Name: Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprenda a isolar células CD8+ T residentes em rim de rato para análise por citometria de fluxo. Este método permite estudar respostas de células efetoras e de memória em tecidos não mucosos.

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Este trabalho é apoiado pelas bolsas NIH AI125701 e AI139721, o programa CLIP do Cancer Research Institute e a American Cancer Society concedem RSG-18-222-01-LIB à N.Z. Agradecemos a Karla Gorena e Sebastian Montagnino da Instalação de Citometria de Fluxo. Os dados gerados no Flow Cytometry Shared Resource Facility foram apoiados pelo Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio (UTHSCSA), NIH/NCI grant P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center (CTRC) na UTHSCSA) e UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).

Todos os experimentos em animais realizados após este protocolo devem ser aprovados pelo respectivo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pela IACUC UT Health San Antonio.
1. Transferência adotiva de células P14 T para receptores C57BL/6 e infecção por LCMV
<ol><li>Use ratos P14 com 6-12 semanas de idade. Certifique-se de que o sexo do doador P14 TCR transgênico do mouse deve coincidir com o sexo de camundongos receptores C57BL/6. Caso contrário, células como células T machos que se transferem para camundongos fêmeas resultarão em rejeição imuno-mediada de células T doadoras circulantes em cerca de 12 dias14.</li>
	<li>Purificar células ingênuas CD8+ T do baço e linfonodos de um mouse transgênico P14 TCR usando kit de purificação celular CD8+ T do mouse seguindo o protocolo do fabricante.<ol>
<li>Brevemente, dissecar baço e linfonodos, amasse as amostras para gerar suspensão celular única.</li>
		<li>Para enriquecer para células T ingênuas, adicione anticorpo biotina-anti-CD44 durante a primeira incubação de anticorpos passo13. NOTA: O kit comercial de seleção negativa utilizado nesta etapa contém dois componentes principais para duas etapas de incubação (ou seja, incubação de mistura de biotina-anticorpos e incubação de contas magnéticas streptavidin).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um hemótmetro para contar as células e injetar de 1.000 a 10.000 células P14 T purificadas em 200 μL de PBS em cada sexo compatível com o receptor C57BL/6 através da veia traseira. NOTA: O protocolo detalhado de injeção da veia da cauda é descrito na etapa 2.</li>
	<li>No dia seguinte, todos os receptores C57BL/6 recebem 2 x 105 pfu LCMV Armstrong diluídos em 200 μL de PBS através de uma rota intraperitoneal.</li>
</ol>2. Rotulagem intravascular de células CD8+ T
NOTA: Dependendo dos interesses da pesquisa, diferentes pontos de tempo podem ser escolhidos após a infecção. Um exemplo do dia 30 pós infecção (dia 30 após a etapa 1.4) é demonstrado, o que é muitas vezes considerado como um ponto de tempo de memória inicial para resposta celular CD8 T.
<ol><li>Diluir anticorpos anti-CD8α para 15 μg/mL em PBS. Certifique-se de que cada mouse receba 200 μL de PBS contendo anticorpo de 3 μg. NOTA: O anticorpo biotin anti-CD8 é usado aqui para que seja mais flexível para projetar o painel de coloração FACS final. O anticorpo com tinta fluorescente pode ser usado diretamente. No entanto, é importante usar diferentes clones de anticorpos monoclonais para rotulagem intravenosa versus coloração FACS.</li>
	<li>Aqueça adequadamente a veia traseira dos camundongos com uma lâmpada de calor aérea por 5-10 minutos para dilatar as veias. NOTA: Deve-se tomar cuidado extra para evitar o superaquecimento dos animais. Reduza o calor ou remova a lâmpada de calor se os ratos pararem para se mover.</li>
	<li>Desenhe 200 μL de mistura predil de anticorpos anti-CD8α em uma seringa de insulina de 100 U (28G) e remova quaisquer bolhas de ar movendo o pistão para cima e para baixo. Dobre a agulha para criar um ângulo de 150° entre a agulha e a seringa, bisbida para cima, de modo que a agulha será paralela à veia.</li>
	<li>Contenha o mouse com um cabisso de roedores de tamanho adequado e pulverize a cauda com 70% de etanol para deixar a veia claramente visível. NOTA: A duração da contenção deve ser mantida ao mínimo.</li>
	<li>Segure a cauda na extremidade distal com o polegar e os dedos médios da mão não dominante. Coloque o dedo indicador debaixo do local onde a agulha será inserida.</li>
