Name: Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a medir a absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético isolado de camundongos. Este método ex vivo permite avaliar com precisão o metabolismo da glicose livre de fatores sistêmicos.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do Conselho Dinamarquês de Pesquisa Independente - Ciências Médicas (FSS8020-00288B) e da Fundação Novo Nordisk (NNF160C0023046). Este trabalho também foi apoiado por uma bolsa de pesquisa para Rasmus Kjøbsted da Academia Dinamarquesa de Diabetes, que é financiada pela Fundação Novo Nordisk, número de subvenção NNF17SA0031406. Os autores agradecem Karina Olsen, Betina Bolmgren e Irene Bech Nielsen (Departamento de Nutrição, Exercício e Esportes da Faculdade de Ciências da Universidade de Copenhague) por sua assistência técnica qualificada.

Os autores não têm nada a revelar

A regulação intacta da absorção de glicose no músculo esquelético é importante para preservar a saúde geral1. Assim, a investigação da absorção de glicose muscular muitas vezes serve como leitura primária ao avaliar várias intervenções que alteram a saúde. Aqui descrevemos um método ex vivo para medir a absorção de glicose em soleus isolado e incubado e músculo EDL de camundongos em resposta à insulina e contrações eletricamente induzidas. O método é rápido e confiável e permite um controle precis...

O músculo esquelético possui a capacidade de extrair grandes quantidades de glicose do espaço extracelular em resposta à insulina e ao exercício. Isso ajuda a manter a homeostase de glicose do corpo inteiro e garante a oferta de glicose em tempos de alta demanda energética. Uma vez que a regulação intacta da absorção de glicose muscular esquelética tem se mostrado importante para a saúde geral e o desempenho físico 1,2, as medidas de absorção de glicose muscular durante várias condições têm recebido muita atenção. Em humanos e animais, o grampo hiperinsulinemico-euglicícmico tem sido usado como técnica padrão-ouro para avaliar a sensibilidade à insulina in vivo 3,4. Em contraste com os achados obtidos a partir de um teste de tolerância à glicose oral, a técnica de grampo hiperinsulinem-euglicícica não requer função gastrointestinal intacta ou secreção de insulina do pâncreas e, portanto, permite que as respostas à insulina sejam comparadas entre indivíduos que apresentam variações na função gastro-intestinal e/ou pancreática. As medidas de absorção de glicose muscular in vivo durante o exercício em humanos têm sido realizadas com frequência desde a décadade 1960 5. Primeiro pelo uso de técnicas de equilíbrio arteriovenoso6 e posteriormente pelo uso de tomografia de emissão de pósitrons (PET) em combinação com um pósitron emissor de glicose análogo por exemplo 18F-Fluoro-deoxy-glicose7. Em roedores, a absorção de glicose muscular estimulada pelo exercício in vivo é tipicamente realizada pelo uso de análogos de glicose radioativo ou estável rotulados 8,9,10.
Um método complementar às medidas de absorção de glicose muscular in vivo, é isolar e incubar pequenos músculos de roedores e, posteriormente, medir a absorção de glicose usando análogos de glicose radioativos ou estáveisrotulados 11,12,13. Este método permite quantificação precisa e confiável das taxas de absorção de glicose no músculo esquelético maduro e pode ser realizado na presença de várias concentrações de insulina e durante a contração provocada por estimulação elétrica. Mais importante, as medidas de absorção de glicose em músculo esquelético isolado e incubado são relevantes na investigação do fenótipo metabólico muscular dos camundongos que passaram por diversas intervenções (por exemplo, nutrição, atividade física, infecção, terapêutica). O modelo muscular esquelético isolado também é uma ferramenta adequada para testes compostos farmacológicos que podem afetar a absorção de glicose por si só e/ou modificar a sensibilidade à insulina12,14. Desta forma, a eficácia dos compostos projetados para regular o metabolismo da glicose muscular pode ser testada e avaliada em um meio altamente controlado antes do teste in vivo subsequente em modelos pré-clínicos de animais.
Em algumas condições, a viabilidade metabólica pode representar um desafio no sistema de modelo muscular esquelético isolado e incubado. De fato, a falta de um sistema circulatório nos músculos incubados implica que a entrega de substratos (por exemplo, oxigênio e nutrientes) depende totalmente da simples difusão entre as fibras musculares e o ambiente circundante. Em relação a isso, é importante que os músculos incubados sejam pequenos e finos e, portanto, representem menos uma barreira para a difusão de oxigênio durante a incubação15. Especialmente durante incubações prolongadas por várias horas, estados hipóxicos podem se desenvolver devido ao suprimento insuficiente de oxigênio, resultando em esgotamento de energia muscular15. Embora vários marcadores de viabilidade metabólica no músculo de rato incubado tenham sido relatados anteriormente, juntamente com a identificação de variáveis importantes que ajudam a manter a viabilidade muscular do rato15, uma avaliação abrangente da viabilidade metabólica em pequenos músculos de camundongos incubados ainda é justificada. Assim, atualmente, o teor de glicogênio tem sido usado principalmente como marcador de viabilidade metabólica no músculo esquelético do camundongo incubado16,17.
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para medir a absorção de glicose basal, insulina e contração em sola isolada e incubada e músculo EDL de camundongos usando radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glicose e [14C]mannitol como um marcador extracelular. No presente estudo, a absorção de glicose foi medida durante um período de 10 minutos e o método é apresentado com o uso de concentrações de insulina submaxisticamente e maximamente eficazes, bem como um único protocolo de contração. No entanto, os protocolos aqui descritos podem ser facilmente modificados no que diz respeito ao tempo de incubação, daagem de insulina e protocolo de estimulação elétrica. Além disso, fornecemos uma caracterização completa de vários marcadores de viabilidade metabólica em soleus incubado e músculo do rato EDL. Os resultados indicam que a suplementação de glicose no tampão de incubação é essencial para preservar a viabilidade metabólica do músculo incubado por 1 hora.

