Name: Um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3D com propriedades biofísicos incapazes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a criar um modelo biomimético 3D de câncer de fígado usando hidrogéis com rigidez ajustável e linhagens celulares hepáticas. Este método modular e econômico permite estudar interações complexas entre tumor e estroma em hepatocarcinogênese.

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Esta pesquisa foi financiada por meio de bolsas obtidas da Fundação Sueca do Câncer (Cancerfonden, CAN2017/518), da sociedade sueca de pesquisa médica (SSMF, S17-0092), da fundação O.E. och Edla Johanssons e da fundação Olga Jönssons.  Essas fontes de financiamento não estavam envolvidas no desenho do estudo; coleta, análise e interpretação dos dados; redação do relatório; e na decisão de submeter o artigo para publicação. A impressão 3D de espaçadores personalizados usados neste protocolo foi realizada na U-PRINT: a instalação de impressão 3D da Universidade de Uppsala no Domínio Disciplinar da Medicina e farmácia, U-PRINT@mcb.uu.se. Gostaríamos de agradecer a Paul O'Callaghan por sua valiosa contribuição em nosso projeto.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig1.jpg"> Figura 1: Representações gráficas da criação do modelo HCC biomimético 3D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
NOTA: O fluxo de trabalho global deste protocolo está definido nas ilustrações da Figura 1
1. Preparação da solução de estoque fibrinogênico
<ol><li>Prepare uma solução de estoque de 1 M de cloreto de cálcio (CaCl2),pesando 2,21 g CaCl2 e adicionando-a a 20 mL de água destilada (dH2O). A solução de estoque pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de aprotinina de 20 mL (1218,75 KIU/mL) pesando 5 mg de aprotinina e adicionando-a a 20 mL dH2O. Solução de estoque aliquot em alíquotas de 1 mL e armazenar a -20 °C.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque fibrinogênico de 10 mL de 80 mg/mL.<ol>
<li>Em um tubo de 50 mL adicione 7.849 mL de salina tamponada de fosfato (PBS), 2,051 mL aprotinina (1218,75 KI LU/mL) para uma concentração final de aprotinina de 250 KIU/mL e 100 μL CaCl2 (1M) para uma concentração final de CaCl2 de 10 mM.</li>
		<li>Pesar 800 mg de fibrinogênio.</li>
		<li>Pesar 200 mg de cloreto de sódio (NaCl) para que a solução de estoque contenha 2% de c/v NaCl.</li>
		<li>Adicione o fibrinogênio e o NaCl em incrementos ao tubo de 50 mL contendo o PBS, aprotinína e CaCl2. Não mexa ou agite vigorosamente, pois isso resultará em gelagem de fibrinogênio e emperramentos se formando na solução.</li>
		<li>Coloque o tubo de 50 mL da solução de caldo fibrinogênico horizontalmente em um agitador e agite a uma configuração baixa de 300 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que a solução tenha dissolvido, filtre-a usando um filtro de seringa de 0,22 μm ou um filtro de topo de garrafa, dependendo do volume. É importante ressaltar que não autoclave a solução fibrinogênio, pois isso destruirá o fibrinogênio. NOTA: Esta parte do protocolo pode levar entre 2 a 5 h, dependendo da quantidade de solução de estoque, este tempo deve ser levado em consideração durante a configuração experimental.</li>
</ol>2. Revestimento insere com colágeno antes de semear os hidrogéis nas pastilhas
<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar ou uma capa de cultura de tecido, usando pinças esterilizadas, remova as pastilhas da placa e coloque invertido na tampa da placa.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de ácido acético glacial de 100 mL adicionando 115 μL de ácido acético glacial a 25 mL de dH2O e ajuste a um volume final de 100 mL com dH2O. Filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,22 μm. A solução de estoque pode ser armazenada na RT.</li>
	<li>Prepare 2 mL de uma solução de colágeno de 100 μg/mL a partir de uma solução de colágeno de 5 mg/mL adicionando 40 μL da solução de colágeno de 5 mg/mL a 1.960 mL da solução de 20 mM de ácido acético glacial preparada em 2,2.</li>
	<li>Cubra as pastilhas com a solução de colágeno de 100 μg/mL preparada em 2,3 por pipetação de 100 μL da solução em cada inserção. Deixe inserir ar seco dentro da capa de fluxo laminar ou da capa de cultura de tecido por 2 a 3 horas.</li>
	<li>Uma vez que as pastilhas tenham lavado seco cada inserção 3x com PBS. Adicione 1 mL de PBS a cada poço de uma placa de 12 poços, coloque as pastilhas com revestimento de colágeno voltado para baixo nos poços, retire o PBS do poço e repita o procedimento. Deixe inserir ar seco dentro do capô de fluxo laminar de 1 a 2 h. ATENÇÃO: O ácido acético é tóxico para as células e as pastilhas devem ser lavadas completamente com PBS.</li>
	<li>Adicione um espaçador impresso 3D personalizado sobre as pastilhas, isso será necessário uma vez que os géis estejam pendurados na pastilha para evitar que toquem no poço inferior da placa(Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig2.jpg"> Figura 2: Espaçador impresso 3D personalizado <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="7"><li>Cubra as pastilhas invertidas com a parte inferior da placa e coloque na incubadora até que as células estejam embutidas nos hidrogéis e prontas para serem semeadas.</li>
</ol>3. Células de semeadura embutidas em hidrogéis em pastilhas
NOTA: A Tabela 1 fornece uma descrição de 3 formulações com concentrações variadas fibrinogenas que serão preparadas. Formulação uma corresponde ao fígado durante o início da fibrose, duas cirrose e três HCC, os valores de rigidez para cada uma dessas formulações foram determinados com reologia durante a otimização do protocolo.
