Name: Medições FLIM-FRET de Interações proteína-proteína em bactérias vivas. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a medir interações proteína-proteína em bactérias vivas usando FLIM-FRET em Pseudomonas aeruginosa. Este método avançado permite analisar relações desequilibradas entre doador e aceptor em tempo real.

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Reconhecemos o Dr. Ludovic Richert por sua valiosa assistência na aquisição de dados da FLIM e pela manutenção técnica e desenvolvimento da configuração da FLIM. Este trabalho foi financiado por subsídios da Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). A VN é financiada pela Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). A YM agradece ao Institut Universitaire de France (IUF) pelo apoio e pelo tempo adicional para se dedicar à pesquisa. O IJS e a JG reconhecem o Instituto de Entrega de Drogas de Estrasburgo pelo seu apoio financeiro.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

FLIM-FRET oferece algumas vantagens importantes sobre a imagem FRET baseada em intensidade. Fluorescência vitalícia é um parâmetro intrínseco do fluoróforo. Como consequência, não depende das concentrações locais de fluoroforos nem da intensidade da excitação da luz. A vida útil da fluorescência também é também mal afetada pelo branqueamento fotográfico. É particularmente interessante evidenciar PPIs em células onde concentrações de proteínas locais podem ser altamente heterogêneas em todos os compartimentos ou regiões s...

