Name: Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprenda a cristalização de proteínas em chips microfluídicos por microdiálise para difração de raios-X in situ. Este método permite controle preciso das condições de cristalização com pequenos volumes amostrais.

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A MBS reconhece o suporte do MI/CNRS sob o contrato Instrumentação nos limites 2014-2015. NJ reconhece o Programa Internacional de Pesquisa de Doutorado (Irtelis) do CEA para a Bolsa de Doutorado. A MBS e a SJ reconhecem o financiamento do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do acordo de subvenção de Marie Skłodowska-Curie número 722687. MBS, SJ e NJ agradecem à LIPhy (UGA) pelo estabelecimento de salas limpas para experimentos de microfabização. O IBS reconhece a integração ao Instituto de Pesquisa Interdisciplinar de Grenoble (IRIG, CEA).

Os autores não têm nada a revelar.

Um dispositivo microfluido foi desenvolvido para cristalização de proteínas on-chip com o método de microdiálise e experimentos de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. Os chips NOA 81 que integram as membranas de diálise RC de qualquer MWCO, a fim de usar microdiálise para cristalização de proteínas on-chip podem ser fabricados. Foram utilizados materiais de fabricação com uma transparência relativamente alta de raios-X, tornando os chips compatíveis para a cristalografia de proteína in situ. Os materiais de fabricação que compõem o compartimento para cristalização proteica do dispositivo (PMMA, Kapton, membrana diálise RC) foram avaliados para gerar baixo ruído de fundo. Especificamente, o ruído de fundo gerado pelo chip de diálise é observado principalmente em baixa resolução (> 6 Å) e não afeta o tratamento de dados de difração de alta resolução dos cristais de grande liseina necessários para a determinação da estrutura proteica. A automação da coleta de dados é amplificada usando um suporte impresso em 3D que pode ser montado diretamente em linhas de cristalografia macromolecular e transportar até três microchips simultaneamente. Dessa forma, evita-se a colheita manual e a manipulação dos frágeis cristais proteicos. Além disso, a coleta de dados ocorre à temperatura ambiente, evitando a necessidade de crioproteção que possa estar relacionada a alterações conformais da estrutura proteica nativa2,3.
O uso da microdiálise como método para cultivar cristais no chip permite monitorar e controlar com precisão o processo de cristalização. Como discutido na introdução, a maioria dos métodos convencionais de cristalização de proteínas foram implementados utilizando dispositivos microfluidos11,14. No entanto, as vantagens da diálise para a cristalização proteica ainda não haviam sido totalmente exploradas na microescala. A microdiálise on-chip oferece a possibilidade de estudar diagramas de fase e realizar a triagem e otimização de condições de cristalização com a mesma amostra de proteína19. Para os protótipos apresentados neste trabalho, o consumo de proteína por chip é limitado a 0,1 ou 0,3 μL. Com base no trabalho experimental até agora, as etapas mais críticas do protocolo não derivam do procedimento de fabricação dos chips, mas do processo de cristalização. O protocolo de fabricação inclui muitas etapas, mas é simples e permite a fabricação de inúmeros dispositivos (20 a 30 chips) em um único dia na sala limpa, com materiais relativamente baratos. No entanto, a cristalização on-chip de proteínas pode ser um procedimento delicado devido à natureza estocástica intrínseca da nucleação e do crescimento cristalino, especialmente na microescala. Foi descrito um estudo de caso, onde foram utilizadas condições bem estabelecidas para a cristalização da lise que produziu cristais robustos e bem definidos adequados para a coleta de dados de difração de raios-X in situ. No entanto, as dificuldades podem surgir com o uso de alvos proteicos mais desafiadores, como as proteínas de membrana, onde o meio de cristalização é muito mais complicado, os diagramas de fase não são conhecidos e as condições de cristalização bem trabalhadas ainda não estão bem estabelecidas. O chip de diálise oferece a possibilidade de superar essas dificuldades e estudar diagramas de fase on-chip, sem descartar a valiosa e frequentemente cara amostra de proteína, apenas trocando a solução de cristalização dentro do canal microfluido.
