Name: Imagem ao vivo de receptores de quimioterapia em neutrófilos de zebrafish durante respostas de feridas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprenda a visualizar dinâmicas de receptores de quimioatrantes em neutrófilos de zebrafish durante respostas inflamatórias. Este protocolo utiliza microscopia confocal de disco giratório para analisar o tráfico de CXCR1 e CXCR2 em feridas.

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Agradecemos a Christine Holt e Bill Harris por ajuda com microscopia confocal. Agradecemos a Darren Gilmour pelas construções de espinha dorsal fluorescente e Anna Huttenlocher pelo vetor tol2-lyz backbone. Agradecemos a Steve Renshaw pela linha Tg(mpx:GFP)i114 . Este trabalho foi apoiado pelo MRC (MR/L019523/1), pelo Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] e um Isaac Newton Trust concedem 19.23(n). C.C. foi apoiado por uma estudante mrc DTP e em parte pelo Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] concessão. H.W. foi apoiado por uma MrC DTP Studentship. A H.P. foi apoiada por uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) e em parte por um Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] grant e o MRC (MR/L019523/1).

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Os autores declaram não haver conflito de interesses

O método descrito permite imagens vivas da dinâmica do receptor em resposta a ligantes endógenos in situ durante uma resposta inflamatória a danos teciduais. O uso de repórteres de neutrófilo Cxcr1/Cxcr2 poderia ser expandido para outras configurações fisiológicas, como infecção, modelos tumorais ou outros tipos de danos teciduais 14,25,26,27. Além disso, linhas de resgate transgênicas, nas quais o receptor endógeno é suprimido e resgatado por um receptor mutante exógeno, poderiam fornecer ferramentas úteis para dissecar a importância de padrões específicos de migração de neutrófilos em respostas imunes. Por exemplo, mutantes receptores Cxcr1 que prejudicaram a dessensibilização causam agrupamento de neutrófilos mais proeminentes em locais inflamatórios14. Esse ganho de fenotipo de função poderia ser usado para entender o papel da congregação de neutrófilos em diferentes processos fisiológicos, por exemplo, reparação de feridas, doença infecciosa ou evolução tumoral, e complementar experimentos receptores knockdown/knockout. A metodologia também fornece uma base para expandir o leque de repórteres disponíveis. A escolha do repórter fluorescente é importante de se considerar e depende da questão biológica. Descobrimos que a rotatividade constitutiva desses receptores de quimioterapia em neutrófilos foi alta, em comparação com as células epiteliais, e que repórteres com maturação rápida (por exemplo, sfGFP) foram obrigados a relatar níveis de membrana em estado estável e resolver diferenças sobre a estimulação de neutrófilos 8,14. Assim, as relações de membrana de sfGFP/tagRFP não são aplicáveis para medir a internalização induzida por ligante neste tipo de célula, mas o padrão de tagRFP permite o rastreamento dos destinos intracelulares do receptor, o que poderia ser útil em alguns estudos. Também descobrimos que o sinal intracelular mais concentrado do tagRFP é útil para a triagem de larvas individuais. Uma abordagem alternativa para medir os níveis de receptor na membrana plasmática seria co-expressar um marcador de membrana fluorescente em neutrófilos no mesmo transgene9 ou em um transgeneindependente 14. No cenário anterior, o transgene forneceria um meio adicional para a triagem dos níveis de peixe e expressão seria comparável entre o marcador e o receptor. Esta última abordagem seria mais modular, na qual uma linha de zebrafish com um repórter receptor poderia ser combinada com diferentes linhas de repórteres. Em ambos os casos, vale a pena notar que a quantificação da membrana dos níveis do receptor é desafiadora em neutrófilos agrupados (veja abaixo). Por fim, observa-se que uma possível extensão deste protocolo seria acompanhar a imagem ao vivo pela imunohistoquímica para análises de localização mais detalhadas.