<table><tbody><tr><td>[14C]D-manitol</td><td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td><td>ARC 0127</td><td></td></tr><tr><td>[3H]2-desoxi-D-glicose&nbsp;</td><td>Produtos Químicos Radiomarcados Americanos, Inc.</td><td>ART 0103A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma</td><td>D8375</td><td></td></tr><tr><td>4-0 USP sutura de nylon cirúrgica não estéril</td> Harvard <td>Apparatus</td><td>51-7698</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin/HRP (Conjugado)</td> <td>DAKO</td><td>P0397</td><td>Usado para detectar o anticorpo Akt2 da proteína ACC</td></tr><tr><td></td><td>Sinalização celular</td><td>3063</td><td></td></tr><tr><td>AMPK&alpha; 2 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19131</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>benzamidina</td><td>Sigma</td><td>B6505</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1020831000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de calibração (força)</td><td>Dinamarquês Myo Technology A/S</td><td>300041</td><td></td></tr><tr><td>Quimioluminescência</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glicose</td><td>Merck</td><td>1084180100</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Programa de coleta de dados</td><td>Software National Instruments</td><td>LabVIEW versão 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise</td><td>Visking</td><td>DTV.12000.09 Tamanho No.9</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem digital</td><td>BioRad</td><td>ChemiDoc MP</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma EDS</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de Pulso Elétrico</td><td>Digitimer</td><td>D330 Sistema</td><td></td>MultiStim</tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td>Sigma G7757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7637</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Novo Nordisk</td><td>Actrapid, 100 IE/mL</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873025</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1058860500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Miografia de Tira Muscular</td><td>Dinamarquês Myo Technology A/S</td><td>Modelo 820MS</td><td></td></tr><tr><td>Na-Ortovanadato</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Na-Pirofosfato</td><td>Sigma</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Na-Piruvato</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106041000</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S1504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>VWR</td><td>27778260</td><td></td></tr><tr><td>pACC Ser212 anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>3661</td><td></td></tr><tr><td>pAkt Thr308 anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>9275</td><td></td></tr><tr><td>pAMPK Thr172 anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>2531</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsulfonilfluoreto Sigma</td><td></td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos de platina</td><td>Tecnologia dinamarquesa Myo</td><td>300145</td><td></td></tr><tr><td>pTBC1D4 Ser588 anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>8730</td><td></td></tr><tr><td>Contador de cintilação</td><td>Perkin Elmer</td><td>Tri-Carb-2910TR</td><td></td></tr><tr><td>Fluido de cintilação&nbsp;</td><td>Perkin Elmer 6013329</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análise estatística</td><td>Systat</td><td>SigmaPlot versão 14</td><td></td></tr><tr><td>TBC1D4 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab189890</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Merck</td><td>Milli-Q Referência A+ System</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