Interações proteína-proteína (PPIs) controlam vários processos-chave nas células1. Os papéis dos PPIs diferem com base na composição proteica, as afinidades funcionam e locais nas células2. Os PPIs podem ser investigados por meio de diferentes técnicas3. Por exemplo, a co-imunoprecipitação é uma técnica relativamente simples, robusta e barata comumente usada para identificar ou confirmar PPIs. No entanto, estudar PPIs pode ser desafiador quando as proteínas interativas têm baixos níveis de expressão ou quando as interações são transitórias ou relevantes apenas em ambientes específicos. Estudar os PPIs que ocorrem entre as diferentes enzimas da via pyoverdine em P. aeruginosa requer que a repressão do repressor geral de ferro-co-fatorado Fur seja aliviada para permitir que a expressão de todas as proteínas da via de pyoverdine seja expressa na célula4,5,6. Esta regulação comum para todas as proteínas da via resulta em expressões oportunas na célula esperadas para promover suas interações. A diversidade em termos de tamanho, natureza, níveis de expressão e o número de proteínas dessa via metabólica dificultam o estudo em sistemas reconstituídos6. Explorar PPIs em seu ambiente celular é, portanto, fundamental para entender melhor as funções biológicas das proteínas em seu contexto nativo.
Apenas poucos métodos, incluindo a fluorescência, permitem explorar PPIs em células vivas7. Entre os diferentes parâmetros de fluorescência que podem ser medidos, a vida útil da fluorescência (ou seja, o tempo médio que um fluoróforo permanece em seu estado animado antes de emitir um fóton) é provavelmente um dos parâmetros mais interessantes para explorar em células vivas. A vida fluorescência de um fluoróforo é altamente sensível ao seu ambiente e a FLIM pode, portanto, fornecer informações químicas ou físicas sobre o entorno do fluorohore8. Isso inclui a presença de transferência de energia de ressonância Förster (FRET) que pode ocorrer na presença de um "aceitador" de fluorescência localizado a uma curta distância de um "doador" de fluorescência. A transferência de energia resulta em encurtamento significativo da vida útil da fluorescência do doador(Figura 1A),tornando a Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) uma abordagem poderosa para explorar interações proteína-proteína diretamente em células vivas. A FLIM pode fornecer ainda informações espaciais sobre onde as interações ocorrem nas células7,8. Essa abordagem é extremamente poderosa para investigar PPIs em situações em que a rotulagem com fluoroforos dos dois parceiros interagindo é possível.
Para que o FRET ocorra - são necessárias condições críticas na distância entre dois fluoroforos8,9. Os dois fluoroforos não devem estar distantes um do outro por mais de 10 nm. Portanto, devem ser tomadas precauções ao projetar experimentos FLIM-FRET para garantir que o doador e o tomador da fluorescência tenham a chance de estarem próximos um do outro no complexo de interação. Embora isso possa parecer constrangedora, é de fato uma verdadeira vantagem, pois a dependência da distância do FRET garante que duas proteínas rotuladas submetidas ao FRET tenham que interagir fisicamente(Figura 1A). As dificuldades em obter respostas claras sobre o PPI em experimentos de colocalização (duas proteínas colocalized podem não necessariamente interagir) não são, portanto, um problema usando FLIM-FRET.
<img alt="Diagrama FRET; espectroscopia de fluorescência; doador-aceitador; curvas de excitação-emissão; sobreposição espectral." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Princípio de análise FLIM-FRET. Cada pixel da imagem multidimensional FLIM-FRET contém informações sobre a decadência da fluorescência registrada neste local específico (#counts = número de fótons detectados no canal t). (A) A representação clássica da imagem FLIM é geralmente uma imagem 2D codificada por cores falsas (esquerda). Uma diminuição na vida média de fluorescência do doador - como visto por uma mudança na escala de cor - pode ser observada na presença de FRET e é informativa sobre a presença de PPIs nesta área espacial. (B) Sobreposição entre o espectro de emissão de doadores e o espectro de absorção aceitador é necessária para que o FRET ocorra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Um segundo requisito para fret é que o espectro de emissão do doador e os espectros de absorção do aceitador devem se sobrepor8 (Figura 1B). A excitação da fluorescência do doador deve estar em comprimentos de onda que contribuem muito pouco para a excitação da fluorescência direta do aceitador. Nem todas as combinações de fluoroforos são possíveis e também recomendamos usar preferencialmente doadores com decaimentos monoexponenciais de fluorescência para facilitar as interpretações FLIM-FRET10. Vários casais de proteínas de fluorescência atendem a esses requisitos, incluindo o popular casal eGFP-mCherry11 (para uma revisão na paleta de pares FRET de proteína fluorescente disponíveis ver12,13).
FLIM-FRET permite medir a fluorescência de um doador de FRET em cada pixel de uma imagem FLIM(Figura 1A). Existem duas técnicas principais para determinar a vida útil da fluorescência que diferem na aquisição e análise: domínio de frequência (FD)14 e domínio de tempo (TD). O TD FLIM é mais difundido e é realizado usando uma iluminação pulsada combinada com diferentes configurações possíveis de detecção, incluindo os métodos de gating15, câmera de raia16 ou técnicas de contagem de fótons único (TCSPC)8. Para as técnicas de FD e TD, a vida útil da fluorescência não é diretamente medida, mas requer uma análise dos dados medidos para estimar a vida útil ou a presença de interações. Para as técnicas de TCSPC, a análise mais utilizada baseia-se na adequação das decaimentos com funções únicas ou multinenciais utilizando re-convoluções iterativas menos quadradas que minimizam a soma ponderada dos resíduos.
Finalmente, flim-FRET pode ser realizado tanto usando excitações de fótons únicos ou multifotos. As últimas têm várias vantagens como reduzir a autofluorescência e fotodamage fora do plano focal. Excitações multifoton permitem também uma maior profundidade de excitação se trabalhar em amostras 3D grossas8. Pelo contrário, a excitação de fótons único é geralmente mais eficiente, pois as seções transversais de absorção de dois fótons de proteínas fluorescentes são limitadasa 17.
Aqui, propomos um protocolo para medições FLIM-FRET de PPIs em P. aeruginosa ao vivo no caso particular de duas proteínas interativas (PvdA e PvdL) expressas com números altamente diferentes de cópias para demonstrar a qualidade e robustez da técnica em revelar características críticas dos PPIs. As proteínas PvdA e PvdL estão envolvidas na biossíntese de pyoverdine. PvdA é um L-ornithine N5-oxygenase e sintetiza o L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine de L-ornithine por hidroxication (PvdA) e formylation (PvdF)18. PvdL é uma enzima de síntese de peptídeos não ribossômicos (NRPS) composta por quatro módulos. O primeiro módulo catalisa a aciilação do ácido mirístico. O segundo módulo catalisa a ativação do L-Glu e sua condensação para o myristic-coA. Em seguida, o terceiro módulo condensa um aminoácido L-Tyr que é então isomerizado em D-Tyr. Finalmente, o quarto módulo une um aminoácido L-Dab (ácido diaminobutírico) para formar o tripeptídeo aciclado L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. O PvdL é, portanto, responsável pela síntese dos três primeiros aminoácidos do precursor de pyoverdine. A interação da proteína PvdA com PvdL é surpreendente, pois o PvdL, ao contrário do PvdI e pvdJ, não carrega um módulo específico para o L-N5-formyl-N5-hidroxiornithine. Essa interação sugere que todas as enzimas responsáveis pela biossíntese precursora de pyoverdine estão dispostas em grandes complexos multienzimáticos transitórios e dinâmicos19,20.
Neste relatório explicamos em detalhes como construir as cepas bacterianas expressando nativamente as duas proteínas interajadas e SFP e mCherry. Descrevemos também a preparação da amostra e as condições para imagens eficientes das células FLIM-FRET. Finalmente, propomos um tutorial passo a passo para análise de imagens, incluindo uma ferramenta recentemente desenvolvida que fornece possibilidades avançadas de visualização para interpretação direta de dados complexos FLIM-FRET. Com este relatório, gostaríamos de convencer não apenas os aventureiros, mas a maioria dos biólogos de que o FRET-FLIM é uma técnica acessível e poderosa capaz de responder às suas perguntas sobre os PPIs diretamente no ambiente celular nativo.