A versatilidade dos dispositivos microfluidos decorre da exploração da microdiálise para cristalização de proteínas on-chip, a fim de controlar reversivelmente as condições de cristalização e a concentração do mapa e os diagramas de fase variadas usando baixo volume de proteína. Além disso, o dispositivo é compatível com experimentos de difração de raios-X in situ e a prototipagem dos dispositivos é barata e rápida. Numerosos cristais isomorfos de proteínas solúveis e membranas (em preparação) podem ser cultivados on-chip e espera-se que todas essas características possam ser utilizadas para estudos de cristalografia de raios-X em série de alvos proteicos desafiadores em instalações síncrotrons e XFEL. Finalmente, realizar estudos on-chip e in situ tempo-resolvidos é uma possibilidade futura que poderia ser de interesse significativo para a comunidade cristalográfica. Portanto, ao cultivar cristais no chip de diálise e introduzir os reagentes no canal microfluido, manualmente (usando uma seringa) ou automaticamente (com um sistema de fluido de controle de pressão ou uma bomba de seringa), os esforços futuros se concentrarão em provar que os chips microfluidos podem ser usados com sucesso para desencadear experimentos resolvidos com o tempo em linhas de raios síncrotrons.

Elucidar a estrutura tridimensional (3D) das macromoléculas biológicas é uma busca incessante na biologia estrutural onde a cristalografia de raios-X continua sendo a principal técnica de investigação. Aplicado para desvendar os detalhes estruturais de macromoléculas complexas, como proteínas, tem como objetivo facilitar a compreensão de seus mecanismos de atuação e seu envolvimento em diversas funções biológicas. Poderosas fontes de raios-X em síncrotrons e lasers de elétrons livres de raios-X (XFELs) fornecem todas as ferramentas necessárias para uma visão mais profunda da estrutura das proteínas em resolução quase atômica. Apesar das vantagens que vêm junto com o uso de raios-X para estudos estruturais, há limitações intrínsecas à radiação de raios-X e ao processo de cristalização em si. Os danos causados pelo alto fluxo de raios-X e longos tempos de exposição do cristal de proteína na frente do feixe de raios-X são parâmetros restritivos que os cristalógrafos têm que superar usando resfriamento criogênico1. No entanto, encontrar as condições ideais de criocoolização pode ser trabalhoso, uma vez que mudanças conformais da estrutura proteica nativa ou artefatos podem ser ocultadas2,3. Além disso, estudos recentes indicam que a realização de experimentos de difração à temperatura ambiente leva a menores danos específicos à radiação4. Outro gargalo na biologia estrutural é a aquisição de cristais bem difundidos com tamanho suficiente5. Cristais pequenos são mais fáceis de produzir, especialmente no caso de proteínas de membrana, mas são mais suscetíveis a danos de radiação mesmo sob condições criocooling porque uma alta dose de radiação deve ser direcionada em um volume menor em comparação com o caso de cristais de proteína maiores6. A nova abordagem da cristalografia serial7,8 em síncrotrons e XFELs pode contornar as restrições de danos à radiação e, ao mesmo tempo, explorar cristais menores (200 nm a 2 μm)7 mesclando conjuntos de dados de múltiplos, isomorfos e cristais proteicos orientados aleatoriamente e lucrando com os avanços tecnológicos associados, como pulsos de femtosegundo, tempos de exposição mais curtos e feixes de raios-X microfoques5,7,9,10.