<table border="1" fo:font-size="6px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Formulação</td>
			<td>Concentração final de fibrinogênio (mg/mL)</td>
			<td>Concentração final de colágeno (mg/mL)</td>
			<td>Células (LX2 + HepG2 Co-cultura 1:1)</td>
			<td>Estágio do fígado</td>
			<td>Valores de rigidez hepática da literatura (kPa)</td>
			<td>Valor de rigidez do modelo de Reologia (kPa)</td>
			<td>Formulação</td>
			<td>Fibrinogen para adicionar (mL)</td>
			<td>Colágeno para adicionar (mL)</td>
			<td>10 % DMEM (mL)</td>
			<td>Trombina (μL)</td>
			<td>
Referências</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 células/mL</td>
			<td>Fibrose</td>
			<td>≥2</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4</td>
			<td>28; 29; 30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 células/mL</td>
			<td>Cirrose</td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>2</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.45</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 células/mL</td>
			<td>Hcc</td>
			<td>≥10</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1</td>
			<td>28; 31; 32</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Descrição das formulações para células semeadas embutidas em hidrogéis em pastilhas
<ol><li>Prepare a solução de caldo hidróxido de sódio de 1 M adicionando 3,99 g de NaOH a 100 mL de dH2O.  A solução pode então ser filtrada usando um filtro de seringa de 0,22 μm. Armazene a solução de estoque na RT.</li>
	<li>Coloque o colágeno de 5 mg/mL e 10 mL de 1 M NaOH no gelo.</li>
	<li>Pré-aqueça 50 mL PBS, 15 mL trypsin, 70 mL 10% DMEM, e solução de estoque fibrinogênico, preparada na seção 1, a 37 °C por 20 minutos em banho-maria.</li>
	<li>Prepare as suspensões das células.<ol>
<li>Lave células estelares hepáticas (LX2) e carcinoma hepático (HepG2) em frascos de cultura T175 duas vezes com 10 mL de PBS.</li>
		<li>Células de trypsinize com trippsina de 6 mL por 4 min a 37 °C.</li>
		<li>Inativar trippsina com 6 mL de 10% de DMEM.</li>
		<li>Colete a suspensão celular em tubo de 15 mL e centrífuga por 3 min a 300 x g.</li>
		<li>Após a centrifugação, aspire o supernaspe e resuspenda cada linha celular em 5 mL de 10% DMEM.</li>
		<li>Conte as células usando um contador automático de células: Adicione 10 μL de cada suspensão celular ao slide da câmara de contagem e insira o slide no balcão da célula. A contagem de células é exibida como células/mL.</li>
		<li>Diluir as células de cada linha celular para 1 x 106 células por mL usando a contagem de células na etapa 3.4.6 em tubos claramente marcados de 15 mL. Centrifugar as diluições por 3 min a 300 x g.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a centrifugação, aspire o supernasce e adicione 10% de DMEM a cada tubo de 15 mL de acordo com a Tabela 1, os valores fornecidos na Tabela são para 2 mL de cada formulação.</li>
	<li>Neutralizar a quantidade de colágeno com 10 μL/mL NaOH (1 M), e adicionar o colágeno neutralizado à suspensão da célula, o presente de 10% DMEM ficará amarelo, uma vez que a suspensão é completamente misturada por pipetação com uma ponta de corte ele vai ficar um rosa brilhante.</li>
	<li>Adicione fibrinogênio à suspensão da célula de colágeno de acordo com a Tabela 1, usando uma ponta de pipeta cortada, misture bem a suspensão.</li>
	<li>Por fim, adicione trombina à suspensão de células de colágeno-fibrinogênio, trombina KIU de 0,1 KIU para cada 10 mg de fibrinogênio.</li>
	<li>Remova as pastilhas invertidas pré-revestidas preparadas na seção 2 da incubadora e utilizando uma ponta de pipeta de 200 μL cortada, pipeta 200 μL da suspensão preparada nas pastilhas designadas. Deixe os géis atravessarem por 15 minutos dentro do capô de fluxo laminar.</li>
	<li>Depois de 15 min, coloque suavemente a parte inferior da placa sobre os géis e mova-os para a incubadora para permitir que os géis cruzem a 37 °C por 45 min.</li>
	<li>Uma vez que os géis tenham cruzado, inverta as pastilhas novamente e adicione 2 mL de 10% DMEM a cada um dos poços inferiores da placa.</li>
</ol>4. Semeando células endoteliais
<ol><li>Solução de sal balanceada de 25 mL hanks (HBSS), 10 mL trypsin, 10 mL inibidor de trippsina e 50 mL de crescimento endotelial médio, até 37°C por 20 minutos em banho-maria .</li>
	<li>Prepare a suspensão celular endotelial (HUVEC).<ol>
<li>Lave as células HUVEC em frascos de cultura T175 duas vezes com HBSS de 10 mL.</li>
		<li>Células de trypsinize com trippsina de 6 mL por 4 min a 37 °C. Inativar trippsina com inibidor de trippsina de 6 mL. Colete a suspensão celular em 15 mL de tubo e centrífuga por 3 min a 200 x g.</li>
		<li>Após a centrifugação aspirar o supernasciente e suspender as células em meio de crescimento endotelial de 5 mL.</li>
		<li>Conte as células como descrito anteriormente em 3.4.6 usando um contador de células automatizado.</li>
		<li>Usando a contagem de células do contador celular, prepare a densidade de semeadura de 1,0 x 104 células/mL em meio de crescimento endotelial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semente 500 μL da suspensão da célula HUVEC em cada poço da parte superior da inserção para ter um volume final de 5,0 x 103 células por inserção.</li>
</ol>5. Manutenção
<ol><li>Substitua o meio de crescimento a cada dois dias, aspirado ao meio de crescimento gasto tanto do poço quanto da inserção. Adicione 2 mL 10% DMEM aos poços que contêm o gel e meio de crescimento endotelial de 0,5 mL às pastilhas que contêm as células HUVEC.</li>
	<li>Mantenha o modelo por 21 dias antes da experimentação.</li>
</ol>6. Reologia
<ol><li>Medir o moduli de armazenamento das formulações de gel para indicar valores de rigidez usando um reômetro, realizando varreduras de frequência de 0,1-20 Hz a 0,267% e 37°C, com uma força axial constante de 0,1N usando uma geometria de aço inoxidável de placa paralela de 8 mm de diâmetro.</li>
</ol>7. Viabilidade e resposta a medicamentos
<ol><li>Determine a resposta e viabilidade da droga em co-culturas 2D e modelo 3D.<ol>
<li>Seed HepG2 (5.0 x 103 células/mL) e LX2 (5,0 x 103 células/mL) em uma proporção de 1:1 para a cocultura 2D em um fundo preto claro 96-well placas a uma densidade semeada de 1,0 x 104 células/mL.  Permitir que as células se conectem durante a noite.</li>
		<li>Configure o modelo 3D para corresponder a um ambiente cirrótico com um valor de rigidez de 6 kPa.  Mantenha o modelo por 21 dias antes do tratamento com Doxorubicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Duas horas antes do tratamento da doxorubicina, aspire o meio de cultura tanto do modelo 2D quanto 3D. Lave os dois modelos duas vezes com PBS. Adicione o meio de fome (DMEM suplementado com solução antimíctica antimíctica de 1% v/v) à cocultura 2D (200 μL por poço) e ao modelo 3D (2 mL aos poços que contêm o hidrogel e 500 μL à inserção).</li>
