Monitoramento em tempo real da aurora quinase Uma ativação usando biosensores de FRET conformacional em células vivas

Este método pode ser utilizado para detectar a ativação da Aurora quinase A, de forma rápida e robusta, utilizando biossensores fluorescentes, baseando-se nos princípios do FRET. Ao medir a eficiência do FRET de maneira rápida e online, podemos determinar instantaneamente se a Aurora quinase A está ativando ou não. O dispositivo FRET-FLIM é relativamente fácil de montar e pode ser usado em qualquer microscópio de filme branco que tenha uma porta lateral livre.

Depois de selecionar um par de FRET aceito doador no banco de dados de proteínas fluorescentes, no menu de ferramentas, selecione spectra viewer, clique em fechar para ignorar a janela de boas-vindas e digite o nome do par de força floral a ser visualizado na caixa de pesquisa. Para simular as propriedades do par doador, aceitador com uma fonte de luz específica, selecione um determinado laser e clique em normalizar emissão para ele. Para ajustar os espectros de força da flora para o comprimento de onda desejado.

No dia seguinte à sincronização, substitua o Supernat sem cortisol suplementado por PBS pré-aquecido estéril e lave as células com um balanço suave duas vezes à temperatura ambiente. Após a segunda lavagem, alimente a cultura com meio de imagem pré-aquecido estéril e coloque rapidamente as células na câmara termostática do microscópio. Para aquisição do FLET-FLIM, ligue o laser, a câmera, a configuração do microscópio e o software de imagem.

Selecione os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados para os quatro florais doadores e defina o tempo de exposição no software de imagem. Antes de iniciar as aquisições do FLET-FLIM, verifique a formação do fuso bipolar nas células sob o microscópio usando uma fonte de luz externa. Quando o fuso aparecer, selecione pelo menos uma objetiva de 63 vezes e localize uma célula em metáfase.

Ajuste as coordenadas X, Y Z para colocar a célula no centro do campo de visão e selecione um único plano Z no qual o fuso mitótico seja mais visível ou intenso. Em seguida, inicie a gravação. A maioria das configurações comerciais disponíveis gerará uma micrografia de fluorescência e um mapa de vida útil pixel a pixel.

Salve as duas imagens. Para calcular os valores de tempo de vida Delta para o par de doadores aceitadores, selecione a região de interesse, correspondente a sub-regiões específicas antes de extrair os valores de tempo de vida, de todo o mapa de tempo de vida pixel a pixel. Em seguida, calcule o tempo de vida médio das células que expressam o vetor apenas do doador, para obter o tempo de vida médio do doador.

Para comparação de valores FLIM, subtraia cada valor de tempo de vida independente calculado do tempo de vida médio do doador para cada célula em cada uma das condições experimentais analisadas, para obter o valor de tempo de vida Delta para cada condição. Os valores de vida útil do Delta apenas para o doador, biossensor morto por quinase e construções tratadas com inibidor farmacológico, por exemplo, podem ser comparados. Depois de sincronizar as células em G2M e liberá-las na mitose, durante a vida útil de todas as construções transfectadas no fuso mitótico podem ser medidas.

Como esperado, nesta análise, os valores de tempo de vida de GFP-AURAKA e AURAKA-mTurquoise2 foram próximos de zero. Indicando que os valores medidos para esses construtos flutuaram em torno do valor médio. Por outro lado, os valores de vida útil Delta para GFP AURAKA-mCherry foram estatisticamente diferentes da condição apenas do doador.

Com o valor do tempo de vida Delta aumentando aproximadamente 130 picossegundos. Observações semelhantes foram feitas para shadowG-AURAKA-mTurquoise2 e para super YFP-AURAKA-mTurquoise2. Com os valores de vida útil do Delta aumentando aproximadamente 150 e 220 picossegundos da condição apenas do doador, respectivamente.

Nesta análise, os valores de Delta Lifetime nas células, expressando as construções do doador apenas em torno de zero, parecem ser pseudocoloridos em amarelo. Enquanto diferenças mais significativas são observadas como um sinal pseudo-colorido vermelho roxo em células que expressam qualquer biossensor. Este efeito também foi observado quando o biossensor GFP-AURAKA-mCherry foi tratado com um inibidor farmacológico.

Em construtos com biossensores mortos por quinase, os valores de vida útil do Delta foram significativamente maiores, em comparação com a condição apenas do doador. Mas também são significativamente mais baixos do que seus equivalentes normais. Certifique-se de que a variabilidade da condição apenas do doador flutue em torno de seu valor principal e que o valor seja significativamente diferente da vida útil das construções do biossensor.

Como os biossensores AURORA-quinase A funcionam bem com aceptores escuros, podemos considerar acoplá-lo a um segundo biossensor para acompanhar sua atividade enzimática em direção a um substrato.