A tecnologia microfluidica é valiosa para a cristalografia de raios-X, exibindo múltiplas vantagens para a cristalização das macromoléculas biológicas e sua investigação estrutural. A realização de experimentos de cristalização em dispositivos microfluidos requer pequenos volumes de amostra de proteína, restringindo assim o custo de produção dessas macromoléculas biomoleculas de alto valor e facilitando a triagem e otimização de alto rendimento de inúmeras condições de cristalização. Além disso, a proporção inerente de área-volume de superfície grande na escala microfluitária e fenômenos de transporte limitados à difusão permitem um controle fino sobre fluxos e gradientes de temperatura ou concentração11,12,13,14, tornando dispositivos microfluidos adequados para o cultivo uniforme de cristais e explorando diagramas de fase15,16,17,18,19. Além disso, as ferramentas microfluidas apresentam um potencial distinto para enfrentar outro obstáculo na cristalografia proteica, que é a entrega da amostra, e a necessidade de manusear e colher cristais proteicos antes de seu uso para experimentos de difração de raios-X. O método de cristalografia de raios-X on-chip e in situ elimina a manipulação de cristal e a potencial deterioração da qualidade do cristal antes da coleta de dados. Uma ampla gama de chips microfluídicos compatíveis para a cristalografia de proteína de raios-X in situ foram projetados, desenvolvidos e testados por muitos grupos de pesquisa que confrontam as restrições relacionadas decorrentes da natureza dos materiais de microfabricação e suas interações com raios-X14,19,20,21,22,23. Os materiais de fabricação devem ser opticamente transparentes, biologicamente inertes e demonstrar alta transparência à radiação de raios-X e uma ótima relação sinal-ruído durante a coleta de dados.
A maioria dos métodos de cristalização aplicada na cristalografia de proteínas convencionais24,25 também foram implementados na escala microfluidica11,14 para a cristalização de chips e na análise de difração de raios-X in situ. Aparelho microfluido simples, híbrido ou multicamadas incorporando difusão de vapor26, evaporação27,difusão de interface livre (FID)28,microbatch26, ou mesmo semeadura29 foram usados para cristalizar proteínas solúveis e membranas. A triagem de alto rendimento e a otimização das condições de cristalização podem ser alcançadas30,31 em32bem-base,33baseados em gotículas ou34 dispositivos acionados por válvulas. In situ Experimentos de difração de raios-X de alvos proteicos desafiadores à temperatura ambiente foram realizados em microchips fabricados a partir de diversos materiais como PDMS (polidimtilsiloxano), COC (copolímero olefina cíclico), PMMA (poli (metil metil))21,2 2,26,28,29, filmes de grafeno23, Kapton35, cola epóxi6, ou NOA (Adesivo Óptico Norland)19 e a transparência dos materiais para a radiação de raios-X e sua contribuição para o ruído de fundo foram avaliadas. Além disso, os microchips foram projetados para acoplar as estratégias de coleta de dados em série em uma única ferramenta para experimentos de cristalografia de proteínas de raios-X nas fontes síncrotrons23,35,36 e XFELs7.
A coleta de dados in situ em temperatura ambiente também foi implementada em vários métodos de entrega e dispositivos. Por exemplo, Nogly et al.54 usaram um injetor de fase cúbica lipídica (LCP) para estudar a estrutura da bomba de fótons acionada pela luz bacteriorhodopsin (bR) por cristalografia femtosegundo serial (SFX) usando uma fonte XFEL. A estrutura cristalina de bR foi resolvida à resolução de 2,3 Å, demonstrando a compatibilidade de um injetor LCP com cristalografia de femtosegundo serial resolvida pelo tempo (TR-SFX). Baxter et al.55 projetaram uma rede multi-cristal de alta densidade, fabricada por um plástico de policarbonato de 100 ou 200 μm de espessura com orifícios cortados a laser de vários tamanhos. Uma outra filme de policarbonato de 5 μm de espessura pode ser fixada em um lado da grade ao usar o dispositivo para experimentos de cristalização sentado ou suspenso. Esta rede de alta densidade pode ser usada de várias maneiras, pois os cristais podem ser carregados diretamente nas portas do dispositivo ou cristais podem ser cultivados no dispositivo por difusão de vapor ou pelo método LCP. Além disso, a rede pode ser ajustada em uma base magnética padrão e usada para a coleta de dados de raios-X in situ em condições criogênicas ou de temperatura ambiente. Mais recentemente, Feiler et al.56 desenvolveram um suporte de amostra para cristalografia de raios-X in situ in situ a temperatura criogênica e ambiente com mínima contribuição de ruído de fundo. Especificamente, o suporte é composto por um suporte plástico, uma folha de COC transparente e uma folha de poliimida estruturada microporosa. Foi projetado para substituir os slides de cobertura comumente usados para configurar gotas de cristalização, permitindo manipulação no local, como imersão de ligante, formação complexa e proteção criogênica sem abrir a gota de cristalização ou manusear manualmente os cristais. Além disso, o suporte da amostra pode ser removido da placa de cristalização e colocado em uma base magnética para coleta de dados in situ em linhas de feixe padrão à base de goniômetro. Para a coleta de dados de temperatura ambiente, a folha COC é removida antes do experimento e apenas a folha de poliípulo de 21 μm de espessura contribui para a dispersão de fundo, que neste caso é mínima. Esses exemplos compõem apenas uma pequena fração da pesquisa em curso e a multiplicidade de microchips versáteis desenvolvidos para cristalografia proteica de raios-X.