	<li>Administre a doxorubicina tanto no modelo 2D quanto no 3D.  As doses são as seguintes: 0,5, 1 e 1,5 mM correspondentes aos valores IC25, 50 e 75, respectivamente.  Trate ambos os modelos por 72 h. NOTA: A doxorubicina, inibidora de topoisomerase II, é uma das primeiras drogas quimioterápicas utilizadas para o HCC e também é um dos agentes quimioterápicos mais ativos no tratamento do HCC33,34.</li>
	<li>Após 72 h, média de cultura aspirada tanto do modelo 2D quanto 3D. Certifique-se de que qualquer meio de cultura restante seja removido lavando ambos os modelos duas vezes com PBS.</li>
	<li>Prepare a AlamarBlue de acordo com as recomendações do fabricante e adicione aos poços do modelo 2D e 3D. Adicione 150 μL por poço para a cultura 2D e 2 mL por poço e 500 μL por inserção para cultura 3D.  Incubado durante a noite a 37°C.</li>
	<li>Após a transferência de incubação 150 μL do AlamarBlue de cada poço da configuração 3D em uma placa de fundo claro preto de 96 poços. AlamarBlue pode ser lido diretamente da placa para o modelo 2D.</li>
	<li>Leia a fluorescência com um leitor de microplaca no comprimento de onda de excitação e comprimento de onda de emissão de 485 e 550 nm, respectivamente.</li>
	<li>Calcule a viabilidade celular percentual em ambos os modelos usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61606/61606eq1.jpg">
</li>
</ol>

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<li>Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. -K., Ertl, P., Küpcü, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+spheroidal+age+on+sorafenib+diffusivity+and+toxicity+in+a+3D+hepg2+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D hepg2 spheroid model.</a> Scientific Reports. 9, 4863(2019).</li>
<li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+trypsinisation%2C+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).</li>
<li>Wrzesinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+spheroids+exhibit+stable+physiological+functionality+for+at+least+24+days+after+recovering+from+trypsinisation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation.</a> Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+of+liver+bioengineering+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079(2015).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+3D+bioprinting+of+decellularized+extracellular+matrix+with+regionally+varied+mechanical+properties+and+biomimetic+microarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture.</a> Biomaterials. 185, 310-321 (2018).</li>
<li>Mueller, S., Sandrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stiffness%3A+a+novel+parameter+for+the+diagnosis+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatic+Medicine%3A+Evidence+and+Research%22%5BJournal%5D)">Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease.</a> Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).</li>
<li>Wang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+liver+stiffness+in+a+rat+model+of+hepatic+fibrosis+with+acoustic+radiation+force%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).</li>
<li>Georges, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+liver+stiffness+of+the+rat+liver+precedes+matrix+deposition%3A+implications+for+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).</li>
<li>Massironi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+Liver+stiffness+and+hepatocellular+carcinoma%3A+is+it+really+useful%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful.</a> Journal of Hepatology. 58, 293(2013).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stiffness+is+associated+with+risk+of+decompensation%2C+liver+cancer%2C+and+death+in+patients+with+chronic+liver+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).</li>
<li>Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gemcitabine+and+doxorubicin+for+the+treatment+of+patients+with+advanced+hepatocellular+carcinoma%3A+a+phase+I-II+trail%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Gemcitabine and doxorubicin for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma: a phase I-II trail.</a> Annals of Oncology. 13, 1771-1778 (2002).</li>
<li>Le Grazie, M., Biagini, M. R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+for+hepatocellular+carcinoma%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future.</a> World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).</li>
<li>Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cues+guiding+matrix+stiffness+in+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis.</a> BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).</li>
<li>Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen-related+proteins+in+tissue+repair%3A+how+a+unique+domain+with+common+structure+controls+diverse+aspects+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing.</a> Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).</li>
<li>Smit, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+alginated+encapsulated+LS180+spheroid+model+for+anti-colorectal+cancer+compound+screening%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).</li>
<li>Schrader, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+modulates+proliferation%2C+chemotherapeutic+response%2C+and+dormancy+in+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells.</a> Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).</li>
<li>Lachowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+modulates+the+activity+of+MMP-9+and+TIMP-1+in+hepatic+stellate+cells+to+perpetuate+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis.</a> Scientific Reports. 9, 7299(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um método para criar um modelo biomimético para hcc. Um fluxo de trabalho claro foi estabelecido e as etapas críticas envolvidas foram identificadas. Essas etapas críticas incluem a preparação da solução de estoque de fibrinogênio, o revestimento das pastilhas com colágeno e a semeadura das células embutidas no hidrogel. Durante a preparação da solução de estoque de fibrinogênio é importante adicionar o fibrinogênio em incrementos menores em concentrações mais altas. Isso não só reduzirá o tempo necessário para que o fibrinogênio se dissolva, mas também impedirá que o fibrinogênio de geleia de forma inconsistente e prematura, como visto na Figura 11. A preparação do gel de fibrinogênio leva um tempo considerável e isso pode influenciar o sucesso experimental global. Os resultados indicam que uma vez que o gel de fibrinogênio começa a gelar inconsistentemente é melhor descartá-lo. As pastilhas devem ser revestidas com colágeno, lavadas com PBS e secas dentro da coifa de fluxo laminar antes de semear as células embutidas em hidrogéis. A falha em garantir que as pastilhas estejam secas resultará no derramamento de hidrogéis sobre as bordas da pastilha, resultando em um gel irregular. A irregularidade do gel influenciará, em última análise, os resultados onde a difusão é um fator.