Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9
10 de setembro de 2020
O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.
Este protocolo é significativo porque fornece instruções detalhadas sobre como preparar e injetar embriões de mosquito para edição do genoma CRISPR-Cas9. As principais vantagens dessa técnica de microinjeção são que ela tem uma alta taxa de sobrevivência do mosquito e permite que os pesquisadores determinem a função de um gene. Este protocolo foi especificamente adaptado para injetar mosquitos que pertencem ao gênero Culex.
Esses mosquitos transmitem vários patógenos, incluindo os vírus que causam a febre do Nilo Ocidental e a encefalite de St.Louis, bem como nematóides filariais, que causam dirofilariose canina e elefantíase. Portanto, ter ferramentas como a edição do genoma CRISPR-Cas9 nos permitirá entender e controlar melhor esses importantes fatores da doença. Injetar embriões de insetos recém-colocados e obter uma taxa mais alta de sobrevivência leva muito tempo, prática e paciência.
Portanto, recomendamos injetar vários embriões com uma solução salina colorida antes de injetar materiais caros para gerar uma mutação. Comece enchendo as agulhas de injeção com a mistura de injeção. Escolha um enchimento de agulha ou ponta de carregamento de gel que se encaixe facilmente na extremidade traseira da agulha de injeção selecionada.
Certifique-se de que haja um pouco de espaço entre a extremidade do enchimento da agulha e a agulha de injeção. Aspire cuidadosamente, uma única gota pequena da mistura de injeção na agulha de injeção perto do local onde começa a afinar. Em seguida, conecte a agulha de injeção ao microinjetor.
Coloque a lâmina contendo os embriões no palco do microscópio. Para abrir a agulha, use uma pressão de injeção inicial de aproximadamente 30 Psi e ajuste-a conforme necessário para fornecer um volume apropriado de mistura de injeção. Sob um microscópio de dissecação, posicione a agulha acima do embrião do mosquito e use cuidadosamente o micromanipulador para abaixar a agulha sobre o embrião.
Quando a agulha mal estiver tocando o embrião, mova rapidamente o embrião perpendicularmente ao eixo longo da agulha. Para determinar se a agulha foi aberta com sucesso, pressione o gatilho de injeção e veja se alguma bolha ou mistura de injeção escapa da agulha. Caso contrário, repita movendo o embrião do mosquito contra a agulha até que ela esteja aberta e a mistura de injeção escape quando o gatilho for pressionado.
Posicione o primeiro embrião de mosquito no centro da visão, certifique-se de que esteja em foco e coloque a agulha sobre o primeiro ovo. Aumente progressivamente a ampliação no microscópio, abaixando cuidadosamente a agulha para mantê-la logo acima do primeiro embrião. Prossiga até que o microscópio atinja sua maior ampliação e o embrião e a agulha estejam em foco.
Mova o embrião ligeiramente para a esquerda e abaixe a agulha para que fique no mesmo plano de visão que o embrião. Use o microscópio stage para tocar suavemente o embrião na ponta da agulha. A extremidade posterior estreita do embrião do mosquito deve desviar ligeiramente.
Usando o estágio de microscópio, mova a extremidade posterior do embrião para a agulha e observe a agulha penetrando no córion do ovo do mosquito. A agulha deve apenas penetrar na membrana e na localização aproximada das células polares dentro do embrião. Colocar a mistura de injeção nesta região aumenta a probabilidade de que ocorram mutações e sejam herdadas na linha germinativa.
Puxe o gatilho de injeção uma a três vezes para injetar a mistura de injeção no embrião. Forneça uma pequena quantidade de mistura de injeção, apenas o suficiente para que uma pequena clareira no plasma do embrião possa ser detectada. Use o palco para mover o embrião para a direita, para longe e para fora da ponta da agulha.
Se a injeção correu bem, pouco ou nenhum fluido deve vazar do embrião. Mova o estágio para baixo para que o próximo embrião seja posicionado na frente da agulha. E repita a injeção.
Se a mistura de injeção não parecer estar saindo, ou se uma grande quantidade de fluido escapar do embrião após a remoção da agulha, substitua a agulha de injeção e comece novamente. Destrua todos os ovos não injetados ou danificados. Depois que todos os embriões na lâmina tiverem sido injetados, lave o óleo de halocarbono aplicando água de osmose reversa com um frasco de esguicho.
Direcione o jato de água para o topo da lamínula de vidro acima dos embriões injetados e permita que a água escorra pela lamínula, certificando-se de não direcionar o jato para os embriões. Cubra a lâmina com 150 microlitros de água e coloque-a sobre papel de filtro úmido dentro de uma placa de Petri quadrada. Incube a placa de Petri em uma câmara ambiental, ajustada para 25 a 27 graus Celsius e 70 a 80% de umidade relativa com um fotoperíodo de dia longo.
Este protocolo foi usado para injetar com sucesso embriões do mosquito doméstico do norte, Culex pipiens, garantindo que a extremidade anterior do embrião do mosquito se estenda além da tira de curativo médico, aumentando muito a sobrevivência larval e resultando em descendentes de alta qualidade que são capazes de se desenvolver até a idade adulta e se reproduzir. O sequenciamento revelou que aproximadamente 10% dos mosquitos rastreados mostraram uma pequena inserção ou deleção perto do local de corte Cas9 do primeiro RNA guia, sugerindo que as células polares foram direcionadas com sucesso durante as microinjeções. Os indivíduos F1 acasalaram com sucesso e produziram descendentes viáveis, alguns dos quais também continham a mutação.
Ao microinjetar embriões de insetos, a maioria das pessoas luta para abrir inicialmente a agulha e mover o embrião para a agulha. Lembre-se de que desenvolver essas habilidades leva tempo e prática. Este protocolo pode ser modificado ou adaptado para injetar os embriões de outros mosquitos ou mesmo de outras espécies de insetos.