	<li>Segure a seringa com a mão dominante e insira a agulha na veia em paralelo em direção à direção do coração. NOTA: Ao colocar corretamente, a agulha deve mover-se suavemente para dentro da veia.</li>
	<li>Injete lentamente 200 μL de anticorpo anti-CD8α através da veia da cauda. NOTA: Se houver uma resistência ou uma área branca for vista acima da agulha na cauda, a agulha não está dentro da veia. Inicie a injeção inicial perto da ponta da cauda. Quando necessário, mova-se para a parte inferior da cauda para injeções subsequentes.</li>
	<li>Retire a agulha e aplique suavemente a compressão até que o sangramento pare.</li>
	<li>Devolva o rato para a gaiola, e eutanásia o rato depois de 3-5 min. NOTA: Os camundongos devem ser eutanizados através da câmara isoflurane seguida de luxação cervical. Outros métodos, como a inalação de CO2, levarão até 5 minutos e podem introduzir variação desnecessária do tempo de rotulagem de anticorpos intravenosos.</li>
	<li>Dissecar o rim usando tesoura, transferir todo o rim para 1,5 mL de tubos de microcentrifuuus e deixar as amostras no gelo até um processamento mais aprofundado. NOTA: O rim inteiro intacto pode ser armazenado com segurança no gelo por algumas horas antes do processamento e digestão subsequentes.</li>
</ol>3. Digestão enzimática do rim
<ol><li>Prepare 6 placas de poço contendo 3mL da solução de digestão (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Collagenase B) para cada mouse, armazenar no gelo. NOTA: A solução B de colagenase de estoque em maior concentração (por exemplo, 20x) pode ser preparada e armazenada a menos de -20°C. A solução de trabalho deve ser preparada de novo. Consulte a Tabela 1 para as receitas de todas as soluções/buffer usadas no protocolo atual.</li>
	<li>Adicione 300 μL de solução de digestão nos tubos de amostra de microcentrifuuuge de 1,5 mL e pique as amostras de rim com uma tesoura de mola reta. NOTA: O tecido renal deve ser picado em pedaços uniformes com tamanhos não superiores a 1,5 mm de diâmetro. Não é necessária nenhuma etapa de decapsulação.</li>
	<li>Transfira as amostras de rim picadas para 6 placas de poço contendo a solução de digestão NOTA: 6 placas de poço são usadas para conveniência somente quando há várias amostras a serem processadas.</li>
	<li>Incubar as amostras a 37 °C com balanço suave (cerca de 60 rpm) por 45 min.</li>
	<li>Após a digestão, amasse o tecido com a flange do êmbolo de uma seringa de 3 mL diretamente dentro do prato, e transfira para tubos cônicos de 15 mL. NOTA: Normalmente a filtragem através de um coador de células não é necessária nesta etapa porque a centrifugação de gradiente de densidade é realizada ao lado para purificar linfócitos vivos.</li>
	<li>Gire as amostras a 500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspense a pelota em 3 mL de RPMI/10% FCS.</li>
</ol>4. Centrifugação gradiente de densidade para enriquecer linfócitos do rim digerido
<ol><li>Gire a amostra a 500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova o supernasce e resuspenda a pelota celular com 5 mL de 44% de mistura Percoll/RPMI (44% percoll + 56% RPMI sem FBS).</li>
	<li>Coloque a ponta de uma pipeta de 3 mL contendo 3 mL de 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) diretamente na parte inferior de cada tubo, e solte lentamente a solução para que a solução pesada (67% Percoll/PBS) forme uma camada distinta na parte inferior e a solução leve (44% Percoll/RPMI) seja levantada. Juntas, camadas de coquetéis se formarão. NOTA: Para o recém-chegado meio gradiente de densidade do fornecedor, adicione 1/10 volume de PBS estéril de 10x à garrafa, misture bem e considere o meio gradiente de densidade balanceado PBS como solução de 100%.</li>
	<li>Gire as amostras a 900 x g por 20 minutos em temperatura ambiente com acelerador reduzido e ajuste de freio. NOTA: Para centrífugas com teclas de aceleração e freio (em uma escala de 1-9 (1 significa mínimo e 9 significa máximo)), use 6 para acelerador e 4 para freio.</li>
	<li>Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga sem perturbar as camadas; NOTA: Uma camada clara de linfócito é identificada entre a camada RPMI cor rosa e a camada PBS incolor.</li>
	<li>Remova a camada superior com uma pipeta de transferência sem tocar na camada de linfócito.</li>
	<li>Transfira a camada de linfócito para um novo tubo de 15 mL, encha o tubo com PBS/5% FCS e misture invertendo o tubo 4-6x lentamente para garantir a mistura suficiente. NOTA: Este passo é importante para lavar qualquer Percoll residual.</li>