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig11.jpg"> Figura 11: Preparação de gel de fibrinogênio para formulações de hidrogel fibrinogênio/colágeno. (A) Solução de gel de fibrinogen que formou aglomerados e começou a gelar prematuramente com fibrinogênio não resolvido aderindo ao tubo. (B) Solução de gel de fibrinogen que se dissolveu completamente, a solução é clara e ligeiramente mais viscosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Recomenda-se trabalhar o mais rápido possível enquanto semeia a suspensão da célula de hidrogel nas pastilhas, pois o componente fibrinogênio começará a cruzar com a adição de trombina.  Prepare volumes de trabalho menores ao trabalhar com suspensões de gel em concentrações mais altas para evitar que o gel entre em tração cruzada durante a semeadura. Este último terá um efeito sobre a distribuição e a quantidade de gel semeado em cada poço. A ordem de adição dos componentes é fundamental, neste protocolo fornecemos um fluxo de trabalho simplificado para evitar que os géis cruzem prematuramente.  Devido à viscosidade da suspensão do gel de hidrogel que trabalha com uma ponta de pipeta cortada é aconselhável durante a mistura e medição.  Ao misturar a suspensão certifique-se de que isso seja feito de forma rápida e uniforme para criar uma suspensão homogênea. A mistura desigual resultará em um gel heterogêneo que afetará negativamente os resultados, ver Figura 12.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig12.jpg"> Figura 12: Géis de colágeno/fibrinogênio semeados em 12 placas de poço. Todos os géis semeados em um volume de 200 μL contendo colágeno de 2mg/mL e fibrinogen de 20 mg/mL com 2,0 x 106 células/mL. (A) Gel de hidrogel com consistência heterogênea, distribuição irregular visível dos hidrogéis. (B) Hidrogels homogeneamente misturados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig12large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Após a otimização do protocolo, o modelo foi avaliado para determinar as propriedades biofísias dos modelos. Dados de reologia mostraram que nosso modelo, composto por componentes da matriz extracelular fisiologicamente relevantes, ou seja, colágeno tipo I e fibrinogênio, foi capaz de imitar as propriedades biofísicas de um fígado fibroso, cirrítmico e HCC28,29,30,31,32. Recapitular a rigidez hepática em modelos 3D para HCC é de considerável importância e muitas vezes é negligenciado durante o desenvolvimento do modelo. O aumento da rigidez hepática está relacionado à resistência quimioterápica, à proliferação, migração e dormência no HCC38. Enquanto a ativação de células estelares hepáticas no HCC está associada ao aumento da rigidez da matriz extracelular, com várias vias de sinalização associadas a essas células estelares hepáticas mostrando mecanosensibilidade39.
A inclusão de células associadas ao estroma, como células estelares hepáticas e células endoteliais no desenvolvimento de modelos 3D para HCC, tornou-se cada vez mais relevante. Estudos mostram que esferoides multicelulares compostos por células estelares hepáticas e HCC resultaram em aumento da resistência quimioterápica e migração invasiva, ao mesmo tempo em que imitavam a aparência do tumor HCC in vivo, quando comparados a um modelo de camundongos PXT e amostras de tecido HCC humano17. Estudo semelhante de Jung et al., 2017 encontrou esferoide multicelular composto por células de carcinoma hepatocelular (Huh-7) e endotelial (HUVEC) promovida vascularização e agressividade22. Estes esferoides mostraram viabilidade em concentrações significativamente maiores de doxorubicina e sorafenib quando comparados com esferoides monocultura Huh-722. A avaliação da viabilidade e resposta do nosso modelo à doxorubicina, com valores de rigidez correspondentes ao de HCC e a inclusão de células associadas ao stroma (LX2 e HUVEC), mostrou uma diminuição semelhante em resposta à quimioterapia quando comparada a um modelo de cocultura 2D.  Assim, imitando efetivamente a resistência medicamentosa tipicamente observada em pacientes e outros modelos 3D HCC.
Por se trata de um sistema modular, o modelo pode ser fortificado pela adição de outros componentes da matriz extracelular, ou seja, laminina e ácido hialurônico. Alternativamente, os hidrogéis atuais utilizados neste modelo podem ser substituídos por hidrogéis sintéticos, como alginato de sódio ou quitosan. Outras modificações no modelo atual podem ser a substituição das linhas celulares por culturas celulares primárias para produzir um modelo ainda mais fisiologicamente relevante ou usando combinações de outras linhas tumorais e células estromicas.
Desenvolvemos com sucesso um modelo 3D com propriedades biofísias tunable para estudar interações tumorais-estroma no HCC.  Descobrimos que nosso modelo é mais representativo da situação in vivo quando comparado com as culturas 2D tradicionais em resposta à doxorubicina. No entanto, ainda há muito a ser feito, esperamos caracterizar extensivamente esse modelo e explorar o modelo como uma possível plataforma metastática para responder a questões mais complexas e urgentes que permanecem no estudo HCC.

O carcinoma hepatocelular (HCC) compreende 90% de todos os cânceres hepáticos primários1,2. Com 810.000 mortes e 854.000 novos casos relatados anualmente, ele é atualmente classificado como o quinto câncer mais comum em todo o mundo com uma das maiores incidências de mortalidade1. O desenvolvimento do CCS é predominantemente atribuído à inflamação associada a doenças hepáticas crônicas, ou seja, hepatite viral, ingestão crônica excessiva de álcool, síndrome metabólica, obesidade e diabetes1,3,4.  A inflamação associada a essas condições patológicas resulta em lesão hepatocitária e secreção de várias citocinas que ativam e recrutam células estelares hepáticas e células inflamatórias para iniciar a fibrose5. As células estelares hepáticas são conhecidas por seu papel fundamental na iniciação, progressão e regressão da fibrose hepática. Após a ativação, eles se diferenciam em myofibroblast como células com propriedades contractile, pró-inflamatórias e pró-fibrinogênicas6,7,8. A fibrose resultante, por sua vez, provoca a desregulação da atividade enzimante de remodelação da matriz extracelular, criando um ambiente caracterizado por um aumento geral da rigidez acompanhado da secreção de fatores de crescimento, o que contribui ainda mais para a patogênese HCC9,10. É este ciclo de feedback patogênico contínuo entre hepócitos e o ambiente estroma, que alimenta a iniciação do câncer, a epitelial às transições mesenquimais (EMT), a angiogênese, o potencial metastático e a resposta alterada da droga11,12,13.  A percepção da hepatocarcinogênese em termos da interação entre o tumor e o microambique tumoral é, portanto, de considerável importância não apenas de uma perspectiva mecanicista, mas também de uma perspectiva de tratamento.
