Preparação de Microambientes de Matriz Extracelular Incapaz para avaliar especificação de fenótipo celular schwann

Este protocolo fornece uma plataforma de cultura celular onde as propriedades da matriz extracelular, como rigidez, composição de proteínas e morfologia celular podem ser precisamente controladas de forma econômica e fácil. O método é econômico e não requer treinamento especial ou instalações. Também é compatível com múltiplos métodos de quantificação celular, como coloração imunofluorescente e mancha ocidental.

Esta técnica fornece uma compreensão mecanicista da biologia celular de Schwann. Com informações adicionais sobre o projeto de biomateriais para a regeneração do sistema nervoso, ele pode ser aplicado a qualquer célula dependente de ancoragem. A parte mais desafiadora deste protocolo é a impressão de microcontatos.

Antes do início do protocolo, a impressão de microcontato no substrato utilizando um florescente para marcar a proteína para verificar visualmente a impressão final ao padrão. Comece misturando vigorosamente o elastômero base PDMS e os agentes de cura com uma ponta de pipeta até que as bolhas sejam dispersas homogêneamente dentro da mistura. Em seguida, remova as bolhas com desiccação a vácuo.

Coloque uma gota da mistura PDMS dessecada em um deslizamento de cobertura quadrado ou circular, e gire a tampa em um revestimento de giro a 2.500 rpm por 30 segundos. Incubar a tampa em um forno a 60 graus Celsius, por uma a duas horas, ou à temperatura ambiente durante a noite. Para preparar um substrato micro padronizado, coloque um wafer de silício padronizado dentro de um diâmetro circular de 150 milímetros por placa de Petri de 15 milímetros de altura e despeje PDMS desa gás no wafer.

Solidificou o PDMS em um forno a 60 graus Celsius durante a noite. Deixe o PDMS esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, use um bisturi cirúrgico para cortar selos de 30 por 30 milímetros quadrados contendo os padrões corretos tomando cuidado para não danificar o wafer de silício.

Esterilize os selos PDMS e os deslizamentos de cobertura ajustáveis, imergindo-os em 70% de etanol por 30 minutos. Para confirmar a eficácia do micropattern, seque a superfície dos selos PDMS usando um fluxo de ar filtrado e pipeta 15 microgramas por solução BSA mililitro para cobrir todo o lado padronizado do selo. Incubar os selos com a solução BSA por uma hora à temperatura ambiente para permitir a adsorção de proteínas e, em seguida, secar os selos para remover a solução BSA.

Use o fluxo de ar filtrado para secar a superfície dos deslizamentos de cobertura ajustáveis. Coloque o lado padronizado do selo em contato conformal com o deslizamento de cobertura afinado para permitir a adsorção de BSA na superfície do deslizamento de cobertura e pressione suavemente o carimbo contra o deslizamento de tampas por cinco minutos. Examine o micropattern usando um microscópio de fluorescência com um filtro FITC.

Para imprimir áreas adesivas celulares em vez de padrões fluorescentes substituem a laminina pela proteína BSA. Remova os selos dos deslizamentos de cobertura e transfira os deslizamentos de cobertura em uma placa de seis poços esterilizada. Adicione dois mililitros de solução F-127 plurônica de 0,2% em cada poço para cobrir a superfície do deslizamento de cobertura e incubar a placa por uma hora em temperatura ambiente.

Aspirar a solução F-127 e lavar a tampa desliza cinco vezes com PBS, uma vez com o meio de cultura celular, em seguida, semeou as células Schwann a uma densidade de semeadura de 1000 células por centímetro quadrado. 45 minutos após a semeadura celular, remova o meio de cultura celular e lave os deslizamentos de tampa duas vezes com PBS para evitar que várias células aderam ao mesmo padrão. Mantenha as células no ambiente de cultura celular desejada por 48 horas antes da quantificação.

Para criar substratos de cultura celular padrão de linha para examinar células alinhadas, faça os selos de acordo com as instruções do manuscrito e corte-os para as dimensões desejadas. Prepare duas placas de Petri revestidas com uma superfície PDMS ajustável como descrito anteriormente, e realize a impressão de microcontatos para imprimir áreas adesivas de células com padrão de linha em um dos pratos. Depois de remover os selos, encha a placa de Petri com quatro mililitros de solução F-127 plurônica de 0,2% e incuba-a por uma hora.

Enxágüe cada lado do selo PDMS três vezes com 70% de etanol e seque-o com ar. Gire os selos PDMS e imprima a área adesiva celular não despachada na segunda placa de Petri, como descrito anteriormente. Depois de incubar os pratos com a solução F-127, retire a solução e lave os pratos três vezes com PBS e uma vez com meio de cultura celular fresca.

Em seguida, as células de sementes nos pratos, e mantê-las nas condições desejadas por 48 horas antes de preparar os lises. Para preparar os lises, lave as células com PBS gelado por dois minutos, depois adicione 80 microliters de solução RIPA, preparada de acordo com as instruções do manuscrito, em cada área adesiva celular, e incuba as células em um bloco de gelo por 25 minutos. Raspe as células Schwann com o raspador de células por cinco minutos e colete o lysate em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado.

Centrifugar o lysate por 15 minutos a 12 mil vezes G e quatro graus Celsius. Colete o supernatante e transfira-o para um tubo de microcentrifuuge limpo. Substratos revestidos de laminina resultaram em uma maior taxa de proliferação quando comparados com substratos revestidos de colágeno e fibronectina.

Células schwann em substratos com revestimento de laminina e moduli diferente mostraram que substratos relativamente mais suaves diminuíram as taxas de proliferação celular. As células também foram analisadas para expressão proteica. O fator transcricional c-Jun foi regulado à medida que os substratos se tornaram mais suaves.

No entanto, foi significativamente rebaixado nos substratos mais suaves. Em substratos rígidos, substratos revestidos de colágeno resultaram na maior expressão c-Jun, à medida que os substratos se tornaram mais macios, laminina mostrou os níveis mais altos de c-Jun. As células foram então manchadas com rhodamina-phalloidin para explorar o papel da expansão celular e área na expressão c-Jun.

Quando linhas de adesivo celular foram criadas nos substratos da cultura celular, a proporção nuclear das células semeadas no substrato padrão aumentou em comparação com a das células em substratos não padronizados. A expressão do receptor de neurotropfina c-Jun e p75 foi regulada em células densas com uma área de expansão menor. Células com padrão de linha também resultaram em uma expressão mais elevada de c-Jun e p75 NTR quando comparadas com células não padronizadas.

As geometrias adesivas de células impressas em microcontato foram criadas para controlar precisamente a área de expansão celular e o alongamento, eliminando as interações celular-célula. O aumento da proporção celular fez com que o alongamento nuclear aumentasse. A expressão de c-Jun foi regulada tanto pelo alongamento celular quanto pela inibição da propagação celular.

A coloração da imunofluorescência para os núcleos e a actina confirmou que a área de disseminação celular e o alongamento foram precisamente controlados através deste método de micropatterning. Esta técnica abriu uma maneira de usar nossos substratos tunable como um método para analisar mecanicamente a biologia celular schwann e a sinalização no contexto de regeneração e câncer.