<table><tbody><tr><td>Filtro passa-banda de 525/50 nm</td><td>F37-516, AHF, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-curta de 680 nm</td><td>F75-680, AHF, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amônio (NH4)2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA polimerase 5U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiodo de avalanche acoplado a fibra</td><td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass covershives (Espessura No. 1.5, 20&times; </td><td>Vidro Knitel</td><td>MS0011</td><td></td></tr><tr><td>de 20mm Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion 2U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Lisogenia (LB)</td><td>Millipore</td><td>1.10285</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio Heptahidratado (MgSO4 . 7H2O)</td><td>Lâminas de microscópio Sigma-Aldrich</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>(25&vezes; 75mm)</td> <td>Vidro Knitel</td><td>MS0057</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmídeo</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.10</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Dibásico (K2HPO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sódio Succinato (Dissódico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160</td><td></td></tr><tr><td>SPCImage, software SPCM</td><td>Becker & Alça</td> de inoculação estéril Hickl <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nunc</td><td>7648-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase 1U/&mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>módulo TCSPC</td><td>SPC830, Becker & Hickl, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti: Insight DeepSee do laser da safira</td>, falcão 50mL <td></td> dos tubos 50mL da física <td></td><td></td></tr><tr><td>dos</td><td>espectros</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medições flim-fret de interações proteína-proteína em bactérias vivas.

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

As interações proteína-proteína (PPIs) controlam vários processos-chave nas células. A microscopia de imagem por imagem de fluorescência (FLIM) combinada com a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) fornece informações precisas sobre PPIs em células vivas. A FLIM-FRET baseia-se na medição da decadência ao longo da vida de um doador de FRET em cada pixel da imagem FLIM, fornecendo informações quantitativas e precisas sobre PPIs e suas organizações celulares espaciais. Propomos aqui um protocolo detalhado para as medições FLIM-FRET que aplicamos para monitorar PPIs em Pseudomonas aeruginosa ao vivo no caso particular de duas proteínas interativas expressas com números de cópias altamente diferentes para demonstrar a qualidade e robustez da técnica em revelar características críticas dos PPIs. Este protocolo descreve detalhadamente todas as etapas necessárias para a caracterização do PPI - desde construções mutantes bacterianas até a análise final usando ferramentas recentemente desenvolvidas fornecendo possibilidades avançadas de visualização para uma interpretação direta de dados complexos FLIM-FRET.

Funções de distribuição cumulativa empírica (ecdf) das vidas de fluorescência medidas para as diferentes cepas bacterianas são mostradas na Figura 8. Se ocorrer o FRET, os ecdfs são deslocados para as vidas de menor duração(Figura 8A,8B). Note-se que quando a interação das duas proteínas resulta em uma longa distância entre os dois fluoroforos, não pode ocorrer nenhum TRAF(Figura 8C). Essa situação não pode ser dist...

Descrevemos aqui um protocolo para caracterizar interações proteína-proteína entre duas proteínas altamente diferentes expressas em Pseudomonas aeruginosa viva usando medidas FLIM-FRET. O protocolo inclui construções de cepas de bactérias, imobilização de bactérias, rotinas de análise de dados de imagem e pós-imagem.

