Isolamento das células CD8⁺ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

As células CD8+T carregam características distintas em diferentes tecidos, como um exemplo crítico de tecido não mucosal e não linfoide. É essencial caracterizar diretamente as células residentes nos rins para entender completamente a biologia das células T. Aqui demonstraremos nosso método conveniente para isolar células CD8+T residentes nos rins que acomodam a análise subsequente da citometria de fluxo.

Este método poderia fornecer insights sobre os estudos das células CD8+T de efeito e memória geradas após infecções, bem como respostas autoimunes. O procedimento será realizado pelo Dr. Chaoyu Ma, um cientista de pesquisa do meu laboratório. Comece diluindo o anticorpo alfa biotina anti CD8 para 15 microgramas por mililitro em PBS, certificando-se de que há o suficiente para administrar 200 microliters em cada rato.

Antes da injeção, aqueça a veia traseira do mouse com uma lâmpada de calor por cinco a 10 minutos para dilata-la. Desenhe 200 microliters da mistura de anticorpos pré-diluídos em uma seringa de insulina de 28 bitolas e remova quaisquer bolhas de ar movendo o pistão para cima e para baixo. Dobre a agulha para criar um ângulo de 150 graus entre a agulha e a seringa, bisbida para cima, de modo que a agulha seja paralela à veia da cauda.

Contenha o mouse com um cabisso de roedores e pulverize a cauda com 70% de etanol para deixar a veia claramente visível. Segure a cauda na extremidade distal com o polegar e os dedos médios da mão não dominante, em seguida, coloque o dedo indicador sob o local da injeção. Com a mão dominante insira a agulha na veia em paralelo em direção à direção do coração e injete lentamente 200 microliters do anticorpo.

Retire a agulha e comprime suavemente o local da injeção até que o sangramento pare. Depois de eutanásia do rato, disseca o rim com uma tesoura e transfira-o para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Deixe as amostras no gelo até que seja mais processamento.

Prepare placas de seis poços com três mililitros de solução de digestão em cada poço, usando um poço por mouse, e armazene-os no gelo. Adicione 300 microliters de solução de digestão em cada tubo de amostra e pique as amostras de rim com uma tesoura de mola reta. Transfira as amostras de rim picados para as placas de seis poços com a solução de digestão.

Incubar as amostras a 37 graus Celsius com balanço suave por 45 minutos, em seguida, homogeneizar o tecido com a flange de êmbolo de uma seringa de três mililitros e transferi-lo para tubos cônicos de 15 mililitros. Gire as amostras a 500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspenda a pelota em três mililitros de RPMI com 10% de FCS.

Gire a amostra a 500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos, depois remova o supernasal e resuspense a pelota celular com cinco mililitros de 44% de densidade gradiente médio e mistura RPMI. Coloque a ponta de uma pipeta de três mililitros contendo três mililitros de 67% de densidade gradiente médio e PBS diretamente na parte inferior de cada tubo e solte lentamente a solução para que a solução pesada forme uma camada distinta na parte inferior. Gire as amostras a 900 vezes g por 20 minutos com ajustes reduzidos do acelerador e do freio e, em seguida, remova cuidadosamente os tubos da centrífuga sem perturbar as camadas.

Remova a camada superior com uma pipeta de transferência sem tocar na camada de linfócito e transfira a camada de linfócito para um novo tubo de 15 mililitros. Encha o tubo com PBS e 5% FCS, depois misture invertendo lentamente o tubo de quatro a seis vezes. Depois de centrifugar as amostras a 500 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos, remova o supernascer e resuspense a pelota celular com 500 microliters de meio RPMI completo.

As células estão prontas para a coloração da citometria de fluxo. Mesmo após o enriquecimento de linfócitos mediados pela centrifugação de densidade, era muito comum ver uma grande porção de não linfócitos no produto final. No entanto, depois de ganhar em linfócitos vivos, linfócitos CD8+T foram fáceis de identificar.

Como esperado, apenas células extra-vasculares CD8+T adquiriram eficientemente fenótipos de células T de memória residente de tecido, como a regulação do CD69 e a baixa regulação do Ly6C. Em contraste com os camundongos infectados, a grande maioria das células CD8+T isoladas de camundongos ingênuos jovens alojados na instalação do FPS foram rotuladas com anticorpo alfa CD8 e, portanto, pertenciam ao compartimento intravascular. Esta técnica acelerou muito a investigação de células imunes residentes em tecidos em órgãos densamente vascularizados.