No entanto, o método de cristalização da proteína da diálise não foi amplamente incorporado dentro dos microfluidos. A diálise é um método baseado em difusão que visa o equilíbrio da concentração precipitante através de uma membrana semipermese, a fim de abordar a concentração nominal para cristalização proteica e permite o controle preciso e reversível sobre as condições de cristalização24. O Corte de Peso Molecular (MWCO) da membrana de diálise semi-permeável pode ser escolhido dependendo do peso molecular da macromolécula e dos precipitantes para permitir a difusão de pequenas moléculas precipitantes, mantendo a macromolécula de interesse. Devido à reversibilidade do processo de diálise, ele pode ser usado em combinação com o controle de temperatura para desacoplar e otimizar a nucleação e o crescimento de cristal independentemente37 para investigar diagramas de fase alterando a concentração precipitante enquanto usa a mesma amostra de proteína. A integração das membranas em microfluidos é revisada por de Jong et al.38 e os estudos de caso em biologia implantando diálise em microchips podem ser listados principalmente em aplicações de preparação, concentração ou filtragem da amostra39,40,41,42 ou estudos relacionados com células43,44. A pervaporação por PDMS foi utilizada por Shim et al.37 para estudar a nucleação e o crescimento da xilanase em várias condições. A água permeou a membrana PDMS de 15 μm de espessura no reservatório de proteínas do dispositivo microfluido, alterando posteriormente a proteína e a concentração precipitante.
O protocolo desenvolvido por Junius et al.19,45 para a fabricação de um chip microfluido compatível tanto para cristalização de proteínas on-chip via microdiálise quanto em experimentos de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente é apresentado. O protocolo para a fabricação do dispositivo é diretamente inspirado no pioneirismo realizado por Studer e colegas de trabalho12,46 para adesivos micro-padronizados de resina foto-curável à base de tianolene NOA 81 incorporando membranas comercialmente disponíveis, usando litografia de impressão suave. Uma modificação inovadora do método resultou em microchips que permitem o uso de microdiálise para monitorar e controlar com precisão os parâmetros experimentais para o crescimento on-chip de cristais proteicos e explorar simultaneamente as vantagens dos microfluidos, como a redução do consumo de amostras de proteína por experimento (<1 μL). Em um trabalho anterior, foram demonstrados os princípios da diálise aplicados a um sistema de macroes escala (volume típico >20 μL) paratriagem e otimização das condições de cristalização por meio do mapeamento de diagramas de fase de concentração de temperatura-precipitante. Neste trabalho, é descrito um protocolo para a produção de microchips de diálise incorporando membranas de dirálise regenerada (RC) de diferentes MWCO, a fim de realizar ensaios de cristalização no chip e na coleta de dados de difração de raios-X. Os materiais que compõem os microchips foram avaliados por sua transparência aos raios-X19 e os dispositivos podem ser colocados diretamente em frente ao feixe de raios-X para experimentos de difração de temperatura ambiente in situ, excluindo o manuseio manual e minimizando a degradação de cristais proteicos frágeis. Em um estudo de caso, os cristais de lisezina branca de galinha foram cultivados no chip por meio de microdiálise gerando uma população de tamanho uniforme. O microchip foi então montado em frente ao feixe de raios-X com um suporte impresso em 3D19 e conjuntos de dados de difração in situ foram coletados à temperatura ambiente a partir de múltiplos cristais isomorfos, demonstrando o alto potencial e relevância dos chips para estudos de cristalografia serial síncrotron de alvos macromoleculares desafiadores.

