mas alguns conteúdos não digestíveis, como agregados mCherry, podem ser reinteressados pela hipoderme no pseudocoeloma cheio de fluidos do animal, a partir do qual o mCherry pode ser tomado por células remotas de catadores chamadas coelomocitos para armazenamento a longo prazo(Figura 1, Figura 2)5.
As grandes vesículas extrudadas extrudadas deixam a célula cercada pela membrana plasmática do receptor de toque e podem conter proteínas agregadas da doença humana, mitocôndrias e lisosomos. O processo de produção de exopher parece envolver a classificação de espécies potencialmente tóxicas (por exemplo, um mCherry expresso propenso à agregação é segregado de proteínas solúveis e inofensivas como o GFP que permanece principalmente na soma neuronal). Dessa forma, a expulsão direcionada das entidades ameaçadoras é realizada pelo neurônio5. Um desafio de proteostase, como o estresse induzido pelo knockdown da autofagia, inibição proteasome mediada por MG132, ou expressão transgênica de proteínas de doenças humanas, como a poliglutamina expandida Q128 associada à doença de Huntington ou o fragmento implicado pela doença de Alzheimer Aβ1-42,pode aumentar o número de neurônios que produzem exófatos5.
Como os exófilos foram documentados recentemente, o que se sabe de sua descrição de méritos biológicos. Exóferos foram descobertos em, e são os mais bem estudados em, C. elegans touch receptor neurônios. Existem seis neurônios de toque mecanosensoriar C. elegans que têm corpos celulares distribuídos ao redor do corpo (Figura 3A) e são chamados de células microtúbulas porque sua ultraestrutura apresenta 15 microtúbulos de perfil. Os neurônios do receptor de toque são o AVM anterior (neurônio microtúbulo ventral anterior), ALMR e ALML (neurônios microtúbulos laterais anteriores direita e esquerda), o PVM mais central (neurônio microtúbulo ventral posterior) e o PLMR e PLML posteriores (neurônios microtúbulos laterais posteriores direito e esquerdo) na cauda. Curiosamente, os neurônios receptores de seis toques produzem exófações em taxas diferentes, apesar de expressarem o mesmo transgene ofensivo(Figura 3C). Dos seis neurônios receptores de toque mecanosensorial, o neurônio ALMR sofre exofergênese com mais frequência do que os outros neurônios sensíveis ao toque. A quantitação dos números exóferos dos neurônios sensíveis ao toque é, portanto, geralmente estabelecida por foco na ALMR.
Exofergênese é um processo dinâmico que normalmente começa com o inchaço do citoplasma neuronal (Figura 1A-B). O conteúdo celular, organelas ou agregados proteicos são coletados para um lado da soma neuronal, mais comumente na extremidade posterior do neurônio ALMR (longe do neurite projetando), formando um domínio pré-exopher (PED) (Figura 1B). A saliência inicial é observada à medida que o PED começa a projetar para fora, formando um broto saliente reconhecível. O broto tardio é definido quando o diâmetro mais largo do domínio pré-exopher é aproximadamente 1/3 maior do que o diâmetro da constrição do pescoço soma-exopher(Figura 1C). Exóferos podem ser ejetados em quase qualquer direção da soma, mas a maioria dos exóferos sai posteriormente do corpo celular e permanece aproximadamente no mesmo plano focal que a soma originária.
O exopher pode se afastar da soma originária à medida que o pescoço do broto se estreita em um filamento fino. Exóferos podem permanecer ligados à soma através deste filamento (Figura 1D, seta) e podem mais tarde se desvincular. Conteúdos celulares como cálcio, agregados e mitocôndrias podem ser transferidos através deste filamento para a esferoferaanexada 5, embora a maior parte do material extrudado seja colocada no compartimento exófero pelo evento de brotação maciça. Os exóferos são considerados maduros quando não há tubo de conexão visível ou filamento fino e a esfófera é totalmente separada da soma de envio(Figura 1E).
