Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

Este artigo descreve o protocolo de fabricação de chips microfluidos desenvolvidos para cristalização de proteínas on-chip com o método de diálise e experimentos de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. Uma das principais vantagens desses microchips é a escolha de materiais de fabricação, tornando os chips compatíveis para a coleta de dados de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. Os experimentos de cristalização on-chip requerem pequenos volumes da amostra de proteína, reduzindo o custo global de trabalhar com essas macromoléculas de alto valor.

A cristalização on-chip também elimina a colheita manual dos frágeis cristais proteicos, frequentemente aplicados em combinação com o resfriamento crio durante experimentos convencionais de cristalografia. Além disso, nossos microchips utilizam microdiálise para cristalização de proteínas, que é um método baseado em difusão com o objetivo de equilibrar a concentração precipitante através de uma membrana semi-permeável, a fim de abordar a concentração cromulenta para cristalização proteica, e permite o controle preciso e reversível sobre as condições de cristalização. A microdiálise combinada com o controle de temperatura pode ser usada para desacoplar a nucleação do crescimento cristalino para investigar diagramas de fase, alterando a concentração precipitante enquanto usa a mesma amostra de proteína.

Primeiro prepare 50 gramas de base de silicone PDMS e é agente de cura em uma proporção de massa de 10 para um. Misture os dois ingredientes em um béquer com uma espátula. Após a mistura, coloque a mistura em uma câmara de vácuo para remover todas as bolhas de ar.

Coloque 25 gramas do PDMS pré-xizado no primeiro SU8 para dominar contendo os padrões do canal microfluido e dos pilares, até uma altura de aproximadamente cinco milímetros. Em seguida, despeje os 25 gramas restantes do PDMS no segundo mestre SU8, contendo apenas os padrões dos pilares. Cure as duas camadas de PDMS em um forno a 338 kelvin por uma hora.

Corte as camadas pdms curadas ao redor dos padrões dos mestres SU8 com um bisturi, e retire suavemente os moldes PDMS dos mestres do silicone. Coloque o molde PDMS, apresentando tanto os canais quanto os pilares em um rígido deslizamento de vidro microscópio com os padrões voltados para cima. Corte um pequeno pedaço de membrana de diálise de celulose regenerada para cobrir o pilar central do molde PDMS, que foi projetado para ser a câmara proteica.

O corte de peso molecular da membrana de diálise é escolhido em conformidade com o peso molecular da amostra de proteína, e os precipitantes da solução de cristalização. Em seguida, separe cuidadosamente o pedaço seco da membrana de diálise de celulose regenerada. Corte um pequeno pedaço da membrana de diálise separada.

O tamanho desta peça de membrana depende do design do chip. E especificamente, depende das dimensões do pilar central. Deposite a peça da membrana de diálise no pilar central do molde PDMS, que é suportado na lâmina de vidro, com seu pilar e canais voltados para cima.

Em seguida, coloque o segundo molde PDMS com apenas os pilares voltados para baixo, em cima do molde PDMS que já está suportado no escorregador de vidro. Alinhe todos os pilares dos dois moldes PDMS. O pedaço da membrana de diálise de celulose regenerada é sanduíche entre os dois pilares centrais dos moldes PDMS.

Esta etapa do procedimento de fabricação pode ser conduzida sob um microscópio óptico ou simplesmente inspecionando visualmente cuidadosamente o alinhamento de todos os pilares. Coloque o conjunto em uma câmara de vácuo e desseca por 30 minutos, a fim de remover as bolhas de ar presas dentro dos moldes PDMS, e para melhorar a inserção da resina NOA fotocurável, que será descrita na próxima etapa deste protocolo. Remova o conjunto da câmara de vácuo e preencha o espaço vazio entre os dois moldes PDMS com a resina fotocurável à base de tialina, NOA 81, por imbibição capilar.

Aplique a resina em três dos quatro lados da montagem. Coloque o conjunto em um cruzador e cure a resina NOA expondo à luz UV por oito segundos, usando uma lâmpada UV colidida de 35 miliwatts por centímetro quadrado. Corte uma peça pmma de 175 micrômetros de espessura nas dimensões padrão de um deslizamento de vidro microscópio e retire a proteção plástica de cada lado da peça PMMA.

Uma vez que a primeira exposição UV seja concluída, remova o molde PDMS superior com uma resina NOA parcialmente ligada cruzada presa sobre ele a partir do molde PDMS inferior e do slide de vidro. Pressione suavemente a montagem do molde PDMS superior e a resina NOA parcialmente curada na peça PMMA. Coloque o novo conjunto no cross-linker e cure novamente a resina NOA por exposição à luz UV por 60 segundos.

Remova cuidadosamente o molde PDMS superior. O chip de diálise feito da resina NOA totalmente cruzada incorporando uma membrana de diálise de celulose regenerada e sendo suportado em uma peça pmma está pronto. Conectores comercialmente disponíveis nos pontos de entrada e saída do canal microfluido com cola epóxi rápida.

Para o manuseio do fluido, escolha o diâmetro dos tubos PTFE com base no tamanho dos conectores. Os tubos são utilizados para a introdução da solução de cristalização dentro do canal fluido do chip de diálise. Pipeta manualmente uma gota da amostra de proteína dentro do reservatório de proteínas localizado bem na membrana de diálise.