	<li>Gire as amostras a 500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova o supernatante e suspenda a pelota celular com 500 μL de meio RPMI completo. As células estão prontas para coloração de citometria de fluxo.</li>
</ol>5. Coloração e análise da citometria de fluxo
NOTA: Siga o protocolo padrão de coloração da citometria de fluxo para linfócitos T.
<ol><li>Pegue cerca de 1 x 106 células para cada coloração FACS. NOTA: Use uma placa de poço U-bottom 96 para coloração FACS. No entanto, se apenas um número limitado de amostras estiver envolvido, também podem ser usados tubos FACS de 5 mL.</li>
	<li>Gire as células a 500 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernaspeso.</li>
	<li>Resuspenque cada amostra em 50 μL de tampão FACS contendo 10 μg/mL de bloqueador 2.4G2 FcR (um anticorpo monoclonal anti-CD16/32 para bloquear a interação entre anticorpo FACS adicionado com FcR). Incubar no gelo por 15 minutos.</li>
	<li>Sem mais centrifugação, adicione 50 μL de mistura de anticorpos de coloração superficial para cada amostra, de modo que o volume final de coloração seja de 100 μL/cada amostra. Incubar no gelo por 30 minutos no escuro. NOTA: Inclua streptavidina fluorescentemente rotulado (2 μg/mL ou siga a recomendação do fabricante) na mistura de anticorpos para rotular células CD8α+ intravasculares CD8+ T e use anticorpo anti-CD8β rotulado fluorescente para rotular todas as células CD8 T. A mistura de anticorpos é feita adicionando quantidades desejadas de anticorpos interessados no buffer FACS.</li>
	<li>Lave as amostras com PBS duas vezes. Para cada lavagem, encha os poços de 96 pratos de poço com PBS frio, gire a 500 x g por 5 min a 4 °C e descarte o supernante.</li>
	<li>Resuspend as células em 100 μL/bem de corante vivo/morte diluído. Incubar no gelo por 30 minutos no escuro. NOTA: Mesmo com o giro médio gradiente de densidade, a etapa de digestão enzimática muitas vezes induz morte celular significativa em células T residentes em tecido devido à sinalização ARTC2.2/P2RX715. A coloração de corante ao vivo/morte é altamente recomendada antes da fixação. O nanocorpo anti-ARTC2 pode ser administrado nos camundongos antes da eutanásia para evitar a morte celular induzida pelo isolamento celular.</li>
	<li>Lave as amostras com tampão FACS duas vezes. Para cada lavagem, encha os poços de placa de 96 poços com tampão FACS frio, gire a 500 x g por 5 min a 4 °C e descarte o supernascimento.</li>
	<li>Resuspenda as células em 100 μL/bem fixação de buffer. Incubar a 37 °C por 10 min. NOTA: O buffer de fixação é feito recentemente diluindo o formaldeído com PBS a uma concentração final de 2% de formaldeído.</li>
	<li>Lave as amostras com tampão FACS duas vezes. Para cada lavagem, encha os poços de 96 placas de poço com tampão FACS frio, gire a 500 x g por 5 min a 4 °C e descarte o supernascimento.</li>
	<li>Resuspenda as células em 250 μL/bem tampão FACS. Sele a placa, armazene a 4 °C e proteja da luz até a análise FACS. NOTA: Antes da análise facs, filtre as amostras através de uma malha de nylon de 70 μM para remover possíveis aglomerados celulares que possam entupir a máquina FACS.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cell+subsets%2C+migration+patterns%2C+and+tissue+residence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li>
<li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+T+cells%3A+local+specialists+in+immune+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li>
<li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li>
<li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li>
<li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells%3A+lessons+from+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li>
<li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx3+programs+CD8%28%2B%29+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li>
<li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li>
<li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li>
<li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARTC2.2%2FP2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8%28%2B%29+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li>
<li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-Resident+Memory+CD8%28%2B%29+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li>
<li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.

