Name: Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprenda a técnica de estiramento uniaxial de hidrogéis 3D em borracha de silicone com microscopia confocal em tempo real. Este método permite investigar respostas biomecânicas celulares a estímulos mecânicos controlados.

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Algumas figuras incluídas aqui foram adaptadas por permissão do Centro de Liberação de Direitos Autorais: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Esticando hidrogéis 3D com cepas uniformes de eixo Z ao permitir imagens de microscopia ao vivo, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Os autores não têm nada a revelar.

O método e o protocolo aqui apresentados são em grande parte baseados em nosso estudo anterior por Roitblat Riba et al.41 Incluímos aqui o design completo auxiliado por computador (CAD), Python e códigos microcontroladores do dispositivo SCyUS.
As principais vantagens do método apresentado sobre as abordagens existentes incluem a possibilidade de esticar hidrogéis 3D muito macios (Módulo Elástico de ~100 Pa) de sua circunferência, e sob imagens confocal ao ...

A resposta tecidual às forças mecânicas é parte integrante de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo expressão genética1,diferenciação celular2e remodelação tecidual3. Além disso, alterações induzidas por força na matriz extracelular (ECM), como alinhamento de fibras e adensamento, podem impactar o comportamento celular e a formação tecidual4,5,6. A estrutura de malha fibrosa do ECM possui propriedades mecânicas intrigantes, como elasticidade não linear, deformação não afine e deformações plásticas7,8,9,10,11,12. Essas propriedades impactam como as células e seu microambiente circundante respondem às forças mecânicas externas13,14. Entender como o ECM e os tecidos respondem às forças mecânicas permitirá o progresso no campo da engenharia de tecidos e no desenvolvimento de modelos computacionais e teóricos mais precisos.
Os métodos mais comuns para esticar amostras mecanicamente se concentraram em substratos 2D carregados de células para explorar os efeitos no comportamento celular. Estes incluem, por exemplo, a aplicação de cepa a substratos de polidimetilatilaxano (PDMS) e análise de ângulos de reorientação celular em relação à direção de estiramento15,16,17,18,19. No entanto, os métodos que investigam a resposta de hidrogéis embutidos em células 3D ao trecho externo, uma situação que imita mais de perto o microambiente tecidual, são mais limitados. Os avanços em direção aos métodos de alongamento 3D são de particular importância porque as células se comportam de forma diferente em substratos 2D quando comparadas às matrizes 3D20. Esses comportamentos incluem realinhamento celular, níveis de expressão proteica e padrões de migração21,22,23.
Os métodos e dispositivos que permitem o alongamento da amostra 3D incluem ambos comercialmente disponíveis24,25,26,27,28 e aqueles desenvolvidos para pesquisa laboratorial29. Estes métodos utilizam tubos de silicone distensíveis30,câmaras multi-poço31,grampos26,32, bioreatores11,33, cantilevers34,35,36, e ímãs37,38. Algumas técnicas geram trecho que deforma localmente hidrogéis 3D, por exemplo, puxando agulhas de dois pontos únicos no gel5,enquanto outras permitem a deformação de toda a maior parte do gel16. Além disso, a maioria desses sistemas se concentra na análise do campo de tensão no plano X-Y, com informações limitadas sobre o campo de tensão na direção Z. Além disso, apenas um punhado desses dispositivos são capazes de imagens microscópicas in situ. O principal desafio com imagens de alta ampliação in situ (por exemplo, microscópio confocal) é a distância de trabalho limitada de algumas centenas de mícrons da lente objetiva para a amostra. Dispositivos que permitem imagens vivas durante o sacrifício de estiramento a uniformidade da tensão no eixo Zou são relativamente complexos e difíceis de reproduzir em outros laboratórios39,40.
Esta abordagem para esticar hidrogéis 3D permite a tensão uniaxial estática ou cíclica durante a microscopia confocal ao vivo. O dispositivo de alongamento (conhecido como 'Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS') é construído usando peças impressas em 3D e hardware de baixo custo, permitindo fácil reprodução em outros laboratórios. Anexado ao dispositivo está uma borracha de silicone comercialmente disponível com um recorte geométrico em seu centro. Os componentes do hidrogel são polimerizados para preencher o recorte. Durante a polimerização, hidrogéis biológicos, como fibrina ou colágeno, naturalmente aderem às paredes internas do recorte. Usando o SCyUS, a tira de silicone é esticada não axisiomente, transferindo cepas controladas para o hidrogel 3D incorporado41.
