Um modelo pré-clínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusão e neuroinflamação

Este modelo pode ser utilizado para estudar as patologias associadas à contusão cerebral, incluindo hemorragia intracraniana, toxicidade do ferro, morte de neurônios, lesão axonal, déficit neurológico e inflamação neural. A principal vantagem dessa técnica é que a gravidade do dano cerebral pode ser facilmente controlada pela manipulação dos parâmetros bioquímicos, como velocidade e morte do impacto no dispositivo CCI. A lesão de estilhaçamento cortical focal induzida por CCI é altamente reprodutível.

A técnica estereotáxica adequada e o procedimento de craniotomia são os principais determinantes na produção de lesão cerebral induzida por CCI estável e reprodutível. Em geral, o investigador novo no procedimento terá dificuldade em estabilizar o camundongo na estrutura esteriotexica e fazer a craniotomia apropriada. Demonstrando o procedimento estará a Sra. Jhih Shuan Lin, uma técnica de laboratório do meu laboratório.

Comece confirmando a falta de reflexo de beliscar o dedo do pé no animal para garantir que ele esteja devidamente anestesiado. Raspe a cabeça do mouse com um cortador elétrico na direção caudal a rostral. Mas não apare os bigodes.

Coloque o mouse na estrutura estereotáxica e insira cuidadosamente as barras auriculares nos canais auditivos, certificando-se de que a cabeça do mouse esteja estabilizada por ambas as barras auriculares igualmente. Mantenha a anestesia em um a 2% de isoflurano durante a cirurgia. Aplique vaselina em ambos os olhos para evitar o ressecamento durante a cirurgia.

Em seguida, use cotonetes estéreis para desinfetar a cabeça raspada com betadine seguido de etanol a 70%. Administre 100 microlitros de bupivacaína a 0,25% por via subcutânea com uma agulha de insulina de calibre 31 e massageie suavemente o local da injeção para melhor absorção. Faça uma incisão longitudinal ao longo da linha média do couro cabeludo com um bisturi ou tesoura.

Em seguida, use um hemostático para puxar a pele para o lado direito. Deixe o crânio exposto secar por um minuto. Em seguida, limpe qualquer sangue residual e tecidos no crânio com um cotonete estéril.

Verifique se a cabeça do animal está nivelada no plano horizontal e identifique os pontos anatômicos, Bregma e Lambda, marcando ambos os locais com um lápis. Certifique-se de que a cabeça do animal esteja nivelada na direção rostral-caudal, medindo as coordenadas Z de Bregma e Lambda. Use o mesmo procedimento para posicionar horizontalmente a cabeça.

Use uma agulha de insulina de calibre 31 para identificar o local da craniectomia. Defina a origem XY como Bregma e mova lateralmente a agulha três milímetros para a direita. Marque esta posição como o local da craniectomia e desenhe um círculo de quatro milímetros de diâmetro no crânio com um lápis.

Corte ao longo do círculo delineado a lápis com uma micro broca de alta velocidade com a trefina para criar um orifício aberto de quatro milímetros de diâmetro. Remova a aba óssea com uma pinça e guarde-a em solução salina normal gelada. Enxágue suavemente o orifício com solução salina antes de aplicar pressão na superfície do cérebro para parar o sangramento.

No dispositivo CCI, ajuste a ponta arredondada do pêndulo de 2.5 milímetros de diâmetro para um ângulo de 22.5 graus. Zere a ponta de impacto na superfície dural e defina os parâmetros de impacto na caixa de controle para uma velocidade de quatro metros por segundo e uma profundidade de deformação de dois milímetros. Retraia a ponta de metal.

Descarregue o pistão para gerar impactação no cérebro. Em seguida, coloque um cotonete estéril na área lesionada para parar o sangramento. Substitua o retalho ósseo e prenda-o com cimento dentário.

Feche o couro cabeludo com adesivo tecidual. Coloque o mouse sob a lâmpada de calor em uma gaiola de recuperação limpa com roupa de cama até a recuperação total. A técnica estereotáxica adequada e o procedimento de craniectomia são os principais determinantes na produção de lesão cerebral induzida por CCI estável e reprodutível.

Um procedimento de craniectomia ideal causaria lesão histológica mínima no cérebro operado simuladamente. Alterações no dano cerebral e perda do corpo caloso foram observadas nos dias 1, 3, 7 e 28 após a ICC. Além disso, atrofia cerebral unilateral no lado da contusão foi observada no dia 28 pós-CCI.

A neuroinflamação foi revelada pela micróglia ativada positiva para Iba1 e acúmulo de macrófagos ao redor da borda da área de contusão. A hemorragia intraparenquimatosa também foi detectável pela coloração positiva para Ly76 do primeiro ao sétimo dia pós-CCI. Uma mistura de glóbulos vermelhos com morfologia celular rompida e intacta foi observada no sétimo dia pós-ICC, sugerindo que as hemácias foram lisadas neste estágio.

Este fenômeno foi consistente com a observação de que a deposição de ferro férrico foi detectável na região de contusão dos dias sete a 28 pós-CCI. Microglia e macrófagos ativados foram observados no estriado longe do local da contusão dos dias três a 28 pós-CCI, indicando lesões do corpo caloso e estriado. Essa técnica abre caminho para o investigador explorar ainda mais a interação neuroinflamatória induzida por hemorragia cerebral por meio da compreensão da resposta das células imunes, como a microglia, após a contusão por hemorragia.