Como a imunidade específica do tecido é uma área de pesquisa em rápida expansão, evidências acumuladas sugerem que as células imunes, especialmente a população de linfócitos, podem ser identificadas em quase todos os órgãos em camundongos adultos humanos ou infectados ou imunizados. O modelo de infecção por camundongos LCMV é um modelo bem estabelecido para estudar a resposta celular T específica do antígeno, a diferenciação de células T e a diferenciação de células T, incluindo a biologia TRM em vários tecido...

As células T de memória residente de tecido (TRM) representam uma das populações de células T mais abundantes em camundongos humanos adultos e infectados. As célulasT RM fornecem a primeira linha de defesa imunológica e estão criticamente envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos1,2,3,4,5. Comparando com as células T circulantes, as células TRM carregam marcadores de superfície distintos com programas de transcrição únicos6,7,8. Expandir nosso conhecimento sobre biologia TRM é a chave para entender as respostas das células T, que é essencial para o desenvolvimento futuro de vacinas e imunoterapias baseadas em células T.
Além de marcadores moleculares comumente compartilhados de TRMem todos os tecidos não linfoides, evidências acumuladas sugerem que características específicas do tecido são um componente central da biologia TRM 9. O rim abriga muitas células imunes, incluindo células TRM após a infecção e oferece uma grande oportunidade para estudar biologia celular TRM em um tecido não mucosal. A infecção por LCMV (vírus da coiomeningite linfocítica) por via intraperitoneal é um modelo de infecção sistêmica bem estabelecido para estudar respostas de células T específicas de antígenos em camundongos. A infecção geralmente é resolvida em 7-10 dias em camundongos do tipo selvagem e deixa um grande número de células T de memória específica de LCMV em uma variedade de tecidos, incluindo o rim10. Camundongos transgênicos P14 TCR (receptor de células T) carregam células CD8+ T reconhecem um dos epítopos imunes dominantes do LCMV apresentados pela molécula MHC-I (complexo de histocompatibilidade maior classe I) H2-Db em camundongos C57BL/6. Combinando transferência adotiva de células P14 T congênicamente marcadas e infecção por LCMV em camundongos, células T de efeito CD8+ e memória são rastreadas, incluindo diferenciação TRM e homeostase.
Em alguns tecidos de barreira, como linfócitos intraepiteliais intestinais (IEL) compartimentos e glândulas salivares, o procedimento de isolamento de linfócitos estabelecido produz alta porcentagem de células TRM com contaminação mínima das células T transmitidas pelo sangue no modelo11LCMV do camundongo . No entanto, em tecidos não-barreiras, como o rim, a densa rede vascular contém um grande número de células CD8+ T circulantes. Foi bem documentado que mesmo a perfusão bem sucedida não pode remover eficientemente todas as células CD8+ T circulantes. Para superar esse obstáculo técnico, a coloração de anticorpos intravasculares foi estabelecida como uma das técnicas mais utilizadas nos laboratórios TRM 12. Em suma, 3-5 minutos antes da eutanásia, 3 μg /mouse anticorpo anti-CD8 (para rotular células CD8+ T) é entregue por via intravenosa. A parede intacta dos vasos sanguíneos previne a rápida difusão do anticorpo neste curto período de tempo (ou seja, 3-5 minutos) e apenas células intravasculares são rotuladas. Seguindo o protocolo padrão de isolamento do linfócito, as células intravasculares versus extravasculares podem ser facilmente distinguidas usando citometria de fluxo.
Aqui, descreveremos um protocolo padrão comumente utilizado em laboratórios TRM para realizar rotulagem intravascular, isolamento de linfócitos e análise de citometria de fluxo de células rim CD8+ T usando um mouse C57BL/6 que recebeu células CD45.1+ P14 T e infecção por LCMV 30 dias antesdo dia 13. O mesmo protocolo pode ser usado para estudar células T e efeitos e memória no rim.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-130</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 ml</td><td>Corning</td><td>431470</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 ml</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>37C incubadora</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotina a-CD8a anticorpo (Clone 53-6.7)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Soro de bezerro</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência Graduada Descartáveis</td> Collegenase B Millipore Sigma 11088807001 <td></td><td></td> Seringa de Insulina Fisherbrand 13-711-9AM <td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Micro Dissecante</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS 5692</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Mojosort Mouse CD8 Na&iuml;<td></td></tr><tr><td> Kit de isolamento de células T ve</td><td>Biolegend</td><td>480043</td><td></td></tr><tr><td>lâmpada de calor suspensa</td><td>Amazon</td><td>B00333PZZG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>rocker</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Mouse de latão maciço Concentrador</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SAI-MBR</td><td></td></tr><tr><td>Balde Oscilante Centrífuga com geladeira</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture 6-well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento das células cd8+ t residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