Exofers produzidos por C. elegans tocam neurônios imediatamente encontram a hipoderme, o tecido que envolve o neurônio de toque. Mais comumente, a vesícula exófação parece viajar dentro da hipodermes posteriormente em direção à cauda, e pode ser bastante distante da soma antes que o conteúdo exopher apareça alvo de degradação (por exemplo, a distância pode ser ~100 μm de distância da soma (Figura 1F).). A vesícula exófé fluorescente se divide em muitas vesículas menores dentro da hipodermes, assumindo uma aparência chamada "noite estrelada"(Figura 1G e Figura 2). No estágio da "noite estrelada", material fluorescente pontual pode ser observado espalhado pelo siníntécio hipodérmico em muitos pontos menores de fluorescência em comparação com o exoferimento solitário original. A noite estrelada pode parecer pontual sob baixa ampliação e com maior ampliação, pode parecer pontual e/ou em rede dentro da hipodermite. O sinal fluorescente da noite estrelada é tipicamente mais fraco que o exopher e a fluorescência expressa neuronalmente(Figura 2B-C). Acredita-se que a dispersão do mCherry em muitas vesículas pontuadas envolva a maturação e fusão com a rede endossomal/liososômica da célula hipodérmica. Alguns materiais exópher são provavelmente degradados na rede hipodermal lysosomal, mas espécies residuais resistentes à degradação (como agregados mCherry) são jogadas para fora da hipodermese no pseudocoelom, um compartimento fluido que pode conter detritos celulares. O material fluorescente é posteriormente acolhida por células remotas de carniceiros chamadas coelomócitos(Figura 2C),que podem concentrar, armazenar e tentar novamente a degradação do mCherry.
O fenômeno da extrusão e transferência agregada aparece conservado em filos, tendo sido relatado em modelos genéticos como C. elegans5,,6,7 e D. melanogaster8,9, bem como em múltiplos modelos de mamíferos. Extrusões semelhantes a exófias foram relatadas para células de mamíferos10, uma observação sugerindo que mecanismos conservados podem estar por trás da expulsão agregada e organela. A produção de exófação pode, portanto, ser um mecanismo conservado do manejo de detritos celulares que constitui um ramo fundamental, mas anteriormente não reconhecido, de proteostase neuronal e controle de qualidade mitocondrial, que, quando desequilibrado, pode contribuir ativamente para a doença neurodegenerativa. Identificação das moléculas envolvidas na discriminação e triagem de detritos, transporte para um local subcelular distinto, extrusão, formação/cissão da conexão tubular que liga a soma e exoferimento tardio, e o reconhecimento da grande vesícula extrudada para degradação remota por uma célula vizinha permanecem para trabalhos futuros. Estudos em modelos de nematoide e mosca serão criticamente importantes para definir mecanismos de coleta e transferência de organelas agregadas e organelas, utilizando abordagens genéticas imparcial e poderosas ferramentas biológicas celulares oferecidas por esses modelos para identificar moléculas participantes no contexto fisiológico.
Os primeiros passos críticos na decifração de mecanismos operacionais na biologia exófia envolvem a definição de protocolos para quantificação in vivo exopher reproduzível. O modelo C. elegans oferece uma vantagem particular para tais esforços, uma vez que o corpo é transparente e exóferos podem ser facilmente observados quando contêm proteínas fluorescentes marcadas ou organelas. Os exófatos foram relatados como gerados por C. elegans neurônios dopaminérgicos PDE e CEP, neurônios sensoriais ASE e ASER, e neurônios anfíides de preenchimento de corantes5. Como as exófações produzidas pelos neurônios receptores de toque são melhor caracterizadas, o foco aqui é o uso de neurônios sensíveis ao toque para análise exófia. No entanto, a abordagem básica pode ser aplicada para medir a produção de exóferos de qualquer célula. Protocolos para detectar e quantificar exófatos produzidos por C. elegans touch receptor neurônios que expressam transgenicamente proteína mCherry são delineados, com ênfase em cargas que podem ser monitoradas e restrições temporais na pontuação. Este artigo define abordagens para a identificação in vivo exopher, e a quantitação de condições ambientais e genéticas que modulam a produção de exóferos. Os protocolos enfatizam a atenção crítica às constantes condições de não estresse para a determinação da produção de exófias de linha de base e para comparações entre genótipos.