O volume da gotícula de proteína depende do desenho do microchip que está sendo usado. E especificamente, depende do volume do pilar central, e pode ser 0,1 ou 0,3 microliters. Aplique cuidadosamente uma fina camada de graxa de silicone de alto vácuo ao redor do reservatório de proteínas.

Corte um pequeno pedaço de PMMA e coloque-o suavemente acima da fina camada da graxa de silicone. Corte um pedaço de fita Kapton, grande o suficiente para cobrir a peça pmma colocada acima do reservatório de proteínas e para ficar no chip NOA em todas as bordas. A amostra de proteína é encapsulada dentro do reservatório e o chip pode ser usado para experimentos de cristalização.

Primeiro prepare aproximadamente 500 microliters da solução de cristalização misturando volumes apropriados do buffer e das soluções precipitantes. Injete a solução de cristalização no ponto do chip de diálise através dos conectores fluidos, manualmente com a seringa ou com um sistema automatizado acionado por pressão. Uma vez que o canal fluido é preenchido com a solução de cristalização e nenhum ar é preso dentro, sele as portas de entrada e saída do chip com fita Parafilm.

Pipeta o volume adequado da solução proteica dentro do reservatório de proteínas e encapsula a amostra de proteína como já foi descrito. O crescimento do cristal proteico pode ser visualizado e gravado com uma câmera digital. Para a fabricação dos microchips de diálise, escolhemos materiais opticamente transparentes e biologicamente inertes, demonstrando alta compatibilidade para experimentos de difração de raios-X in situ.

O ruído de fundo gerado pelos materiais que compõem o compartimento proteico do chip, que está no caminho direto do feixe de raios-X, foi avaliado. O compartimento proteico consiste na membrana de diálise de celulose regenerada, na fita Kapton e em duas camadas de PMMA, uma usada como substrato dos microchips, e outra usada para o encapsulamento da amostra de proteína. Nesta imagem, é ilustrado o ruído de fundo gerado pela fita Kapton, a membrana de diálise de celulose regenerada, a camada PMMA e sua montagem.

Embora a resina fotocurável NOA coma o corpo principal dos microchips, não está incluída nestas medidas, pois não faz parte da câmara proteica. Anéis difusos atribuídos às interações dos raios-X com os materiais podem ser vistos para a fita Kapton na resolução inferior a quatro angstroms, o PMMA entre quatro a oito angstroms, e a membrana de diálise entre quatro a cinco angstroms. O ruído de fundo total gerado pelo chip é observado principalmente na resolução inferior a seis angstrom, indicando que o tratamento de dados de difração de alta resolução não é afetado.

Os microchips foram montados em frente ao feixe de raios-X com um suporte impresso em 3D que projetamos para experimentos de difração de raios-X in situ, e pode conter até três chips simultaneamente. Foram realizados experimentos para avaliar a eficiência dos microchips para cristalização on-chip de proteínas solúveis por modelos com o método de microdiálise. Os cristais de lysozyme foram cultivados em 293 kelvin em duas condições diferentes.

A primeira condição de cristalização continha 1,5 cloreto de sódio molar e acetato de sódio molar de 0,1. A segunda condição de cristalização continha um cloreto de sódio molar, acetato de sódio molar 0,1 e 30% glicol de polietileno 400, e foi escolhida para mostrar a compatibilidade dos microchips e do método de microdiálise, com precipitantes de alto peso molecular e soluções viscosas. Os experimentos de cristalização foram realizados em condições estáticas.

Uma vez que os cristais de lysozyme foram cultivados no microchip, eles foram usados para experimentos de difração de raios-X in situ a temperatura ambiente. Os microchips foram montados na linha do feixe com o auxílio do suporte impresso em 3D e conjuntos completos de dados de difração de raios-X foram coletados de dois cristais de lise. Após o tratamento dos dados de difração de raios-X, o mapa de densidade eletrônica de um único cristal de lysozyme foi obtido a 1,95 resolução de angstrom, como mostrado na figura A.Figura B mostra o mapa de densidade eletrônica obtido em resolução de 1,85 angstroms.

Após a fusão de dois conjuntos de dados obtidos de dois cristais diferentes de lisezímica, ambos os mapas de densidade eletro mostram informações estruturais detalhadas que podem ser obtidas por experimentos de difração de raios-X in situ realizados diretamente nos microchips de diálise à temperatura ambiente, a partir de cristais proteicos únicos ou múltiplos. Demonstramos o procedimento de fabricação de dispositivos microfluidos projetados para cristalização de proteínas on-chip com o método de microdiálise, e experimentos de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. Utilizamos materiais de fabricação com alta transparência de raios-X, compatíveis para cristalografia de proteína in situ.

A coleta de dados de difração é automatizada com o uso de um suporte impresso em 3D para os chips, que podem ser montados diretamente em linhas de feixe de cristalografia macromolecular. A versatilidade deste microchip decorre do uso da microdiálise para controlar reversivelmente as condições de cristalização e mapear diagramas de fase usando pequenos volumes proteicos. A prototipagem do dispositivo é simples, permitindo a fabricação de até 30 microchips em um único dia em uma sala limpa, com materiais relativamente baratos.

Esperamos que essas características dos chips possam ser usadas para estudos de cristalografia de raios-X em série de alvos proteicos mais desafiadores.