Medições FLIM-FRET de Interações proteína-proteína em bactérias vivas.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET é uma técnica poderosa que torna possível confirmar interações proteína-proteína suspeitas ou previstas. Neste protocolo, apresentamos uma forma de analisar dados em casos particulares de doadores desequilibrados e quantidades de aceitação. O FILM-FRET é capaz de fornecer informações sobre as interações proteína-proteína diretamente em células vivas.É importante investigar interações proteicas pessoais no ambiente celular nativo, em particular quando a proteína fluorescente é expressa no nível endógeno. Comece cultivando bactérias auxiliares de P.aeruginosa, E.coli TOP10 e E.coli cada em cinco mililitros de LB sem antibiótico a 30 graus Celsius enquanto treme durante a noite. No dia seguinte, meça a densidade óptica das culturas e misture uma quantidade igual de P.aeruginosa, E.coli TOP10 e E.coli em um microtubo de 1,5 mililitro.Centrifugar o tubo por cinco minutos a 9, 300 vezes G para pelotar as bactérias, em seguida, descartar o supernascer e resuspend a pelota em 50 microliters de LB. Emplaque uma mancha da mistura no ágar LB pré-aquecido e incuba-o por cinco horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, raspe o local com um laço de inoculação estéril e resuspenque-o em um mililitro de LB. Placa 100 microliters desta suspensão bacteriana em ágar LB contendo 10 microgramas por niótrofe cloramfenicol e 30 microgramas por mililitro gentamicina e incubar dois dias a 37 graus Celsius para eliminar as bactérias E.coli TOP10 e E.coli helper. Resuspend uma colônia em um mililitro de LB e incuba-lo a 37 graus Celsius com agitação orbital por quatro horas, em seguida, centrifugar o tubo por três minutos a 9.300 vezes G e descartar 950 microliters de supernante.Resuspenda a pelota em 50 microliters de LB e isolar a mistura em ágar LB contendo sacarose e sem cloreto de sódio. Incubar a placa durante a noite a 30 graus Celsius. Localmente colônias isoladas em ágar LB e ágar LB contendo 15 miligramas por mililitro gentamicina, a fim de verificar a sensibilidade da gentamicina.Coloque um deslizamento de vidro microscópio sobre uma superfície horizontal plana e organize dois slides de vidro cobertos com duas camadas de fita adesiva ao seu redor. Pipeta uma gotícula de 70 microliter de 1%derretido surgiu no slide de vidro e colocar um quarto slide em cima para achatar a gotícula de agarose. Pressione suavemente por cerca de um minuto.Retire o slide superior e solte cerca de três microliters de bactérias em três a quatro pontos em diferentes locais na almofada de agarose. Cubra a almofada de agarose com uma mancha de vidro de microscopia e fixe-a com parafina derretida para selá-la no escorregador de vidro começando pelos quatro cantos. Coloque o slide de microscopia no palco com o deslizamento de tampa voltado para o objetivo.Gire a torre do cubo do filtro para selecionar o cubo eGFP e abra o obturador da lâmpada de fluorescência e envie a luz de fluorescência em direção à ocular do microscópio. Concentre o objetivo nas bactérias usando o botão do microscópio. Selecione uma região de interesse na amostra usando o joystick que controla o estágio motorizado.Envie o caminho de emissão de fluorescência de volta para o detector, em seguida, volte a torre do cubo do filtro para selecionar o cubo dicâmico para o laser de 930 nanômetros e definir a potência laser para 20 miliwatts. Defina o tamanho da região de interesse para 30 micrômetros que ajusta a tensão que opera os espelhos galvo e define a faixa de seus movimentos. Ligue o detector e comece a digitalizar a amostra.Escolha o campo de visão para imagens movendo finamente o estágio da interface do computador. Isso pode ser feito na configuração movendo a cruz na imagem no software de controle de microscópio que definirá o novo centro da imagem e pressionará o estágio de movimento. Um bom campo de visão para aquisição deve conter de 10 a 30 bactérias imóveis, todas em foco.Se estiver interessado em extrair dados de film-FRET de células únicas, certifique-se de que as bactérias estejam bem individualizadas. Abra o software de imagem e verifique se a taxa de contagem de fótons não é muito alta para evitar um efeito de acúmulo que pode influenciar as medições ao longo da vida. Se necessário, diminua a intensidade do laser para manter a taxa de contagem de fótons baixa.Ajuste os parâmetros de aquisição, incluindo o tempo de coleta de aquisição. Pressione o botão de partida e aguarde a conclusão da aquisição. Para analisar os dados, abra o RStudio e crie um novo projeto.Crie uma nova pasta na pasta principal do projeto e nomeie-a para dados e, em seguida, mova todas as análises para esta pasta. Abra um novo arquivo de script ou o script suplementar flim_analysis.r. Instale o pacote FlimDiagRam dedicado para análise de dados de filme e ligue para o pacote no espaço de trabalho.Funções de distribuição cumulativa empíricas das vidas de fluorescência medidas para as diferentes cepas bacterianas são mostradas aqui. Se o FRET ocorrer, as funções ão deslocadas para as vidas mais curtas. É importante notar que o FRET não pode ocorrer quando a interação das duas proteínas resulta em uma longa distância entre os dois fluroforos, o que não pode ser distinguido da ausência de interação.Portanto, pode ser necessário rotular as proteínas em diferentes posições para maximizar as chances de sondar a interação. Devido à grande diferença nas expressões proteicas entre PvdA e PvdL, o mesmo complexo não resulta em dados semelhantes film-FRET. Estequiometrias desequilibradas levam a diferenças na contribuição do livre em comparação com as proteínas vinculadas rotuladas por doadores na distribuição de vida da fluorescência registrada.O enredo do diagrama pode ser usado para fornecer informações críticas sobre a estequiometria. No mutante PvdA-eGFP mCherry-PvdL, a quantidade de PvdA rotulado por doadores é muito maior do que a quantidade de mCherry-PvdL. Entre todos os doadores presentes na amostra, apenas alguns deles estão interagindo com o PvdL.O único valor tau um centrado em aproximadamente 2,3 nanossegundos sugere que cada doador PvdA-eGFP só pode ser transferido com um aceitador mCherry-PvdL. Quando a rotulagem é invertida, espera-se que a maioria das proteínas eGFP-PvdL interajam com PvdA-mCherry, o que é confirmado pelos valores alfa um mais altos. Os valores tau um tornaram-se mais distribuídos sugerindo que múltiplas proteínas PvdA podem se ligar a uma única proteína PvdL.A configuração FLIM está se tornando disponível em um número crescente de instalações de imagem. Amostras de imagem em um FILM-FRET não são mais complicadas do que a imagem em microscopia de vídeo.

