Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

Os tecidos biológicos crescem em ambientes moles tridimensionais através dos quais as células são expostas a vários sinais mecânicos. Nosso método permite o alongamento de hidrogéis de forma tridimensional para a investigação de respostas biomecânicas. Essa técnica permite o alongamento uniforme dos hidrogéis ao longo de sua espessura enquanto a imagem ao vivo é realizada.

Além disso, a geometria do hidrogel pode ser manipulada em qualquer tamanho ou forma. O conhecimento sobre como as células e a matriz extracelular respondem às forças é importante para revelar como os tecidos se desenvolvem e as doenças progridem. Isso pode levar ao desenvolvimento potencial de terapias contra o câncer e modelos de engenharia de tecidos.

Comece usando um cortador a laser ou manual para criar uma tira de borracha com um orifício no centro. Corte um retângulo de filme hidrofóbico para que fique mais largo que as tiras de silicone e lave um prato de plástico com 70% de etanol. Após a secagem com lenços umedecidos sem fiapos, coloque o filme de vedação no prato e coloque uma tira de silicone com o filme plástico removido de um lado no centro de cada pedaço de filme de vedação.

Para a formação de gel de fibrina, forneça uniformemente 2,5 microlitros de fibrinogênio rotulado a frio no recorte de silicone de cada tira para que toda a circunferência de cada recorte esteja em contato com o fibrinogênio, tomando cuidado para não permitir que bolsas de ar ou bolhas se formem em qualquer lugar das soluções. Adicione imediatamente 2,5 microlitros de trombina resfriada diretamente a cada solução de fibrinogênio e misture rapidamente as soluções com pipetagem cuidadosa, movendo a ponta ao redor de toda a mistura para criar uma solução o mais homogênea possível. Após a mistura, coloque o prato coberto na incubadora por 30 minutos para polimerização em gel.

No final da incubação, adicione PBS suficiente ao prato para submergir as construções de silicone em gel e levante cuidadosamente cada amostra do prato, certificando-se de que a camada de filme de vedação permaneça aderida à tira. Descascando lentamente de uma extremidade do silicone para a outra, retire cuidadosamente o filme de vedação de cada pedaço de silicone, coloque a tira de volta no prato e coloque o prato no palco de um microscópio óptico para avaliar a condição da amostra. Para carregar a amostra no dispositivo de alongamento, encha o banho com PBS e coloque a tira de silicone contendo o gel de amostra na parte superior do banho, de modo que as extremidades da tira fiquem de cada lado do banho.

Coloque os grampos e as tiras de tecido e aperte para que todas as peças sejam conectadas para formar uma tira reta com o recorte no centro. Coloque o material no poço e prenda uma lamínula no fundo do poço e, em seguida, coloque um líquido de alumínio no dispositivo de alongamento. Encha o poço com um a dois mililitros de meio de célula PBS e coloque a tira de tecido de gel no dispositivo.

Prenda a tira de tecido no suporte de modo que o recorte do gel fique no centro antes de colocar e travar cuidadosamente a inserção do pino no lugar no dispositivo. Coloque e trave o outro lado do tecido no fuso e coloque o dispositivo de alongamento e a amostra anexada no palco de um microscópio confocal. Use um cabo USB para conectar o microcontrolador ao computador e conecte o servo motor ao microcontrolador.

Em seguida, abra o módulo de controle do dispositivo de alongamento no computador para obter a imagem da amostra. Para determinar se a amostra é adequada para um experimento, use imagens ao vivo de baixa resolução para escanear todo o gel e determinar a posição Z mais baixa na qual a adesão total às paredes internas do recorte é aparente, sem rasgos ou bolhas. Depois de observar a localização Z do microscópio, escaneie a interface da etiqueta fluorescente do gel e da tira de silicone para determinar a adesão total do gel ao silicone em toda a sua circunferência.

Após a digitalização, mova o stage na direção Z até que não haja mais continuidade no gel e observe o limite superior da posição Z. Em seguida, subtraia o limite superior da direção Z do limite inferior para calcular a espessura da amostra. Para determinar a posição de pré-estiramento da amostra, clique em Ir para Zero Servo POS no software do módulo para certificar-se de que o servo motor está em sua posição zero e conecte o servo motor ao dispositivo de alongamento, tomando cuidado para não sobrecarregar a amostra.

Durante a geração de imagens, clique no botão mais um para mover o motor um grau de cada vez no sentido horário. Quando o lado direito do recorte se mover, clique no botão menos um para inverter a amostra para a penúltima posição para manter a amostra sob tensão mínima. Clique em Definir posição mínima do servo para definir a posição de referência e capturar uma imagem de bloco de fatia Z única de alta resolução e ampliação de 40 vezes de toda a área do gel como uma referência de linha de base para a análise de pós-processamento.

Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, avance o servo motor um grau por segundo até atingir a magnitude de estiramento desejada. Em cada magnitude de estiramento para a qual uma análise é desejada, verifique se o gel não se desprendeu do silicone em nenhum ponto ao longo de sua circunferência, digitalizando a interface entre o gel e o silicone e, em seguida, capture um conjunto de imagens de pilha Z de alta resolução de toda a área do gel para análise de pós-processamento. Aumentar o zoom e rastrear manualmente os agregados de grânulos durante o alongamento do gel permite o cálculo das deformações locais do gel nas direções axial e perpendicular.

Normalmente, os fios axiais se propagam de forma relativamente linear da borda do recorte de silicone para o centro do gel e são maiores do que as deformações perpendiculares compressivas. Aqui, são mostradas imagens de alta ampliação de um hidrogel típico não esticado e relativamente isotrópico, e um hidrogênio sob alta tensão de corte de 80% representando fibras altamente alinhadas na direção do estiramento. A análise da reorientação da fibra revelou uma dependência aproximadamente linear entre o alinhamento da fibra e a deformação externa no recorte até deformações de 40% com saturação moderada em deformações acima de 40%.

Observe que a resposta do gel ao estiramento é relativamente uniforme ao longo de sua espessura Z. Conforme ilustrado nesta simulação preliminar de elementos finitos realizada em material contínuo 2D, o tapete de cores varia de 38 a 42%, indicando que as cepas de gel são relativamente homogêneas em toda a área circular do gel. É importante garantir que o hidrogel adira completamente às paredes internas do recorte geométrico, pois a adesão e a continuidade são cruciais para o alongamento confiável das amostras.

Ao modificar a geometria do recorte de silicone, podemos programar gradientes de deformação e alinhamento de fibras, para que, ao incorporar células, possamos analisar a resposta a esses gradientes.