<table><tbody><tr><td>3 em wafer</td><td>Silicon Materials Inc.</td><td></td><td>Centrífuga de wafer de silício</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Minispin</td><td>Centrífuga de bancada</td></tr><tr><td>CleWin 3.0</td><td>Software</td><td></td> WieWeb <td>Software de design</td></tr><tr><td>Cola epóxi</td><td>Devcon</td><td></td><td>5 minutos cola epóxi</td></tr><tr><td>Conectores fluídicos</td><td>Cluzeau Info Lab</td><td>N-333</td><td>Kit NanoPort para tubulação de 1/16" OD</td></tr><tr><td>Lisozima de clara de ovo de galinha</td><td>Roche</td><td>10 837 059 001</td><td>Proteína liofilizada em pó</td></tr><tr><td>Graxa de silicone de alto vácuo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>Dow Corning&nbsp; graxa de silicone para alto vácuo</td></tr><tr><td>HMDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td>Silano, química</td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Sawatec</td><td>HP-200-Z-HMDS BM</td><td>Placa quente</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Fita Kapton</td><td>DuPont</td><td></td><td>Fita de poliimida</td></tr><tr><td>Alinhador de máscara</td><td>SUSS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Alinhador de máscara, fonte UV</td></tr><tr><td>Filtro de membrana</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>0,22 &mu; Filtro de tamanho de poro</td></tr><tr><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>12164682</td><td>lâminas de vidro 3 x 1 in</td></tr><tr><td>NOA81</td><td>Norland Products Inc.&nbsp;</td><td>NOA81</td> Forno <td>de resina fotocurável</td></tr><tr><td></td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forno Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6543</td><td>Parafilm M tamanho do rolo 20&nbsp; em. &vezes; 50&nbsp; ft</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silicone</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-603</td><td>Placa de</td></tr><tr><td>Petri</td> Química <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Desenvolvedor</td></tr><tr><td>Equipamento de plasma</td><td>Diener Eletrônico</td><td>ZEPTO</td><td>Tratamento de plasma</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>Goodfellow</td><td>137-745-63</td><td>folhas de PMMA 150x150 mm, 0,175 mm de espessura</td></tr><tr><td>Sistema acionado por pressão</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td>Controlador de pressão/vácuo</td></tr><tr><td>Tubulação de PTFE</td><td>Elveflow/Darwin microfluídica LVF-KTU-15</td><td></td><td>Rolo de tubulação de PTFE 1/16" OD X 1/32" ID</td></tr><tr><td>RC membrana de diálise</td><td>Spectra/Por</td><td></td><td>Vários MWCOs</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Swann-Morton</td><td></td><td>Lâminas cirúrgicas de aço carbono</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>Dassault Systemes</td><td></td><td>Software de design 3D-CAD</td></tr><tr><td>Revestidor de rotação</td><td>SPS</td><td>Spin150</td><td>Wafer spinner</td></tr><tr><td>SU-8 série 3000</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Seringa fotorresistente SU-8 3050</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 mL Seringa Luer-Lok</td></tr><tr><td>reticulador UV</td><td>Uvitec</td><td>CL-508</td><td></td></tr></tbody></table>

cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-x in situ

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Este protocolo descreve a fabricação de dispositivos microfluidos reprodutíveis e baratos que cobrem todo o gasoduto para cristalizar proteínas on-chip com o método de diálise e permitir experimentos de cristalização monoclímdica ou serial in situ a temperatura ambiente. O protocolo detalha o processo de fabricação dos microchips, a manipulação dos experimentos de cristalização on-chip e o tratamento dos dados de difração de raios-X coletados in situ para a elucidação estrutural da amostra de proteína. A principal característica deste procedimento de microfabização está na integração de uma membrana de diálise regenerada e regenerada comercialmente disponível entre duas camadas do chip. O corte de peso molecular da membrana incorporada varia dependendo do peso molecular da macromolécula e dos precipitantes. O dispositivo explora as vantagens da tecnologia microfluida, como o uso de volumes minuciosos de amostras (<1 