O músculo esquelético é um tecido responsivo à insulina e normalmente ocupa a maior parte da glicose que entra no sangue após uma refeição. Além disso, foi relatado que o músculo esquelético pode aumentar a extração de glicose do sangue em até 50 vezes durante o exercício em comparação com as condições de repouso. O aumento da absorção de glicose muscular durante o exercício e estimulação da insulina depende da translocação do transportador de glicose 4 (GLUT4) de compartimentos intracelulares para a membrana da superfície celular muscular, bem como fosforilação da glicose para glicose-6-fosfato por hexokinase II. Isolamento e incubação de músculos do camundongo como m. soleus e m. extensor digitorum longus (EDL) é um modelo ex vivo apropriado para estudar os efeitos da insulina e contração eletricamente induzida (um modelo para exercício) na absorção de glicose no músculo esquelético maduro. Assim, o modelo ex vivo permite a avaliação da sensibilidade à insulina muscular e possibilita a combinação da produção de força muscular durante a contração, garantindo o recrutamento uniforme de fibras musculares durante as medições da absorção de glicose muscular. Além disso, o modelo descrito é adequado para testes compostos farmacológicos que podem ter um impacto na sensibilidade à insulina muscular ou podem ser de ajuda ao tentar delinear a complexidade regulatória da absorção de glicose muscular esquelética.
Aqui descrevemos e fornecemos um protocolo detalhado sobre como medir a absorção de glicose estimulada por insulina e contração em preparações musculares isoladas e incubadas de soleus e EDL de camundongos usando radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glicose e [14C]mannitol como um marcador extracelular. Isso permite uma avaliação precisa da absorção de glicose no músculo esquelético maduro na ausência de fatores de confusão que possam interferir no modelo animal intacto. Além disso, fornecemos informações sobre a viabilidade metabólica do músculo esquelético do camundongo incubado sugerindo que o método aplicado possui algumas ressalvas sob certas condições ao estudar o metabolismo da energia muscular.

Como mostrado na Figura 2, as taxas de absorção de glicose basal foram semelhantes entre os músculos isolados soleus e EDL de camundongos fêmeas. Isso também foi relatado várias vezes antesde 12,13,19,20. A absorção de glicose aumentou em ~0,8 e ~0,6 dobra atingindo 12 e 9 μmol/g proteína/h no músculo soleus e EDL, respectivamente, ...

A regulação intacta da absorção de glicose muscular é importante para manter a homeostase de glicose corporal inteira. Este protocolo apresenta avaliação da absorção de glicose estimulada pela insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado ao delinear o impacto de várias intervenções fisiológicas em todo o metabolismo da glicose corporal.

Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

O modelo ex vivo é um método útil para avaliar o impacto de várias intervenções fisiológicas e compostos farmacológicos e captação de glicose muscular. Esta técnica permite a avaliação precisa da absorção de glicose no músculo esquelético do camundongo isolado na ausência de fatores de confusão que possam interferir em um modelo animal intacto. Antes de iniciar um experimento, ligue o sistema de biografia de tira muscular integrada e aqueça as câmaras a 30 graus celsius.Abra o software de coleta de dados e calibra os transdutores forçados para garantir a comparabilidade entre conjuntos de dados. Adicione quatro mililitros de meio de incubação basal de 30 graus celsius pré-aquecidos a cada câmara de incubação e certifique-se de que o meio esteja continuamente oxigenado com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Coloque o mouse na posição propensa em uma bandeja de dissecção e confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal.Em seguida, fixar uma única pata dianteira com uma agulha. Use uma tesoura para remover a pele da perna inferior até que o tendão de aquiles e a articulação do joelho estejam visíveis. Para dissecção do músculo soleus, conecte um único laço de sutura de 0,4 centímetros de diâmetro preparado a partir de uma peça de nylon cirúrgica não absorvível de 16 centímetros ao tendão de aquiles e fixar fórceps de peen no tendão de aquiles distally ao laço.Corte para liberar os músculos soleus e gastrocnemius da pata e deslize cuidadosamente as fórceps de peen através do rato para expor o músculo soleus. Fixar os fórceps de peen e colocar um segundo laço de sutura em torno do tendão proximal do músculo soleus. Corte o tendão proximal e disseque o sola, incluindo as duas alças de sutura anexadas livres do músculo gastrocnemius.Após a coleta, use os laços para fixar rapidamente o músculo soleus aos respectivos ganchos em uma das câmaras de incubação. Use fórceps para remover a fáscia que cobre o músculo tibialis anterior. Os tendões distais dos músculos tibialis anterior ou EDL devem ser brancos claros, visíveis e separados entre si.Corte o tendão da destilação do músculo tibialis anterior e disseca o músculo. Use fórceps para libertar suavemente o músculo EDL dos tecidos circundantes, deixando o músculo intacto sem cortar os tendões. Coloque laços individuais de sutura ao redor dos tendões destilados e EDL proximal.Quando os laços tiverem sido colocados, corte os tendões para liberar o músculo EDL com as alças de sutura presas e conecte rapidamente os laços aos ganchos na segunda câmara de incubação. Em seguida, ajuste a tensão de repouso de cada músculo para aproximadamente cinco mililitros e deixe os músculos se equilibrarem no meio por pelo menos 10 minutos antes de iniciar o experimento. Para medir a absorção de glicose estimulada pela insulina, substitua o meio de incubação basal nas câmaras pelo meio de incubação sem insulina, uma concentração de insulina submaximicamente eficaz, ou uma concentração de insulina extremamente eficaz para uma incubação de 20 minutos.Ao final do período de estimulação, substitua o meio de incubação por meio de incubação de glicose contendo uma concentração idêntica de insulina para uma incubação de 10 minutos. No final da incubação da captação de glicose, remova cuidadosamente os músculos das câmaras de incubação e lave as amostras em meio de incubação basal gelada. Após a lavagem, seque rapidamente os músculos no papel filtro e congele o tecido sem as alças de sutura em nitrogênio líquido.Em seguida, colete 100 microliters do meio de incubação de glicose de cada câmara para armazenamento de 20 graus celsius e análise de absorção de glicose muscular. Para medir a contração estimulada a absorção de glicose, coloque eletrodos de platina centralmente e em ambos os lados dos músculos dentro das câmaras de incubação, e inicie a contração muscular imediatamente após a substituição do meio de incubação basal por meio de incubação de glicose. Regisso da produção forçada de cada músculo incubado.Após 10 minutos, colete e congele suavemente os músculos como demonstrado, armazenando 100 alíquotas de microliter do meio de incubação de glicose de cada câmara para análise de absorção de glicose muscular, como demonstrado. Para determinar a sinalização miocelular por análise de manchas ocidentais no mesmo conjunto de amostras musculares, homogeneize cada amostra muscular congelada em 400 microliters de tampão de homogeneização gelada e gire a extremidade da amostra por uma hora a quatro graus celsius. Em seguida, colete o licate por centrifugação e meça a quantidade de proteína de interesse dentro de cada palete amostra de acordo com os protocolos padrão de análise de manchas ocidentais.Para medir a absorção de glicose em cada amostra, adicione 150 microliters de supernadante de cada amostra e 25 microliters de meio de incubação de glicose das câmaras de incubação correspondentes para separar frascos de contagem de cintilação líquida contendo três mililitros de fluido de cintilação líquida por frasco. Em seguida, carregue os frascos em um contador de cintilação líquida e meça a radioatividade de dois desoxicosglucose e manitol de acordo com as diretrizes do fabricante. Nesta análise representativa, as taxas de absorção de glicose basal foram semelhantes entre os músculos soleus e EDL isolados de camundongos fêmeas.A absorção de glicose aumentou nos músculos soleus e EDL em resposta às concentrações de insulina submaximicamente e maximamente eficazes. Além disso, tanto a insulina submaximal quanto a insulina máxima estimularam a absorção de glicose foram significativamente maiores no músculo soleus. Em contraste, a absorção induzida pela absorção de glicose foi significativamente maior no EDL em comparação com o músculo soleus.Aqui, pode-se observar a força muscular máxima produzida nos músculos soleus e EDL durante o período de estimulação de 10 minutos. Como esperado, o músculo EDL gerou mais força durante a parte inicial do período de estimulação, seguido por um declínio rápido mais tarde no período de estimulação. As concentrações submaximal e máxima de insulina induziram um aumento na fosforilação de Akt threonine 308 e TBC1D4 Serina 588, enquanto a contração induziu um aumento na fosforilação de AMPK Alpha threonine 172 e serina ACC 212.Nem insulina nem contração levaram a uma mudança no teor total de proteínas. Antes de tentar medir a absorção de glicose em músculos isolados do rato, é vital praticar minuciosamente a dissecção dos músculos soleus e EDL. Após a avaliação da absorção de glicose muscular, o restante do teor de proteína muscular pode ser usado para análises bioquímicas adicionais que possam elucidar as alterações observadas nas taxas de absorção de glicose.

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Biologia

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