A célula T dememória residente em tecido é um campo de pesquisa de imunologia em rápida expansão. Isolar células T de vários tecidos não linfoides é um dos passos fundamentais para investigar TRMs. Há pequenas variações nos protocolos de isolamento de linfócitos para diferentes órgãos. O rim é um órgão não linfoide essencial com numerosa infiltração de células imunes especialmente após a exposição ao patógeno ou ativação autoimune. Nos últimos anos, vários laboratórios, incluindo o nosso, começaram a caracterizar células CD8+ T residentes nos rins em vários ambientes fisiológicos e patológicos tanto em camundongos quanto em humanos. Devido à abundância de linfócitos T, o rim representa um órgão modelo atraente para estudar TRMsem tecidos não mucosas ou não-barreiras. Aqui, descreveremos um protocolo comumente usado em laboratórios focados em TRMpara isolar células CD8+ T de rins de camundongos após infecção viral sistêmica. Brevemente, utilizando um modelo de infecção por coriomeningite linfocítica aguda (LCMV) em camundongos C57BL/6, demonstramos rotulagem intravascular de células CD8+ T, digestão enzimática e centrífuga de gradiente de densidade para isolar e enriquecer linfócitos de rins de camundongos para preparar amostras para a análise de citometria de fluxo subsequente.

O protocolo descrito aqui é resumido em um fluxograma(Figura 1A). No dia 30 pós infecção por LCMV, realizamos rotulagem intravascular de células CD8+ T. 5 minutos depois, ambos os rins do animal foram dissecados, picados e submetidos à digestão da colagemnase. Os linfócitos foram purificados ainda mais das amostras digeridas via centrífuga percoll e analisados por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1B, mesmo após o enriquecimento de linfócit...

Após a infecção viral, o rim abriga um número relativamente grande de células CD8+ T e oferece uma oportunidade de estudar células TRM não mucosas. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar linfócitos renais de camundongos para análise de citometria de fluxo.