Além de usar este protocolo para nocautear genes com edição de genoma CRISPR-Cas9 direcionada, as mesmas técnicas podem ser usadas para injetar plasmídeos ou transposons para genes knock-in ou gerar mutações aleatórias. Meu laboratório está atualmente usando essa técnica para entender melhor como os mosquitos medem diariamente e regulam suas respostas sazonais. No entanto, como nós, pesquisadores, estamos usando a edição do genoma CRISPR-Cas9 para entender melhor a biologia de vários organismos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para utilizar a edição do genoma CRISPR/Cas9 a fim de criar linhagens nulas de Culex pipiens, uma espécie de mosquito que transmite diversos patógenos. Detalha a preparação e injeção de embriões de mosquito, garantindo altas taxas de sobrevivência e facilitando a análise da função gênica.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Edição do genoma com CRISPR/Cas9
- Controle de vetores e prevenção de doenças
- Embriologia de insetos
Antecedentes
- Culex pipiens é um vetor importante para várias doenças.
- A identificação da função gênica é crucial para compreender a transmissão de patógenos.
- Técnicas de microinjeção aumentam a eficiência das modificações genéticas.
Métodos Utilizados
- Microinjeção de embriões de mosquito
- Culex pipiens como modelo biológico
- Sistema CRISPR/Cas9 para edição gênica direcionada
Resultados Principais
- A injeção bem-sucedida resultou em aproximadamente 10% dos mosquitos analisados exibindo mutações direcionadas.
- Foram obtidas altas taxas de sobrevivência larval, produzindo descendentes viáveis.
- As mutações foram herdadas pela linhagem germinativa em indivíduos F1.
Conclusões
- Este estudo demonstra a viabilidade do uso do CRISPR/Cas9 para estudos de função gênica em Culex pipiens.
- O protocolo tem implicações significativas para estratégias de controle de vetores no manejo de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A edição gênica mediada por CRISPR/Cas9 em mosquitos vetores de doenças permite a validação de alvos e a genômica funcional para estudos de transmissão de patógenos. Este protocolo contribui para a desmistificação mecanicista ao estabelecer a transmissão germinativa de mutações em Culex pipiens, um vetor-chave para o vírus do Nilo Ocidental e nematódeos filarioides. A abordagem fornece uma plataforma escalonável para triagem fenotípica e identificação de candidatos promissores em pesquisas de controle de vetores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação da função gênica em vetores de mosquitos para validar alvos envolvidos na transmissão de patógenos.
- Valor Operacional: Alcança cerca de 10% de taxa de mutação em embriões analisados, apoiando fluxos de trabalho eficientes de validação de alvos.
- Valor Preditivo: A transmissão germinativa de mutações na prole F1 confirma a atividade no alvo e a herdabilidade para avaliação fenotípica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: A microinjeção de complexos Cas9/gRNA em embriões gera mutações direcionadas a sítios específicos para triagem funcional.
- Valor Operacional: Altas taxas de sobrevivência de embriões após a injeção permitem a realização de triagens em larga escala dos grupos injetados.
- Prontidão do Ensaio: O protocolo inclui a preparação de agulhas, o alinhamento dos embriões e os parâmetros de injeção para garantir a reprodutibilidade entre os experimentos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: As linhagens mutantes geradas permitem o estudo do papel dos genes na competência vetorial para patógenos como o vírus do Nilo Ocidental e nematódeos filarioides.
- Redução Mecanística de Riscos: As mutações herdadas pela linhagem germinativa permitem a análise fenotípica longitudinal ao longo das gerações.
- Sistema Relevante para Doenças: O modelo Culex pipiens permite a avaliação de alvos genéticos relevantes para estratégias de controle de vetores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir a validação de alvos, triagem fenotípica e acompanhamento mecanicista em vetores insetos de doenças.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da inativação gênica para esclarecer papéis nas vias de transmissão de patógenos.
- Triagem: Gera leituras quantitativas de mutações (por exemplo, frequência de inserções e deleções) para comparar a eficácia do gRNA e a eficiência de edição.
- Análises: O sequenciamento de indivíduos F0 e F1 fornece resultados mensuráveis para avaliar a precisão da edição e a transmissão pela linhagem germinativa.
- Pesquisa Translacional: Linhagens mutantes facilitam a avaliação pré-clínica da função gênica na competência vetorial e na interação com patógenos.
- Reutilização Empresarial: O fluxo de trabalho padronizado de microinjeção pode ser adaptado a diferentes espécies de mosquitos e modelos de insetos para reutilização da plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio de mutações transmissíveis pela linhagem germinativa e triagem fenotípica.
- Valor Operacional: Altas taxas de sobrevivência e parâmetros de injeção reprodutíveis aumentam a produtividade e reduzem o desperdício de recursos.
- Valor Estratégico: Permite decisões de avançar ou interromper a priorização de alvos, vinculando função gênica à competência vetorial.
- Impacto no Portfólio: Avanço ajustado ao risco de candidatos ao controle de vetores com base em descobertas mecanicistas validadas.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em embriologia de mosquitos, técnicas de microinjeção e preparação de reagentes CRISPR/Cas9.
- Depende de aparelho de microinjeção, configuração de microscopia e controles ambientais para incubação de embriões.
- Necessita padronização entre equipes no manuseio de embriões, pressão de injeção e preparação de agulhas para garantir consistência.
- A adaptação a outras espécies de mosquitos pode exigir otimização do momento de coleta de embriões e dos parâmetros de injeção.
- Limitações práticas incluem a dependência de habilidade técnica para abertura de agulhas e alinhamento de embriões, o que afeta as taxas de sucesso da injeção.