Modelos bidimensionais (2D) de cultura celular in vitro são predominantemente usados por 80% dos biólogos de célulascancerosas 14. No entanto, esses modelos não são representativos do verdadeiro microambi ambiente tumoral, que afeta as respostas quimioterápicas14,15,16. Atualmente, 96% dos medicamentos quimioterápicos falham durante os ensaios clínicos14.  Essa alta incidência nas taxas de atrito de medicamentos pode ser atribuída ao fato de que os modelos de pré-triagem in vitro disponíveis não representam totalmente nossa visão atual e compreensão da complexidade do HCC e do microambiente16. Por outro lado, os modelos animais in vivo apresentam sistemas imunológicos comprometidos e discrepâncias nas interações entre o tumor e o microambiente quando comparados aos humanos16,17. Em média, apenas 8% dos resultados obtidos a partir de estudos em animais podem ser traduzidos de forma confiável do pré-clínico para o quadro clínico16,17. Portanto, fica claro que a avaliação do CCH requer o desenvolvimento de uma plataforma in vitro que recapitula efetivamente a complexidade não só do tumor, mas também do microambiente. As plataformas complementariam os modelos de triagem pré-clínica in vitro atualmente disponíveis e reduziriam a quantidade de estudos em animais no futuro7,14.
Uma dessas plataformas são modelos avançados de cultura celular tridimensional (3D). Uma infinidade desses modelos 3D avançados para estudar o HCC surgiram na última década e várias revisões foram publicadas. Os modelos 3D disponíveis para estudar HCC incluem esferoides multicelulares, organoides, modelos à base de andaimes, hidrogéis, microfluidos e bioimvistos. Destes, os esferoides multicelulares são um dos modelos mais conhecidos utilizados no estudo do desenvolvimento de tumores. Os spheroids são um modelo barato e com baixa dificuldade técnica e, ao mesmo tempo, imitam efetivamente a arquitetura do tumor in vivo18,19,20. Eferóides multicelulares contribuíram para uma riqueza de informações sobre hcc17,21,22. No entanto, o tempo de cultura padronizado é carente, pois os esferoides multicelulares são mantidos na cultura entre 7 e 48 dias. O aumento do tempo de cultura é de considerável importância. Eilenberger descobriu que as diferenças na idade esferoide influenciam profundamente o Sorafenib (inibidor de quinase usado para o tratamento de cânceres de fígado) difusividade e toxicidade23. Enquanto Wrzesinski e Fey descobriram que os spheróides hepatocitos 3D requerem 18 dias para restabelecer as principais funções fisiológicas do fígado após a tentação e continuam a exibir a funcionalidade estável por até 24 dias após estarecuperação 24,25.
Alguns dos modelos 3D HCC mais avançados incluem o uso de andaimes de fígado descelularizados humanos e andaimes bio-impressos. Mazza e colegas criaram um andaime 3D natural para modelagem HCC usando fígados humanos descelularizados inadequados para transplante26. Estes andaimes naturais poderiam ser repovoados com sucesso por 21 dias com uma co-cultura de células hepáticas estelares e hepatoblastoma, mantendo a expressão de componentes da matriz extracelular chave, como colágeno tipo I, III, IV e fibronectina. Além da modelagem da doença, este modelo também oferece a vantagem do transplante funcional de órgãos e do rastreamento pré-clínico de medicamentos e toxicidade26. Com os avanços na bioimprimem 3D, andaimes de matriz extracelular 3D agora também podem ser bio-impressos.  Ma e colegas, andaimes de matriz extracelular bio-impresso com propriedades mecânicas variáveis e microarquitetura biomimética utilizando engenheiro de hidrogéis da matriz extracelular27descelularizada . Sem dúvida, todos estes são excelentes modelos 3D HCC. No entanto, a indisponibilidade dos fígados humanos e o custo envolvido na aquisição dos equipamentos e materiais necessários colocam esses modelos em desvantagem. Além disso, esses métodos são tecnicamente avançados, exigindo treinamento extensivo que pode não estar prontamente disponível para todos os pesquisadores.
Com base na complexidade do HCC e atualmente disponíveis modelos 3D, nos esforçamos para desenvolver um modelo 3D HCC abrangente. Buscamos um modelo capaz de recapitular tanto o microambiente pré-maligno quanto o tumor, incorporando valores de rigidez hidrogel ajustáveis.  Além disso, incluímos também linhas celulares associadas ao hepatocelular e estroma, que desempenham um papel fundamental na patogênese do HCC. Estes incluem células endoteliais, células estelares hepáticas e hepatócitos malignos, cultivados em um microambiente composto por hidrogéis fisiologicamente relevantes. Com os hidrogéis escolhidos, colágeno tipo I e fibrinogênio, incorporados em proporções comparáveis às alterações biofísias vistas na rigidez hepática durante a iniciação e progressão do HCC.  Além disso, buscamos um modelo que pudesse ser mantido na cultura por um período prolongado. Vislumbramos um modelo modular e econômico que pode ser configurado com equipamentos básicos, treinamento mínimo e experiência e materiais prontamente disponíveis.