μL) e ajuste fino sobre fenômenos de transporte. O chip juntou-os ao método de diálise, fornecendo controle preciso e reversível sobre o processo de cristalização e pode ser usado para investigar diagramas de fase de proteínas na escala de microliter. O dispositivo é padronizado usando uma resina fotocurável à base de tianoeno com litografia de impressão suave em um substrato polimérico opticamente transparente. Além disso, a dispersão de fundo dos materiais que compõem os microchips e a geração de ruído de fundo foi avaliada tornando o chip compatível para experimentos de difração de raios-X in situ. Uma vez que os cristais proteicos são cultivados no chip até um tamanho adequado e uniformidade populacional, os microchips podem ser montados diretamente em frente ao feixe de raios-X com o auxílio de um suporte impresso em 3D. Essa abordagem aborda os desafios que se elevam com o uso de crioprotetores e a colheita manual em experimentos convencionais de cristalografia de proteínas por meio de uma maneira fácil e barata. Os conjuntos completos de dados de difração de raios-X de múltiplos cristais de liseozúfofos cultivados no chip foram coletados à temperatura ambiente para determinação da estrutura.

Este artigo detalha o protocolo de fabricação de chips microfluidos desenvolvidos para cristalização de proteínas on-chip com o método de diálise e experimentos de difração de raios-X in situ. O processo de microfabização permite integrar uma membrana de diálise regenerada de celulose regenese semipermável com qualquer corte de peso molecular, entre duas camadas do chip.

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Este artigo descreve o protocolo de fabricação de chips microfluidos desenvolvidos para cristalização de proteínas on-chip com o método de diálise e experimentos de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. Uma das principais vantagens desses microchips é a escolha de materiais de fabricação, tornando os chips compatíveis para a coleta de dados de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. Os experimentos de cristalização on-chip requerem pequenos volumes da amostra de proteína, reduzindo o custo global de trabalhar com essas macromoléculas de alto valor.A cristalização on-chip também elimina a colheita manual dos frágeis cristais proteicos, frequentemente aplicados em combinação com o resfriamento crio durante experimentos convencionais de cristalografia. Além disso, nossos microchips utilizam microdiálise para cristalização de proteínas, que é um método baseado em difusão com o objetivo de equilibrar a concentração precipitante através de uma membrana semi-permeável, a fim de abordar a concentração cromulenta para cristalização proteica, e permite o controle preciso e reversível sobre as condições de cristalização. A microdiálise combinada com o controle de temperatura pode ser usada para desacoplar a nucleação do crescimento cristalino para investigar diagramas de fase, alterando a concentração precipitante enquanto usa a mesma amostra de proteína.Primeiro prepare 50 gramas de base de silicone PDMS e é agente de cura em uma proporção de massa de 10 para um. Misture os dois ingredientes em um béquer com uma espátula. Após a mistura, coloque a mistura em uma câmara de vácuo para remover todas as bolhas de ar.Coloque 25 gramas do PDMS pré-xizado no primeiro SU8 para dominar contendo os padrões do canal microfluido e dos pilares, até uma altura de aproximadamente cinco milímetros. Em seguida, despeje os 25 gramas restantes do PDMS no segundo mestre SU8, contendo apenas os padrões dos pilares. Cure as duas camadas de PDMS em um forno a 338 kelvin por uma hora.Corte as camadas pdms curadas ao redor dos padrões dos mestres SU8 com um bisturi, e retire suavemente os moldes PDMS dos mestres do silicone. Coloque o molde PDMS, apresentando tanto os canais quanto os pilares em um rígido deslizamento de vidro microscópio com os padrões voltados para cima. Corte um pequeno pedaço de membrana de diálise de celulose regenerada para cobrir o pilar central do molde PDMS, que foi projetado para ser a câmara proteica.O corte de peso molecular da membrana de diálise é escolhido em conformidade com o peso molecular da amostra de proteína, e os precipitantes da solução de cristalização. Em seguida, separe cuidadosamente