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

As células CD8+T carregam características distintas em diferentes tecidos, como um exemplo crítico de tecido não mucosal e não linfoide. É essencial caracterizar diretamente as células residentes nos rins para entender completamente a biologia das células T. Aqui demonstraremos nosso método conveniente para isolar células CD8+T residentes nos rins que acomodam a análise subsequente da citometria de fluxo.Este método poderia fornecer insights sobre os estudos das células CD8+T de efeito e memória geradas após infecções, bem como respostas autoimunes. O procedimento será realizado pelo Dr. Chaoyu Ma, um cientista de pesquisa do meu laboratório. Comece diluindo o anticorpo alfa biotina anti CD8 para 15 microgramas por mililitro em PBS, certificando-se de que há o suficiente para administrar 200 microliters em cada rato.Antes da injeção, aqueça a veia traseira do mouse com uma lâmpada de calor por cinco a 10 minutos para dilata-la. Desenhe 200 microliters da mistura de anticorpos pré-diluídos em uma seringa de insulina de 28 bitolas e remova quaisquer bolhas de ar movendo o pistão para cima e para baixo. Dobre a agulha para criar um ângulo de 150 graus entre a agulha e a seringa, bisbi

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

DNabT células são raras entre as células T periféricas; no entanto, eles são abundantes em certos tecidos não linfóides. Dificuldade de isolar as células T DN a partir de tecidos não-linfóides dificulta a sua análise funcional, apesar do aumento reconhecida importância fisiopatológica. Descreve-se um novo protocolo para o isolamento de células altamente purificadas DN T de rim murino.

Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim

Este protocolo descreve a digestão enzimática da pele de camundongo em meio rico em nutrientes, seguida de separação gradiente para isolar leucócitos.  As células assim derivadas podem ser usadas para diversas aplicações a jusante. Esta é uma alternativa eficaz, econômica e aprimorada às máquinas de dissociação de tecidos e aos protocolos de digestão de tecidos mais severos baseados em tripsina e dispase.

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

A inflamação desempenha um papel central na patogênese do AVC isquêmico. Evidências crescentes sugerem que ele atua como uma faca de dois gumes que exacerba a lesão cerebral precoce, mas também contribui para o reparo posterior. Este protocolo descreve o isolamento de células imunes do cérebro isquêmico e sua subsequente fenotipagem citométrica de fluxo.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Os macrófagos são células plasmáticas do sistema hematopoiético que desempenham um papel crucial na imunidade protetora e na homeostase. Neste relatório , descrevemos técnicas otimizadas in vitro para caracterizar fenotípica e funcionalmente macrófagos reguladores infiltrantes de enxerto que se acumulam no órgão transplantado em condições tolerogênicas.

Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto

Técnicas confiáveis e eficientes para o isolamento de células imunes renais são necessárias para aplicações a jusante. Isso requer a marcação de anticorpos de superfície de um pequeno número de células imunes renais. Aqui, descrevemos um método conciso para isolamento de células imunes renais que aparentemente atinge esse objetivo.

Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes

Este artigo fornece metodologia detalhada para identificar e quantificar os subconjuntos de linfócitos T funcionais presentes dentro de rim murino, aorta e linfonodos por coloração intracelular e citometria de fluxo. O modelo de hipertensão induzida por angiotensina II foi escolhido para explicar, passo-a-passo, os procedimentos e os princípios fundamentais da citometria de fluxo e coloração intracelular.

Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neste documento, apresentamos um protocolo para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço para um estudo mais aprofundado destas células usando citometria de fluxo. Além disso, este protocolo foi utilizado para determinar os subconjuntos de pilhas de T reguladoras usando citometria de fluxo.

Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo

O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Aprenda a isolar células CD8+ T residentes em rim de rato para análise por citometria de fluxo. Este método permite estudar respostas de células efetoras e de memória em tecidos não mucosos.

Isolamento das células CD8⁺ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

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