Este sistema permite uma combinação única de recursos e vantagens em comparação com outros métodos existentes. Primeiro, o sistema permite alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D espessos (> 100 μm de espessura, <1 kPa rigidez) de sua periferia, com deformação Z-homogênea em todo o hidrogel. Estes hidrogéis são muito macios para serem agarrados e esticados por técnicas convencionais de tração. Em segundo lugar, o dispositivo de alongamento pode ser facilmente replicado em outros laboratórios, uma vez que a impressão 3D está prontamente disponível para os pesquisadores e os eletrônicos usados no design são de baixo custo. Em terceiro lugar, e talvez a característica mais atraente, a geometria e o tamanho do recorte na tira de silicone podem ser facilmente manipulados, permitindo gradientes de tensão e condições de limite, bem como o uso de uma variedade de volumes de amostra, até alguns microliters.
O protocolo apresentado consiste em moldar gel de fibrina em discos de ~2 mm de diâmetro em tiras de borracha de silicone de 0,5 mm de espessura procedidas por estiramento uniaxial sob microscopia confocal ao vivo. O seguinte discute detalhadamente os procedimentos experimentais para medição e análise das cepas que atuam no recorte geométrico, as cepas internas desenvolvidas no hidrogel, bem como o alinhamento de fibras resultante após várias manipulações de estiramento. Por fim, discute-se a possibilidade de incorporar células no hidrogel e expô-las a trechos externos controlados.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 ácido carboxílico, éster succinimidílico</td><td>Invitrogen</td><td>A20002</td><td></td></tr><tr><td>Cell Medium (DMEM High Glucose)</td><td>Biological Industries</td><td>01-052-1A</td><td>Adicione 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamina, 1% Pyruvate de Sódio</td></tr><tr><td>Lamínula #1.5</td><td>Bar-Naor Ltd.</td><td>BN72204-30</td><td>22&times; 40 mm</td></tr><tr><td>SULFÓXIDO DE DIMETILA 99,5% GC DMSO</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D-5879-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>EVICEL Selante de Fibrina (Humano)</td><td>Omrix Biopharmaceuticals</td><td>3902</td><td>Fibrinogênio: 70 mg/mL, Trombina: 800-1200 UI/mL</td></tr><tr><td>Tampão Fibrinogênio</td><td>N/A</td><td></td><td>Receita para 1L: 7g de NaCl, 2,94g de citrato trissódico di-hidratado, 9g de glicina, 20g de cloridrato de arginina e 0,15g de cloreto de cálcio di-hidratado. Traga o volume final para 1L com PuW (pH 7.0-7.2)</td></tr><tr><td>Micro-esferas fluorescentes FluoSpheres (1 &micro; m)</td><td>Invitrogen</td><td>F8820</td><td>Laranja (540/560) Fornecido como suspensão (2% sólidos) em água mais 2 mM azida de</td></tr><tr><td>sódio Borracha de silicone de alta temperatura</td><td>McMaster-Carr</td><td>3788T41</td><td>580 &micro; m-espesso E = 1,5 Mpa Razão de Poisson = 0,48 Resistência à tração = 4,8 MPa Limite superior de estiramento = +300% de tensão de engenharia</td></tr><tr><td>Coluna de dessalinização HiTrap 5 mL (Sephadex G-25 embalado)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1408-01</td><td></td></tr><tr><td>HIVAC-G Composto de vedação de alto vácuo</td><td>Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.</td><td>HIVAC-G 100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ FIJI software39</td><td>Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD</td><td>Versão 1.8.0_112</td><td></td></tr><tr><td>Microcontrolador (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)</td><td>Arduino/Adafruit</td><td>Arduino-DK001/Adafruit-1438</td><td></td></tr><tr><td>MicroVL 21R Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz primovert</td><td>Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.</td><td>491206-0011-000</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS CAD (Solidworks)</td><td>Dassault Syst&egrave; mes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS Code37</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td></td></tr><tr><td>Servomotor - TowerPro SG-5010</td><td>Centrífuga Adafruit</td><td>155</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td>Para 50 tubos mL</td></tr><tr><td>Estéril 10 placas de não-cultura cm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de trombina</td><td>N/A</td><td></td><td>Receita para 1L: 20g de manitol, 8,77g de NaCl, 2,72g de acetato de sódio trihidratado, 24 mL de albumina sérica humana a 25%, 5,88g de cloreto de cálcio. Traga o volume final para 1L com PuW (pH 7.0)</td></tr><tr><td>Solução de tripsina EDTA B (0.25%), EDTA (0.05%)</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>Cabo USB (Tipo B Macho para Tipo A Macho)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 Microscópio Confocal</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>2811000417</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.3 SP1 FP3 (preto)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Versão de lançamento 14.0.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