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue (Sal de sódio de Resazurin)</td> <td>Sigma</td><td>211-500</td><td>Prepare de acordo com as recomendações do fabricante</td></tr><tr><td>Solução antimistótica antibiótica (100 vezes), Estabilizado</td><td>Sigma</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease de Aprotinina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78432</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td> <td>Sigma</td><td>C1016-2.5KG</td><td>Anidro, granular, &le; 7,0 mm, &ge; 93.0%</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Kebo Biomed Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Preto, placa clara da parte inferior lisa 96 poços</td><td>Sigma</td><td>CLS3904-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning HTS Transwell-24 apoios permeáveis bons</td><td>Sigma</td><td>CLS3396-2EA</td><td>HTS Transwell-24 unidades w/0,4 &mu; membrana de policarbonato de poros m e inserções de 6,5 mm, tratadas com TC, estéreis, 2/cs</td></tr><tr><td>Discovery Hybrid Rheometer 2</td><td>instrumentos TA, Sollentuna, Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, suplemento GlutaMAX (células LX2 e HepG2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965059</td><td>Suplementado com 10% v/v FBS e 1% v/v solução antibiótica antimicótica</td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células endoteliais (500 ml) (HUVEC)</td><td>Cell Applications, Inc</td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, qualificado, formato One Shot, Nova Zelândia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3160902</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogênio tipo I-S de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F8630-10G</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega leitor de placas</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks solução salina balanceada</td><td>Sigma</td><td>H9394-500ML</td><td>Modificado, com bicarbonato de sódio, sem cloreto de cálcio e sulfato de magnésio</td></tr><tr><td>Labogene scanspeed 416 centrífuga</td><td>Labogene, Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capa de fluxo laminar</td><td>Kebo Biomed Suécia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toledo AG245 Balança Analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon TMS Microscópio óptico</td><td>Nikon, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tamponamento fosfato comprimido de soro fisiológico</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>Preparar de acordo com a recomendação do fabricante</td></tr><tr><td>Colágeno de cauda de rato Tipo I 5 mg/mL</td><td>Ibidi</td><td>50201</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Merck</td><td>B619298</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 lâminas de contagem</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombina de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>Powder, adequado para cultura de células, &ge; 1.500 unidades NIH/mg de proteína (E1%/280 = 19,5</td></tr><tr><td>)Tripsina (2,5%) 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Diluído para 1x em PBS</td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina de Glycine max (soja)</td><td>Sigma</td><td>T6414-100ML</td><td>Solução, filtrada estéril</td></tr></tbody></table>

um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3d com propriedades biofísicos incapazes

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Carcinoma hepatocelular (HCC) é um tumor hepático primário que se desenvolve na esteira de uma doença hepática crônica. Doença hepática crônica e inflamação leva a um ambiente fibroso apoiando e conduzindo hepatocarcinogênese. A percepção sobre hepatocarcinogênese em termos da interação entre o microambique do tumor e as células tumorais é, portanto, de considerável importância. Modelos tridimensionais (3D) de cultura celular são propostos como o elo perdido entre os modelos atuais in vitro de cultura celular 2D e modelos in vivo animal. Nosso objetivo era projetar um novo modelo HCC biomimético 3D com compartimento estromático e vasculatura fibrosa. Hidrogéis fisiologicamente relevantes, como colágeno e fibrinogênio, foram incorporados para imitar as propriedades biofísicas do tumor ECM. Neste modelo, as células LX2 e HepG2 embutidas em uma matriz de hidrogel foram semeadas na inserção transmembrana invertida. As células HUVEC foram então semeadas no lado oposto da membrana. Três formulações constituídas por hidrogéis ECM incorporados com células foram preparadas e as propriedades biofísias foram determinadas pela reologia. A viabilidade celular foi determinada por um ensaio de viabilidade celular ao longo de 21 dias. O efeito da droga quimioterápica daxorubicina foi avaliado tanto na cocultura 2D quanto no nosso modelo 3D por um período de 72h. Os resultados da reologia mostram que as propriedades biofísicas de um fígado fibroso, cirrítmico e HCC podem ser imitadas com sucesso. No geral, os resultados indicam que este modelo 3D é mais representativo da situação in vivo em comparação com as culturas 2D tradicionais. Nosso modelo de tumor 3D mostrou uma resposta reduzida à quimioterapia, imitando a resistência medicamentosa normalmente vista em pacientes com HCC.

Faixas de concentração e volume de semeadura A otimização do protocolo para obtenção do protocolo de funcionamento final ocorreu de acordo com o diagrama esquemático apresentado na Figura 3. Dois hidrogéis fisiologicamente relevantes, Colágeno tipo I e Fibrinogen, foram identificados por meio de pesquisa bibliologia35,36.  Começando com o colágeno de cauda de rato tipo I, uma gama de concentrações (4, 3, 2 e 1 mg/mL) foi semeada em inserções invertidas para determinar sua capacidade de aderir com sucesso à inserção uma vez invertida novamente. Todas as concentrações dentro desta faixa foram capazes de formar géis, porém os géis de colágeno pareciam achatados e tinham várias bolhas de ar presas dentro deles por causa do manuseio e pipetação, ver Figura 4 e Figura 5. Para determinar o volume ideal de semeadura para melhorar a qualidade do gel de colágeno, uma gama de volumes de semeadura (100, 150 e 200 μL), foi semeada em pastilhas invertidas, ver Figura 5.  O volume de semeadura não teve influência no aparecimento do gel ou na presença de bolhas dentro do gel. Assim, decidiu-se que 200 μL era o volume de semeadura ideal produzindo os géis mais completos. A fibrinogen também foi avaliada por sua capacidade de produzir um gel que pudesse aderir a uma inserção por um período prolongado.  Foi preparada e semeada uma faixa de concentração (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/mL) e semeada a um volume de 200 μL na tampa de uma placa de 12 poços, ver Figura 6. Dentro de 20 min após semeadura todas as concentrações foram capazes de formar com sucesso um gel. No entanto, as concentrações 5 e 1 mg/mL foram excluídas, pois os géis formados tinham uma consistência fluida e começaram a se desprender da tampa após serem mantidos durante a noite a 37 °C.