<table><tbody><tr><td>Câmera CMOS 95B Scientific</td><td>Photometrics Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &mu; L pontas de baixa retenção</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL pipeta sorológica</td><td>Appleton Woods</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L pontas de baixa retenção</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>hipoclorito de sódio a 13%</td><td>Acros Organics</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Frascos erlenmeyer de 2 L</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 25 mL</td><td>Appleton Woods</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; L ponteiras de baixa retenção</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 50 mL</td><td>Appleton Woods</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2'-desoxiuridina 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri estéreis de 9 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>etanol absoluto</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Cepa C. elegans tipo selvagem</td><td>Fornecido por CGC</td><td>N2</td><td>Cepa C. elegans</td></tr><tr><td>cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>colesterol</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>E. coli cepa OP50</td><td>Fornecido por CGC</td><td>Op50</td><td>cepa E coli</td></tr><tr><td>FBS10 Microscópio padrão</td><td>Meyer Instruments</td><td>KSC 410-1-100-1</td><td>FBS10 Padrão com base de placa, cabeça trinocular 100/100 e</td></tr><tr><td>pipeta de vidro Flip zoom 270 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50255</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher científico</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Inoculando espalhadores</td><td>Fisher Scientific</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>LB meio cápsulas</td><td>MP biomedicals</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>LDI &ndash; Iluminador de diodo laser</td><td>89 North</td><td></td><td></td></tr><tr><td>levamisole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16595-80-5</td><td></td></tr><tr><td>M4 multipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Incubadora de agitação padrão</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td>INFO28573</tr><tr><td>Nalgene 1 L Potes de centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P10</td><td>Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>pipeteboy 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de poliestireno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00131491</td><td></td></tr><tr><td>RC5C mais centrífuga montada no chão</td><td>Sorvall</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de citologia em anel reutilizáveis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22037242</td><td></td></tr><tr><td>SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>GFP expresso em neurônios de toque</td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S / 4880/53</td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 Autoclave</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermofisher scientific</td><td>28313</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit</td><td>CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZB4065 bzIs166 [Pmec-4mCherry]</td><td>contrato Driscoll lab</td><td></td><td>mCherry expresso em neurônios de toque</td></tr><tr><td>ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>Q128 expresso em neurônios de toque</td></tr><tr><td>ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>mitoROGFP expresso em neurônios</td></tr> <tr><td>de toqueZB4528 bzIs166 [Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td>contrair marcador de autofagia <td>de laboratório</td><td></td> Driscoll <td>expresso em neurônios de toque</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