flim-fret-measurements-protein-protein-interactions-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve como imagem de interações proteína-proteína através de um ensaio de proximidade FRET-based.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia é uma técnica poderosa para monitoramento em tempo real de eventos de sinalização em células vivas usando biossensores diversos como repórteres. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagens a partir de componentes disponíveis comercialmente e como usá-lo para FRET experimentos.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

O vídeo descreve a técnica de imagem FLIM-FRET para determinar a interação proteína-proteína em bactérias vivas que expressam proteínas citoplasmáticas marcadas com proteínas fluorescentes, um doador eGFP e um aceptor mCherry. A técnica combinada também permite a quantificação das proteínas que interagem.

Imagem FLIM-FRET para caracterização de interações proteína-proteína em bactérias vivas

Microscopia localização fotoativado (PALM), combinada com uma única molécula de rastreamento permite a observação direta e quantificação das interações DNA-proteína em células de Escherichia coli ao vivo.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

Vários biossensores de força baseados em FRET foram desenvolvidos recentemente, permitindo a resolução específica da proteína da força intracelular. Neste protocolo, demonstramos como um desses sensores, projetado para o ligante da proteína do complexo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, pode ser usado para medir as forças de actomiosina no complexo nuclear LINC.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Interações da proteína-proteína são essenciais para sistemas biológicos, e estudos sobre a cinética de ligação fornecem insights sobre a dinâmica e a função dos complexos da proteína. Nós descrevemos um método que quantifica os parâmetros cinéticos de uma proteína complexa usando transferência de energia de ressonância de fluorescência e a técnica de fluxo parou.

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Este artigo fornece um guia passo a passo para investigar a dinâmica de localização subcelular de proteínas e monitorar mudanças morfológicas usando microscopia de fluorescência de alta resolução em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias

A Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) entre duas moléculas de fluoróforo pode ser usada para estudar as interações proteicas na célula viva. Aqui, um protocolo é fornecido sobre como medir o FRET em células vivas, detectando a emissão sensibilizada do aceptor e a têmpera da molécula doadora usando microscopia confocal de varredura a laser.

Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET

Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Aprenda a medir interações proteína-proteína em bactérias vivas usando FLIM-FRET em Pseudomonas aeruginosa. Este método avançado permite analisar relações desequilibradas entre doador e aceptor em tempo real.

Medições FLIM-FRET de Interações proteína-proteína em bactérias vivas.

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