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig3.jpg"> Figura 3: Diagrama esquemático de otimização do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig4.jpg"> Figura 4: Géis de colágeno 4 mg/mL contendo 1,0 x 105 células/mL semeadas em pastilhas mostrando bolhas presentes no gel. A inserção à esquerda foi desgaseada no gelo por 15 minutos, enquanto a inserção à direita não foi desgaseada. A desgaseamento não teve qualquer efeito sobre as bolhas presentes nos géis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig5.jpg"> Figura 5: Géis de colágeno 4 mg/mL contendo 1,0 x 105 células/mL semeadas em pastilhas em volumes variados. (A) Insira no esquerdo 100 μL, médio 150 μL e direito 200 μL, logo após a semeadura. Bolhas nos géis ainda estavam presentes. (B) Insira no 200 μL esquerdo, médio 150 μL e direito 100 μL, após 60 min crosslinking. Todos os géis, independentemente do volume, ainda parecem planos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig6.jpg"> Figura 6: Fibrinogen (200 μL) em uma faixa de concentração de 70 a 1 mg/mL semeada na tampa de uma placa de 12 poços. (A) Géis logo após a semeadura. (B) Géis 20 min após a semeadura. (C)Géis mantidos durante a noite. Todos os géis parecem bem arredondados, os géis de 5 mg/mL e 1 mg/mL foram excluídos, pois pareciam ter uma consistência mais fluida 20 min após a semeadura e começaram a se desprender da tampa depois de serem mantidos durante a noite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Colágeno e fibrinogênio de combinação Com base nos resultados da concentração de colágeno e fibrinogênio, foi avaliado o efeito da combinação do colágeno e fibrinogênio. Três pastilhas foram configuradas com o seguinte, colágeno de 4 mg/mL, fibrinogen de 20 mg/mL e uma ração 1:1 de colágeno (4 mg/mL) e fibrinogen (20 mg/mL), ver Figura 7. Logo após a semeadura dos hidrogéis, observamos que a inserção apenas com colágeno ainda tinha uma aparência plana combinada com a ocorrência de bolhas dentro do gel. As pastilhas com fibrinogênio produziram um gel completo e arredondado, assim como a inserção com a combinação de colágeno e fibrinogênio. Após a ligação cruzada a 37 °C por 60 min, todos os géis se fixaram na pastilha e permaneceram anexados após a incubação durante a noite a 37 °C.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig7.jpg"> Figura 7: Efeito da combinação de colágeno e fibrinogênio. (A) Colágeno 4 mg/mL semeado na inserção à esquerda, fibrinogen 20 mg/mL semeado na inserção no meio e colágeno 4 mg/mL, fibrinógeno 20 mg/mL (1:1 ração) semeado na inserção à direita. Todos os géis semeados em um volume de 200 μL contendo 1,0 x 105 células/mL, todos os géis foram cruzados por 60 min a 37 °C.(B) Colágeno 4 mg/mL 60 min após crosslinking, gel parecia plano e tinha bolhas. (C) Insira no fibrinênio esquerdo 20 mg/mL, o gel apareça arredondado, sem bolhas presentes, insira no colágeno direito 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/mL gel, gel é bem arredondado sem bolhas. (D) Gel de colágeno 4 mg/mL depois de ser mantido durante a noite a 37 °C, o gel ainda continha uma grande quantidade de bolhas, algum inchaço do gel ocorreu. (E) Fibrinogen 20 mg/mL mantido durante a noite a 37 °C. (F) Colágeno 4 mg/mL, fibrinogen 20 mg/mL gel mantido durante a noite a 37 °C. Clique aqui para ver uma versão maior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig7large.jpg" target="_blank">desta figura.</a>
Determinando a densidade de semeadura celular Com base na experiência anterior de trabalhar com hidrogéis, foi configurado um experimento para determinar a densidade ideal de semeadura celular (dados não mostrados)37. As células foram incorporadas em uma combinação de colágeno e fibrinogênio na seguinte faixa de concentração (7,5 x 105, 8,5 x 105, 9,5 x 105, 1.0 x 106, 1,5 x 106 e 2,0 x 106 células/mL), 2,0 x 106 células/mL foi encontrada como a densidade ideal de semeadura.
Reologia Dez formulações das combinações de hidrogel fibrinogênio e colágeno foram avaliadas por meio de reologia, ver Tabela 2. O objetivo era determinar qual dessas formulações poderia imitar a rigidez hepática vista durante o desenvolvimento do HCC. A literatura forneceu valores conhecidos de rigidez hepática para ratos, camundongos e seres humanos durante a fibrose, cirrose e HCC e o objetivo era chegar o mais próximo possível desses valores28,29,30,31,32. As dez formulações estabelecidas na Tabela 2 foram preparadas em triplicado e o módulo de armazenamento de cada um foi determinado por meio de um reômetro, resultados mostrados na Figura 8.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Formulação</td>
			<td>Fibrinogênio (mg/ml)</td>
			<td>Colágeno (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Combinações de colágeno e fibrinogênio em várias concentrações avaliadas com Reologia para determinar valores de rigidez
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig8.jpg"> Figura 8: Valores de rigidez de hidrogel para combinações de colágeno e fibrinogênio em várias concentrações avaliadas com Reologia. O módulo de armazenamento e o módulo de perda foram determinados a 37 °C e 1Hz por meio de um Reômetro Híbrido Discovery HR-2 (n = 3, Barras de Erro = SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Dessas dez fórmulas, três foram escolhidas para prosseguir. Estes incluíram 2 mg/mL colágeno tipo I e fibrinogen de 10 mg/mL correspondentes aos valores de rigidez hepática no início da fibrose, 2 mg/mL de colágeno tipo I e fibrinogen de 30 mg/mL correspondente à cirrose e 2 mg/mL de colágeno tipo I e 40 mg/mL fibrinogen correspondente ao HCC, ver Figura 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig9.jpg"> Figura 9: Valores de rigidez de hidrogel para várias formulações de hidrogel fibrinogênio/colágeno escolhidos para continuar.  O módulo de armazenamento e o módulo de perda foram determinados a 37 °C e 1 Hz (n = 3, barras de erro = SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Viabilidade, resposta a medicamentos e potencial metastático Os resultados do ensaio alamarblue mostraram uma viabilidade celular global reduzida dentro da cocultura 2D, menor do que o esperado com base nos valores conhecidos relatados ic 25, 50 e 75, quando comparado com o controle não tratado, ver Figura 10. Isso pode ser atribuído às células LX2 em nossa co-cultura que são mais sensíveis ao tratamento da Doxorubicina. No entanto, em nosso modelo 3D notamos e aumentamos a resistência à doxorubicina, confirmando a diminuição do potencial quimioterápico frequentemente visto em sistemas de modelos 3D. A significância estatística em relação aos controles foi avaliada utilizando-se o teste T Estudantil (duas caudas), com P&lt;0,05 considerado significativo.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig10.jpg"> Figura 10: Viabilidade celular percentual de um modelo de cocultura 2D em comparação com o modelo 3D após o tratamento com Doxorubicina em várias concentrações por um período de 72h. Os resultados normalizados em relação ao controle não tratado (n=3, barras de erro = SD) (* = p&lt;0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os construtos de gel foram inspecionados visualmente diariamente usando um microscópio de luz para acompanhar o crescimento celular dentro de diferentes concentrações dos hidrogéis. As células encheram os hidrogéis de forma homogênea e compacta, a partir do dia 7 os esferoides começaram a se reunir dentro da matriz.

Este protocolo apresenta um modelo biomimético 3D com compartimento estrommal fibroso que acompanha. Preparado com hidrogéis fisiologicamente relevantes em proporções que imitam as propriedades biofísicas da matriz extracelular estrominal, mediador ativo de interações celulares, crescimento tumoral e metástase.