abordagens quantitativas para pontuação in vivo neuronal aggregate e extrusão organela em grandes vesículas exofer em c. elegans

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

A toxicidade de proteínas mal dobradas e disfunção mitocondrial são fatores fundamentais que promovem o declínio neuronal funcional associado à idade e a doença neurodegenerativa entre as espécies. Embora esses desafios neurotóxicos tenham sido considerados por muito tempo intrínsecos, evidências consideráveis agora sustentam que proteínas de doenças humanas desdobradas originárias de um neurônio podem aparecer em células vizinhas, um fenômeno proposto para promover a disseminação da patologia em doenças neurodegenerativas humanas.
C. elegans neurônios adultos que expressam proteínas agregantes podem extruir grandes vesículas cercadas por membrana (~4 μm) que podem incluir a proteína agregada, mitocôndrias e lisósmosomos. Essas grandes vesículas são chamadas de "exóferas" e são distintas de exosóis (que são cerca de 100x menores e têm biogênese diferente). A expulsão de detritos celulares em exófações pode ocorrer por um mecanismo conservado que constitui um ramo fundamental, mas anteriormente não reconhecido, de proteostase neuronal e controle de qualidade mitocondrial, relevante para processos pelos quais agregados se espalham em doenças neurodegenerativas humanas.
Embora os exóphers tenham sido estudados principalmente em animais que expressam mCherry transgênicos de alta cópia dentro dos neurônios de toque, esses protocolos são igualmente úteis no estudo da exofergênese usando organelas fluorescentes marcadas ou outras proteínas de interesse em várias classes de neurônios.
Descritas aqui estão as características físicas dos exophers de C. elegans, estratégias para sua detecção, critérios de identificação, tempo ideal para a quantitação e protocolos de crescimento animal que controlam para tensões que podem modular os níveis de produção exopher. Juntos, os detalhes dos protocolos aqui descritos devem servir para estabelecer um padrão de análise quantitativa de exóferos entre laboratórios. Este documento busca servir como um recurso no campo para laboratórios que buscam elaborar mecanismos moleculares pelos quais as exófias são produzidas e pelas quais as exófilos são reagidas por células vizinhas e distantes.