tensão controlada de hidrogéis 3d sob imagem de microscopia ao vivo

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

As forças externas são um fator importante na formação, desenvolvimento e manutenção de tecidos. Os efeitos dessas forças são frequentemente estudados usando métodos especializados de alongamento in vitro. Vários sistemas disponíveis usam macas à base de substrato 2D, enquanto a acessibilidade de técnicas 3D para coar hidrogéis macios, é mais restrita. Aqui, descrevemos um método que permite alongamento externo de hidrogéis macios a partir de sua circunferência, usando uma tira de silicone elástica como portador da amostra. O sistema de alongamento utilizado neste protocolo é construído a partir de peças impressas em 3D e eletrônicos de baixo custo, tornando-o simples e fácil de replicar em outros laboratórios. O processo experimental começa com hidrogéis de fibrina macia polimerizador (>100 μm) (Elastic Modulus de ~100 Pa) em um recorte no centro de uma tira de silicone. As construções de gel de silicone são então anexadas ao dispositivo de alongamento impresso e colocadas no estágio do microscópio confocal. Sob microscopia ao vivo, o dispositivo de alongamento é ativado, e os géis são imageados em várias magnitudes de estiramento. O processamento de imagem é então usado para quantificar as deformações de gel resultantes, demonstrando cepas relativamente homogêneas e alinhamento de fibras ao longo da espessura 3D do gel (eixoZ). As vantagens deste método incluem a capacidade de coar hidrogéis extremamente macios em 3D durante a execução da microscopia in situ, e a liberdade de manipular a geometria e o tamanho da amostra de acordo com as necessidades do usuário. Além disso, com a devida adaptação, este método pode ser usado para esticar outros tipos de hidrogéis (por exemplo, colágeno, poliacrilamida ou polietileno glicol) e pode permitir a análise de células e resposta tecidual a forças externas em condições 3D mais biomiméticas.

Dados representativos de trecho estático de magnitudes crescentes aplicadas à tira de silicone carregando um hidrogel fibrina 3D, embutido com contas fluorescentes de 1 μm, são mostrados na Figura 9. A análise demonstra o efeito do estiramento do silicone nas alterações geométricas do recorte, bem como as cepas desenvolvidas dentro do gel. Imagensde pilha de Z de todo o gel são usadas para avaliar a deformação do recorte em forma de círculo original para a geometria elíptic...