o pedaço seco da membrana de diálise de celulose regenerada. Corte um pequeno pedaço da membrana de diálise separada.O tamanho desta peça de membrana depende do design do chip. E especificamente, depende das dimensões do pilar central. Deposite a peça da membrana de diálise no pilar central do molde PDMS, que é suportado na lâmina de vidro, com seu pilar e canais voltados para cima.Em seguida, coloque o segundo molde PDMS com apenas os pilares voltados para baixo, em cima do molde PDMS que já está suportado no escorregador de vidro. Alinhe todos os pilares dos dois moldes PDMS. O pedaço da membrana de diálise de celulose regenerada é sanduíche entre os dois pilares centrais dos moldes PDMS.Esta etapa do procedimento de fabricação pode ser conduzida sob um microscópio óptico ou simplesmente inspecionando visualmente cuidadosamente o alinhamento de todos os pilares. Coloque o conjunto em uma câmara de vácuo e desseca por 30 minutos, a fim de remover as bolhas de ar presas dentro dos moldes PDMS, e para melhorar a inserção da resina NOA fotocurável, que será descrita na próxima etapa deste protocolo. Remova o conjunto da câmara de vácuo e preencha o espaço vazio entre os dois moldes PDMS com a resina fotocurável à base de tialina, NOA 81, por imbibição capilar.Aplique a resina em três dos quatro lados da montagem. Coloque o conjunto em um cruzador e cure a resina NOA expondo à luz UV por oito segundos, usando uma lâmpada UV colidida de 35 miliwatts por centímetro quadrado. Corte uma peça pmma de 175 micrômetros de espessura nas dimensões padrão de um deslizamento de vidro microscópio e retire a proteção plástica de cada lado da peça PMMA.Uma vez que a primeira exposição UV seja concluída, remova o molde PDMS superior com uma resina NOA parcialmente ligada cruzada presa sobre ele a partir do molde PDMS inferior e do slide de vidro. Pressione suavemente a montagem do molde PDMS superior e a resina NOA parcialmente curada na peça PMMA. Coloque o novo conjunto no cross-linker e cure novamente a resina NOA por exposição à luz UV por 60 segundos.Remova cuidadosamente o molde PDMS superior. O chip de diálise feito da resina NOA totalmente cruzada incorporando uma membrana de diálise de celulose regenerada e sendo suportado em uma peça pmma está pronto. Conectores comercialmente disponíveis nos pontos de entrada e saída do canal microfluido com cola epóxi rápida.Para o manuseio do fluido, escolha o diâmetro dos tubos PTFE com base no tamanho dos conectores. Os tubos são utilizados para a introdução da solução de cristalização dentro do canal fluido do chip de diálise. Pipeta manualmente uma gota da amostra de proteína dentro do reservatório de proteínas localizado bem na membrana de diálise.O volume da gotícula de proteína depende do desenho do microchip que está sendo usado. E especificamente, depende do volume do pilar central, e pode ser 0,1 ou 0,3 microliters. Aplique cuidadosamente uma fina camada de graxa de silicone de alto vácuo ao redor do reservatório de proteínas.Corte um pequeno pedaço de PMMA e coloque-o suavemente acima da fina camada da graxa de silicone. Corte um pedaço de fita Kapton, grande o suficiente para cobrir a peça pmma colocada acima do reservatório de proteínas e para ficar no chip NOA em todas as bordas. A amostra de proteína é encapsulada dentro do reservatório e o chip pode ser usado para experimentos de cristalização.Primeiro prepare aproximadamente 500 microliters da solução de cristalização misturando volumes apropriados do buffer e das soluções precipitantes. Injete a solução de cristalização no ponto do chip de diálise através dos conectores fluidos, manualmente com a seringa ou com um sistema automatizado acionado por pressão. Uma vez que o canal fluido é preenchido com a solução de cristalização e nenhum ar é preso dentro, sele as portas de entrada e saída do chip com fita Parafilm.Pipeta o volume adequado da solução proteica dentro do reservatório de proteínas e encapsula a amostra de proteína como já foi descrito. O crescimento do cristal proteico pode ser visualizado e gravado com uma câmera digital. Para a fabricação dos microchips de diálise, escolhemos materiais opticamente transparentes e biologicamente inertes, demonstrando alta compatibilidade para experimentos de difração de raios-X in situ.O ruído