Um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3D com propriedades biofísicos incapazes

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Este modelo recapitula os microambientes pré-malignos e tumorais, incorporando hidrogéis fisiologicamente relevantes com rigidez ajustável e linhas celulares associadas a hepatocelulares e estroma. Este modelo é modular e econômico, pode ser preparado com equipamentos básicos e materiais prontamente disponíveis e pode ser usado para estudar interações complexas tumor-estroma. Este modelo de interação tumor-estroma pode fornecer informações sobre a hepatocarcinogênese.E isso é muito importante tanto para uma perspectiva mecanicista quanto para uma perspectiva de tratamento. Demonstrando o procedimento com Carlemi Calitz estará Jenny Rosenquist, uma estudante de doutorado do laboratório Angstrom. Para preparar 10 mililitros de uma solução estoque de fibrinogênio de 80 miligramas por mililitro, primeiro adicione 2,21 gramas de cloreto de cálcio e cinco miligramas de aprotinina a volumes individuais de 20 mililitros de água destilada.Em seguida, adicione 2,051 mililitros da solução-mãe de aprotinina e 100 microlitros da solução-mãe de cloreto de cálcio a 7,849 mililitros de PBS. Em seguida, adicione gradualmente 800 miligramas de fibrinogênio e 200 miligramas de cloreto de sódio à solução sem mexer ou agitar e coloque o tubo de solução estoque de fibrinogênio horizontalmente em um shaker. Após duas a cinco horas de agitação a 300 rotações por minuto, filtrar a solução resultante para remover os grumos que se formaram durante a preparação.Para revestimento de colágeno de inserção de cultura de células, em um gabinete de biossegurança, use uma pinça esterilizada para inverter as inserções na tampa da placa de cultura de células. Em seguida, misture 115 microlitros de ácido acético glacial com 25 mililitros de água destilada antes de ajustar a solução com água destilada adicional para um volume final de 100 mililitros antes de filtrar. Para preparar dois mililitros de uma solução de colágeno de 100 microgramas por mililitro, adicione 40 microlitros de uma solução de colágeno de cinco miligramas por mililitro a 1,9 mililitros da solução estoque de ácido acético glacial de 20 milimolares.Adicione 100 microlitros da solução de colágeno resultante na parte inferior de cada inserção. Quando as pastilhas secarem, coloque um espaçador impresso em 3D personalizado sobre as pastilhas. Após duas a três horas de secagem ao ar, lave as inserções colocando-as brevemente, com o lado do revestimento de colágeno voltado para baixo, em poços individuais de uma placa de 12 poços contendo um mililitro de PBS fresco por poço por lavagem.Após a última lavagem, coloque as inserções de volta na tampa da placa por mais uma a duas horas de secagem ao ar. Em seguida, cubra as inserções invertidas com o fundo da placa e coloque as inserções na incubadora de cultura de células. Antes de semear as células, adicione 3,99 gramas de hidróxido de sódio a 100 mililitros de água destilada e filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,22 micrômetros.Em seguida, lave as culturas de células estreladas hepáticas e carcinoma hepático T175 duas vezes com 10 mililitros de PBS por lavagem antes de tratar as células com seis mililitros de tripsina por quatro minutos a 37 graus Celsius. Quando as células se desprenderem, inative as enzimas com seis mililitros de 37 graus Celsius 10% DMEM e transfira cada cultura de células para tubos individuais de 15 mililitros. Sedimentar as células por centrifugação.E ressuspenda os pellets em cinco mililitros de DMEM pré-aquecido a 10% por tubo. Após a contagem, diluir ambas as populações de células para 10 elevado ao sexto por mililitro de concentrações médias e recolher as células por centrifugação. Depois de remover os sobrenadantes, adicione o volume apropriado de DMEM a 10% pré-aquecido às células, conforme indicado na tabela, e neutralize o volume apropriado de colágeno de quatro graus Celsius com 10 microlitros por mililitro de hidróxido de sódio de quatro graus Celsius.Adicione o colágeno neutralizado resfriado à suspensão celular. O meio ficará amarelo. Depois de misturar bem a suspensão com uma ponta de pipeta cortada, o meio ficará rosa brilhante.Adicione o volume apropriado de fibrinogênio a 37 graus Celsius, conforme indicado na tabela, e use uma ponta de pipeta cortada para misturar bem a suspensão. Após a mistura, adicione 0,1 quilo de unidades internacionais de trombina para cada 10 miligramas de fibrinogênio a cada tubo e use uma ponta de pipeta modificada de 200 microlitros para adicionar 200 microlitros da suspensão celular ao fundo de cada inserção. Deixe os géis reticularem por 15 minutos em temperatura ambiente antes de colocar suavemente a seção inferior da placa sobre os géis e, em seguida, coloque as inserções na incubadora para reticulação adicional a 37 graus Celsius por 45 minutos.No final da incubação, coloque as inserções em poços individuais de uma placa de 12 poços e adicione dois mililitros de DMEM a 10% pré-aquecido a cada poço. Para a semeadura de células endoteliais nas inserções, lave uma cultura de células endoteliais vasculares humanas T175 com 10 mililitros de PBS antes de separar as células com tripsina a 37 graus Celsius, conforme demonstrado. Ressuspenda as células em cinco mililitros de meio de crescimento endotelial para contagem e ressuspenda as células para 10 elevado ao quarto de células por mililitro de concentração do meio de crescimento endotelial.Em seguida, adicione 500 microlitros de células ao topo de cada inserto e coloque a placa na incubadora de cultura de células por 21 dias. Para medir os módulos de armazenamento das formações de gel, use um reômetro 60 minutos após a semeadura para realizar varreduras de frequência de 0,1 a 20 Hertz a 0,26% e 37 graus Celsius com uma força axial constante de 0,1 Newtons usando uma placa paralela de oito milímetros de diâmetro com geometria de aço inoxidável. Nesta análise representativa, 10 formulações das combinações de hidrogéis de fibrinogênio e colágeno foram preparadas para determinar quais formulações poderiam mimetizar rigidez hepática semelhante à observada durante o desenvolvimento de um carcinoma hepatocelular.O módulo de armazenamento de cada concentração foi então determinado usando um reômetro. Dessas 10 fórmulas, foram selecionados os dois miligramas por mililitro de colágeno tipo um a 10 miligramas por mililitro de fibrinogênio, que corresponde aos valores de rigidez hepática no início da fibrose, dois miligramas por mililitro de colágeno tipo um a 30 miligramas por mililitro de fibrinogênio, que corresponde à cirrose e dois miligramas por mililitro de colágeno tipo um e 40 miligramas por mililitro de fibrinogênio que corresponde ao carcinoma hepatocelular. A análise do AlamarBlue mostrou uma viabilidade celular geral reduzida em coculturas 2D que é menor do que o esperado com base nos valores de concentração inibitória relatados conhecidos em comparação com um controle não tratado.No modelo 3D, no entanto, foi observado um aumento na resistência à doxorrubicina. Certifique-se de agir rapidamente ao semear a suspensão de células de hidrogéis nas inserções, pois um fluxo de trabalho simplificado é essencial para o sucesso do protocolo. A otimização das técnicas de isolamento de RNA e proteínas permitirá estudar mais as interações tumor-estroma em nível transcricional e translacional.

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JoVE Journal

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