O método apresentado envolve alongamento uniaxial de hidrogéis macios 3D embutidos na borracha de silicone, permitindo microscopia confocal ao vivo. Demonstra-se a caracterização das cepas de hidrogel externos e internos, bem como o alinhamento de fibras. O dispositivo e o protocolo desenvolvidos podem avaliar a resposta das células a vários regimes de tensão.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Os tecidos biológicos crescem em ambientes moles tridimensionais através dos quais as células são expostas a vários sinais mecânicos. Nosso método permite o alongamento de hidrogéis de forma tridimensional para a investigação de respostas biomecânicas. Essa técnica permite o alongamento uniforme dos hidrogéis ao longo de sua espessura enquanto a imagem ao vivo é realizada.Além disso, a geometria do hidrogel pode ser manipulada em qualquer tamanho ou forma. O conhecimento sobre como as células e a matriz extracelular respondem às forças é importante para revelar como os tecidos se desenvolvem e as doenças progridem. Isso pode levar ao desenvolvimento potencial de terapias contra o câncer e modelos de engenharia de tecidos.Comece usando um cortador a laser ou manual para criar uma tira de borracha com um orifício no centro. Corte um retângulo de filme hidrofóbico para que fique mais largo que as tiras de silicone e lave um prato de plástico com 70% de etanol. Após a secagem com lenços umedecidos sem fiapos, coloque o filme de vedação no prato e coloque uma tira de silicone com o filme plástico removido de um lado no centro de cada pedaço de filme de vedação.Para a formação de gel de fibrina, forneça uniformemente 2,5 microlitros de fibrinogênio rotulado a frio no recorte de silicone de cada tira para que toda a circunferência de cada recorte esteja em contato com o fibrinogênio, tomando cuidado para não permitir que bolsas de ar ou bolhas se formem em qualquer lugar das soluções. Adicione imediatamente 2,5 microlitros de trombina resfriada diretamente a cada solução de fibrinogênio e misture rapidamente as soluções com pipetagem cuidadosa, movendo a ponta ao redor de toda a mistura para criar uma solução o mais homogênea possível. Após a mistura, coloque o prato coberto na incubadora por 30 minutos para polimerização em gel.No final da incubação, adicione PBS suficiente ao prato para submergir as construções de silicone em gel e levante cuidadosamente cada amostra do prato, certificando-se de que a camada de filme de vedação permaneça aderida à tira. Descascando lentamente de uma extremidade do silicone para a outra, retire cuidadosamente o filme de vedação de cada pedaço de silicone, coloque a tira de volta no prato e coloque o prato no palco de um microscópio óptico para avaliar a condição da amostra. Para carregar a amostra no dispositivo de alongamento, encha o banho com PBS e coloque a tira de silicone contendo o gel de amostra na parte superior do banho, de modo que as extremidades da tira fiquem de cada lado do banho.Coloque os grampos e as tiras de tecido e aperte para que todas as peças sejam conectadas para formar uma tira reta com o recorte no centro. Coloque o material no poço e prenda uma lamínula no fundo do poço e, em seguida, coloque um líquido de alumínio no dispositivo de alongamento. Encha o poço com um a dois mililitros de meio de célula PBS e coloque a tira de tecido de gel no dispositivo.Prenda a tira de tecido no suporte de modo que o recorte do gel fique no centro antes de colocar e travar cuidadosamente a inserção do pino no lugar no dispositivo. Coloque e trave o outro lado do tecido no fuso e coloque o dispositivo de alongamento e a amostra anexada no palco de um microscópio confocal. Use um cabo USB para conectar o microcontrolador ao computador e conecte o servo motor ao microcontrolador.Em seguida, abra o módulo de controle do dispositivo de alongamento no computador para obter a imagem da amostra. Para determinar se a amostra é adequada para um experimento, use imagens ao vivo de baixa resolução para escanear todo o gel e determinar a posição Z mais baixa na qual a adesão total às paredes internas do recorte é aparente, sem rasgos ou bolhas. Depois de observar a localização Z do microscópio, escaneie a interface da etiqueta fluorescente do gel e da tira de silicone para determinar a adesão total do gel ao silicone em toda a sua circunferência.Após a digitalização, mova o stage na direção Z até que não haja mais continuidade no gel e observe o limite superior da posição Z. Em seguida, subtraia o limite superior da direção Z do limite inferior para calcular a espessura da amostra. Para determinar a posição de pré-estiramento da amostra, clique em Ir para Zero Servo POS no software do módulo para certificar-se de que o servo motor está em sua posição zero e conecte o servo motor ao dispositivo de alongamento, tomando cuidado para não sobrecarregar a amostra.Durante a geração de imagens, clique no botão mais um para mover o motor um grau de cada vez no sentido horário. Quando o lado direito do recorte se mover, clique no botão menos um para inverter a amostra para a penúltima posição para manter a amostra sob tensão mínima. Clique em Definir posição mínima do servo para definir a posição de referência e capturar uma imagem de bloco de fatia Z única de alta resolução e ampliação de 40 vezes de toda a área do gel como uma referência de linha de base para a análise de pós-processamento.Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, avance o servo motor um grau por segundo até atingir a magnitude de estiramento desejada. Em cada magnitude de estiramento para a qual uma análise é desejada, verifique se o gel não se desprendeu do silicone em nenhum ponto ao longo de sua circunferência, digitalizando a interface entre o gel e o silicone e, em seguida, capture um conjunto de imagens de pilha Z de alta resolução de toda a área do gel para análise de pós-processamento. Aumentar o zoom e rastrear manualmente os agregados de grânulos durante o alongamento do gel permite o cálculo das deformações locais do gel nas direções axial e perpendicular.Normalmente, os fios axiais se propagam de forma relativamente linear da borda do recorte de silicone para o centro do gel e são maiores do que as deformações perpendiculares compressivas. Aqui, são mostradas imagens de alta ampliação de um hidrogel típico não esticado e relativamente isotrópico, e um hidrogênio sob alta tensão de corte de 80% representando fibras altamente alinhadas na direção do estiramento. A análise da reorientação da fibra revelou uma dependência aproximadamente linear entre o alinhamento da fibra e a deformação externa no recorte até deformações de 40% com saturação moderada em deformações acima de 40%.Observe que a resposta do gel ao estiramento é relativamente uniforme ao longo de sua espessura Z. Conforme ilustrado nesta simulação preliminar de elementos finitos realizada em material contínuo 2D, o tapete de cores varia de 38 a 42%, indicando que as cepas de gel são relativamente homogêneas em toda a área circular do gel. É importante garantir que o hidrogel adira completamente às paredes internas do recorte geométrico, pois a adesão e a continuidade são cruciais para o alongamento confiável das amostras.Ao modificar a geometria do recorte de silicone, podemos programar gradientes de deformação e alinhamento de fibras, para que, ao incorporar células, possamos analisar a resposta a esses gradientes.

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