Este protocolo descreve abordagens para detecção e quantitação de grandes extrusões agregadas e/ou organelas (~4 μm) produzidas por células C. elegans na forma de exóferas ligadas à membrana. Descrevemos tensões, condições de crescimento, critérios de pontuação, considerações de tempo e microscopia necessárias para facilitar a dissecção desse mecanismo de expulsão de detritos.

Abordagens Quantitativas para Pontuação in vivo Neuronal Aggregate e Extrusão organela em Grandes Vesículas Exofer em C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Caracterizamos os mecanismos in vivo de extrusão agregada e organela dos neurônios através de um processo chamado exofergênese, biologia mal compreendida que é provavelmente relevante para a propagação da patologia da doença neurodegenerativa. Essas abordagens são necessárias para alcançar a pontuação reprodutível de extrudados extrudados extrudados ex-neurônios e demonstrar uma plataforma para a dissecção mecanicista da eliminação do lixo celular via transferência neuronal para células vizinhas. Definir os mecanismos in vivo de como os neurônios ejetam agregados pode realmente influenciar o desenho de novas estratégias para auxiliar no tratamento de condições neurodegenerativas humanas.Para condições basais, casa C.Elegans da mesma idade biológica a uma temperatura constante de 20 graus Celsius. Para imagens vivas da dinâmica intracelular e características da exoferênese, coloque até 20 animais em uma almofada de ágaros em uma lâmina de microscópio de vidro, e imobilize os animais. Coloque cuidadosamente um deslizamento de cobertura sobre os vermes paralisados e coloque o slide no palco de um microscópio de fluorescência confocal.Use um objetivo de 10 a 40x para identificar o plano Z desejado em Brightfield, tomando notas do posicionamento do verme, da orientação da cauda da cabeça e da localização da vulva, que são marcos para posterior identificação neuronal e exoferta. Hospedando-se no mesmo plano Z, mude para fluorescência de campo largo visualizando em 10 a 40x para o repórter citosolico escolhido, e role dentro do eixo Z para observar a profundidade do animal e a expressão de fluorescência no plano focal. A cabeça terá um anel nervoso fluorescente, e a cauda mais pontuda conterá uma a duas somas visíveis do neurônio lateral posterior.Uma ampliação mais alta com uma lente 63x pode ajudar a identificar o anel nervoso, processos neuronais e corpos somados. Primeiro é útil identificar o anel nervoso localizado na cabeça dos processos neuronais animais e laterais. Para isso, comece pela cabeça do verme e role lentamente pelo eixo Z para identificar o plano do anel nervoso onde os processos neuronais estão ligados.Uma vez identificado o anel nervoso, na visão de fluorescência seguem o processo neuronal anexado lateralmente na direção posterior em direção à vulva, onde a soma será aparente. Uma vez que o corpo ou corpo redondo soma estão em foco, é importante identificar todos os neurônios próximos. Para identificação de neurônios sensíveis ao toque, primeiro encontre a soma ALML, ALMR e AVM, que devem ser os sinais mais brilhantes e marcados por um corpo celular redondo no final do processo.Uma vez localizada a soma neuronal mais focalada, use a célula AVM, uma célula ventral, para ajudar a atribuir a orientação. Se o neurônio AVM está no mesmo plano que a ALM, então o animal está descansando de lado e o neurônio lateral é o ALMR. Se o neurônio AVM não estiver no mesmo plano que a ALM em questão, o neurônio de toque mais próximo do plano focal é o neurônio ALML.Também útil é identificar o neurônio PVM, que é um neurônio de toque ventral localizado perto da cauda. O plano focal do PVM indicará se o neurônio de toque anterior é o ALML ou ALMR. Se a ALM em questão está no mesmo plano que o PVM, então o neurônio de toque observado é o neurônio ALML.Depois que a ALM mais em foco foi identificada e designada, é importante determinar as posições dos outros corpos soma perto da área de interesse e em todos os planos Z, a ponto de não confundi-los com exophers. Uma vez localizado o neurônio de toque de interesse, o ALMR ou ALML, inspecione o neurônio em busca de grandes domínios de exófia saliente, grandes o suficiente para ser considerado uma exoferta de botões, que é pelo menos um quinto do tamanho da soma originária. Se não for observado nenhum domínio bud ou exopher, inspecione ainda mais a soma neuronal para um filamento fino anexado emanando do corpo soma.Exofers anexados tendem a ser localizados mais perto da soma originária e em um plano Z semelhante. Para identificar uma exofere não acontecido, procure proteínas fluorescentes expelidas concentradas, que muitas vezes são mais brilhantes que a soma. Embora retratado aqui, há uma grande exófia.Pode haver mais de uma entidade fluorescente originária de uma única soma. Procure por exofers não ligados em diferentes planos focais e na região lateral distante de onde a soma originária foi encontrada. As exóferas normalmente se projetam longe da soma em uma direção posterior do processo neuronal.Verifique se há objetos esféricos grandes que não estão posicionados e identificados como somas neuronais. Embora os exóferos sejam tipicamente estruturas físicas, elas podem se degradar com o tempo, adquirindo uma forma mais irregular. Procure a presença de eventos noturnos estrelados e, por exemplo, de múltiplos eventos exóferos.Para evitar confundir e fora do avião soma com um exopher, é fundamental identificar todos os corpos soma próximos, mesmo somas fora de foco no início da observação. Uma soma estendida ou pontiaguda pode ser observada, mas uma extensão sem um local de constrição claro não deve ser pontuada como uma exófia. Rejeite pequenos botões resolvidos que não atinjam um quinto do tamanho da soma na quantificação de eventos exopher.Embora os neurrites maduros possam se estender dramaticamente com a idade, e as proteínas fluorescentes podem migrar para o fim distal de tais estruturas, não conte os crescimentos neuritas como exófatos. Para identificar entidades fluorescentes que não são exofers, certifique-se de excluir qualquer autofluorescência, que pode ser confundida com detritos vesiculares noturnos estrelados sob fluorescência de campo largo. Para excluir sinais fluorescentes embrionários, alternar entre fluorescência e iluminação de campo brilhante, e verificar a associação do sinal com ovos dentro do útero.Esta tabela fornece um resumo de diferentes repórteres fluorescentes expressos por neurônios de toque que foram usados para monitorar a produção de exopher. As cargas que são conhecidas por serem extrudadas em exóferos incluem agregados como o Q128, uma fusão de repetições de poliglutamina expandidas por Huntington humanos, lysososomes GFP marcado com proteína de membrana associada lysomal, e mitocôndrias marcadas com GFP localizado em matriz. O GFP citoplasmado não é fortemente expelido, e é preferencialmente retido na soma, embora o GFP possa ser usado para visualizar fracamente exofers.Em geral, a produção de exópher pelo mCherry expresso em neurônios da ALMR em condições basais começa no primeiro dia da idade adulta e varia de cerca de cinco a 25% das ALMRs examinadas dentro do principal período de tempo de produção exopher do primeiro dia a três adultos. Tensões particulares e perturbações genéticas podem aumentar muito a produção de exóferos dentro dos neurônios ALMR. É crucial localizar todos os neurônios próximos antes de inspecionar o neurônio de interesse e a área circundante para domínios exopher, exophers intactos ou eventos noturnos estrelados.Quando você está confortável com a identificação manual de exophers, métodos de throughput aprimorados para triagem em larga escala usando imagens de alto conteúdo podem ser empregados, permitindo análise completa do genoma e dissecção de exofergênese mecanicista.

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Research

JoVE Journal

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Abordagens Quantitativas para Pontuação in vivo Neuronal Aggregate e Extrusão organela em Grandes Vesículas Exofer em C. elegans

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