Um modelo de loop hemodinâmico in vitro para investigar a hemocitocompatibilidade e ativação celular hospedeira de dispositivos médicos vasculares

Este modelo de loop hemodinâmico permite que os pesquisadores testem a compatibilidade in vitro de hemo de dispositivos vasculares, como tubos de perfusão ou stents. em condições padronizadas. Assim, esta técnica não exerce qualquer impacto sobre o sangue por força mecânica e, assim, evita os resultados enganosos pela ativação intrínseca dos componentes sanguíneos.

Antes de tentar um experimento, deve ser praticada a montagem adequada da peça mecânica, a construção perfeita do sistema de fechamento de loops e a carga lenta de sangue nas alças. Para preparar o conjunto de laços, use um cortador de tubos para cortar peças internas de 250 centímetros de comprimento e cinco milímetros de diâmetro interno em uma superfície plana. E conecte as terminações abertas dos tubos em um pequeno pedaço de tubo de silício que encaixe o diâmetro externo do tubo investigativo para gerar uma forma de loop.

Aperte cuidadosamente o parafuso de travamento do conector da banda de tensão e ajuste a força de fechamento para que não fique nenhuma lacuna entre as duas dobras. Se o parafuso de bloqueio estiver totalmente apertado e a tensão da faixa de policarbonato parecer muito baixa para fechar a distância entre as duas dobras, abra o sistema de bloqueio e corte alguns milímetros da faixa de tensão. Para preparar um conjunto de loop stent, abra dois dos loops e tire o tubo do sistema de banda de tensão.

Em seguida, insira o stent no meio do tubo, conforme instruído pelo fabricante. Quando o número apropriado de loops para o experimento tiver sido gerado, fixe as alças no berço de loop da unidade de rotação, fora de um banho de água de 37 graus e conecte o suporte de laço à unidade de rotação dentro do banho de água. Em seguida, encha uma seringa de 10 mililitros para cada duas alças de sangue a serem coletadas com 150 microliters ou solução de estoque de heparina recém-preparada e use uma borboleta calibre 21 para coletar suavemente sangue nas seringas, tomando o cuidado de evitar a homolise ou ativação celular devido ao vácuo excessivo.

Quando todo o sangue tiver sido coletado, transfira o sangue para um copo de vidro e use uma pipeta sorológica de cinco mililitros, para misturar suavemente o sangue e a heparina. Quando uma solução homogênea tiver sido obtida com a ponta pipeta não totalmente inserida no tubo, cuidadosamente, encha cada laço com cinco mililitros de sangue. Feche cada loop depois de preenchido e confirme que o laço, a banda de tensão e o rack estão devidamente protegidos.

Em seguida, gire os loops por três horas a 30 revoluções por minuto. No final da rotação, deixe que os laços fiquem no rack por dois minutos para deixar o sangue acumular na parte inferior do laço antes de abrir cuidadosamente os conectores e puxar o sangue das duplicatas em béquers de vidro individuais de 10 mililitros. Quando todo o sangue tiver sido coletado enxágue cada tubo com 10 mililitros de PBS e use um bisturi para cortar cuidadosamente uma amostra de um centímetro da extremidade de cada tubo.

Incubar as amostras durante a noite em 2% glutaraldeído a quatro graus celsius, seguido por uma incubação de 15 minutos e 1% de tetroxida de ósmio à temperatura ambiente. Ao final da incubação do tetroxida de ósmio, desidratar as amostras em uma série ascendente de etanol por 20 minutos por concentração, seguida de uma desidratação de 30 minutos em 100% etanol. No final da incubação de 100% de etanol, deixe as amostras secarem durante a noite à temperatura ambiente antes de examinar as amostras através da varredura de microscopia eletrônica em uma tensão de aceleração de cinco quilovolts, usando um scanner microCácido de raios-X.

Para análise citométrica de fluxo das amostras de sangue. Transfira 100 microliters de sangue de cada amostra para cada um dos nove tubos FACS de cinco mililitros e fixe as amostras com a adição de 100 microliters de 4% de formaldeído por tubo por 15 minutos à temperatura ambiente protegido da luz. Após a lavagem, suspenda-se cada pelota em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos por tubo, para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, protegido da luz.

No final da incubação, lave as amostras por centrifugação em um mililitro de PBS por tubo e coloque as amostras sem seus sobrenantes no gelo. Para preparar contas de compensação de manchas únicas, adicione quatro gotas de contas positivas e quatro gotas negativas a volumes individuais de um mililitro de buffer FACS e o vórtice das soluções para obter suspensões homogêneas de contas. Adicione 100 microliters de cada solução a cada um dos quatro ou cinco tubos FACS mililitros rotulados como indicado e lave as contas com um mililitro de tampão FACS por tubo.

Em seguida, adicione 100 microliters do coquetel de anticorpos de vórtice apropriado a cada experimental e fluorescência menos um tubo com mistura suave. Para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. No final da incubação, lave as amostras com um mililitro de tampão FACS fresco por amostra e resuspende pelotas em 250 microliters de tampão FACS por tubo.

Antes de analisar as contas em amostras de células por citometria de fluxo, de acordo com os protocolos padrão. As distribuições de células sanguíneas podem ser visualizadas em toda a superfície de duas bloops emendadas por microCC e imagens de microscópio eletrônico de varredura, enquanto nenhum coágulo é observado em laços fechados sem lacunas. A análise de toda a contagem de células sanguíneas não mostra diferenças significativas nos números de eritrócitos entre qualquer uma das condições testadas, números plaquetas e leucócitos, no entanto, são drasticamente reduzidos no grupo de loop de látex e os números de hemoglobina livre são dramaticamente aumentados, indicando uma biocompatibilidade muito ruim do látex.

Enquanto todos os dispositivos vasculares testados induzem uma ativação aumentada do sistema de coagulação e componente de elogio. Os laços de PVC revestidos de heparina apresentam uma tendência para a diminuição dos níveis de ambos os tipos de ativações em comparação com os laços de PVC revestidos de polímero. Os loops de látex exibem os mais altos níveis de TNF IL-6 e PMN elastase, destacando a potente ativação de leucócitos por látex.

As plaquetas positivas CD41 recuperadas de tubos de látex, apresentam uma intensidade de fluorescência mediana extremamente alta para CD62P, enquanto a expressão integrada é drasticamente reduzida em granulócitos e linfócitos. De interesse, os níveis integrais são mais elevados em monócitos de tubos de látex, sugerindo interações de plaquetas ativadas por monócitos. De fato, a coloração para agregados de plaquetas monócitos revela uma tendência aumentada de agregação em laços de látex e stent.

Apesar da frequência reduzida de monócitos dentro de loops de látex. Para evitar a ativação intrínseca do componente sanguíneo é importante garantir um fechamento adequado do laço e manusear o sangue com cuidado. Assim, seguindo este procedimento, é possível analisar a interação entre proteínas aogenéricas ou TRUCKs e componentes sanguíneos que são usados em inflamação ou pesquisa farmacêutica.