de fundo gerado pelos materiais que compõem o compartimento proteico do chip, que está no caminho direto do feixe de raios-X, foi avaliado. O compartimento proteico consiste na membrana de diálise de celulose regenerada, na fita Kapton e em duas camadas de PMMA, uma usada como substrato dos microchips, e outra usada para o encapsulamento da amostra de proteína. Nesta imagem, é ilustrado o ruído de fundo gerado pela fita Kapton, a membrana de diálise de celulose regenerada, a camada PMMA e sua montagem.Embora a resina fotocurável NOA coma o corpo principal dos microchips, não está incluída nestas medidas, pois não faz parte da câmara proteica. Anéis difusos atribuídos às interações dos raios-X com os materiais podem ser vistos para a fita Kapton na resolução inferior a quatro angstroms, o PMMA entre quatro a oito angstroms, e a membrana de diálise entre quatro a cinco angstroms. O ruído de fundo total gerado pelo chip é observado principalmente na resolução inferior a seis angstrom, indicando que o tratamento de dados de difração de alta resolução não é afetado.Os microchips foram montados em frente ao feixe de raios-X com um suporte impresso em 3D que projetamos para experimentos de difração de raios-X in situ, e pode conter até três chips simultaneamente. Foram realizados experimentos para avaliar a eficiência dos microchips para cristalização on-chip de proteínas solúveis por modelos com o método de microdiálise. Os cristais de lysozyme foram cultivados em 293 kelvin em duas condições diferentes.A primeira condição de cristalização continha 1,5 cloreto de sódio molar e acetato de sódio molar de 0,1. A segunda condição de cristalização continha um cloreto de sódio molar, acetato de sódio molar 0,1 e 30% glicol de polietileno 400, e foi escolhida para mostrar a compatibilidade dos microchips e do método de microdiálise, com precipitantes de alto peso molecular e soluções viscosas. Os experimentos de cristalização foram realizados em condições estáticas.Uma vez que os cristais de lysozyme foram cultivados no microchip, eles foram usados para experimentos de difração de raios-X in situ a temperatura ambiente. Os microchips foram montados na linha do feixe com o auxílio do suporte impresso em 3D e conjuntos completos de dados de difração de raios-X foram coletados de dois cristais de lise. Após o tratamento dos dados de difração de raios-X, o mapa de densidade eletrônica de um único cristal de lysozyme foi obtido a 1,95 resolução de angstrom, como mostrado na figura A.Figura B mostra o mapa de densidade eletrônica obtido em resolução de 1,85 angstroms.Após a fusão de dois conjuntos de dados obtidos de dois cristais diferentes de lisezímica, ambos os mapas de densidade eletro mostram informações estruturais detalhadas que podem ser obtidas por experimentos de difração de raios-X in situ realizados diretamente nos microchips de diálise à temperatura ambiente, a partir de cristais proteicos únicos ou múltiplos. Demonstramos o procedimento de fabricação de dispositivos microfluidos projetados para cristalização de proteínas on-chip com o método de microdiálise, e experimentos de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. Utilizamos materiais de fabricação com alta transparência de raios-X, compatíveis para cristalografia de proteína in situ.A coleta de dados de difração é automatizada com o uso de um suporte impresso em 3D para os chips, que podem ser montados diretamente em linhas de feixe de cristalografia macromolecular. A versatilidade deste microchip decorre do uso da microdiálise para controlar reversivelmente as condições de cristalização e mapear diagramas de fase usando pequenos volumes proteicos. A prototipagem do dispositivo é simples, permitindo a fabricação de até 30 microchips em um único dia em uma sala limpa, com materiais relativamente baratos.Esperamos que essas características dos chips possam ser usadas para estudos de cristalografia de raios-X em série de alvos proteicos mais desafiadores.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X

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Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

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Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

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