O sistema de transgênese Tol2 é bem estabelecido7 e o promotor de lysozyme C tem sido amplamente utilizado para a expressão de neutrófilo11,15. A abordagem transgênese é, portanto, relativamente simples e o nível de expressão alcançado com este promotor é alto o suficiente para fornecer contraste suficiente para a análise da dinâmica dos receptores. Uma possível limitação é que o nível de expressão não recapitula os níveis de expressão do receptor endógeno. Novas tecnologias CRISPR poderiam ser implantadas para estabelecer linhas de impacto para receptores de interesse particular28. Essas tecnologias ainda são complicadas e podem não garantir os níveis de expressão necessários para imagens subcelulares, mas seu desenvolvimento bem-sucedido seria um importante avanço para a compreensão da dinâmica de sinalização endógena. As validações funcionais são importantes para a interpretação de dados com construtos de receptores transgênicos. Por exemplo, ensaios de reconhecimento de ligantes podem ser usados para estabelecer que a proteína de fusão fluorescente é funcional e o resgate de fenótipos eliminatórios poderia ser usado para estabelecer que os níveis de expressão transgênica de neutrófilos são compatíveis com a funcionalidade14. Finalmente, uma maneira mais direta de validar a fusão receptora seria utilizar um ensaio funcional in vitro com receptor rotulado ao lado das versões não rotuladas14.
A abordagem de quantificação aborda dificuldades específicas na segmentação precisa da membrana em neutrófilos in vivo. Em células de natureza epitelial, a quantificação dos níveis dos receptores pode ser executada automaticamente pela normalização dos níveis do receptor de membrana para um marcador de controle, que pode ser expresso em conjunto ou separadamente9. De fato, aplicamos tal abordagem, ao usar o ensaio de reconhecimento de ligantes em embriões gasetruidores14. No entanto, os neutrófilos sofrem mudanças complexas e rápidas na forma celular in vivo, dificultando a segmentação da membrana tanto em 2D quanto em 3D14. Isso é ainda mais desafiador quando os neutrófilos se aglomeram, o que ocorre em muitas configurações fisiológicas29. A métrica de contraste supera essa limitação, pois não requer segmentação de membrana, mas reflete o estado geral de distribuição de receptores na célula (membranous/suave vs vesicular/dotty). É importante notar que a métrica de contraste pode ser afetada pelo contraste geral da imagem, de modo que a normalização dos valores celulares individuais a uma referência interna é necessária para explicar a variabilidade do sinal em diferentes embriões/amostras. Por exemplo, utilizamos o valor médio de contraste celular de neutrófilos não responsivos no CHT (ou seja, neutrófilos que permanecem estacionários e não migram para a barbatana ventral)14. Uma possibilidade adicional seria normalizar com valores de contraste de um marcador de controle na mesma célula. Isso forneceria uma solução quando uma referência interna de células não-respondendo não estiver disponível e provavelmente resolveria diferenças quantitativas mais finas na dinâmica do receptor entre diferentes condições.
A localização da imagem é outra variável a considerar. A razão para escolher a ferida da barbatana ventral aqui, ao contrário da ferida da barbatana traseira mais usada modelo16,30, é porque o local do ferimento está próximo ao local de residência neutrófila/origem migratória. Isso acelera a linha do tempo do ensaio, pois leva relativamente pouco tempo para os neutrófilos chegarem. Além disso, oferece a oportunidade de capturar o comportamento celular tanto na origem migratória (CHT) quanto no local de destino do interesse (ferida). Isso é relevante aqui, pois a resolução espacial e temporal necessária para imagens subcelulares é difícil de combinar com um grande campo de visão ou varredura multi-posição. Assim, o ensaio da ferida da barbatana ventral permite o acompanhamento da evolução da resposta migratória da origem migratória e a captura simultânea de flutuações de receptores inespecíficos em células que não respondem. Como mencionado acima, este último é útil para fins de quantificação, pois fornece uma referência interna para dinâmicas inespecíficas. Em outros sistemas, pode não ser possível ter tal referência interna, nesse caso os valores de contraste de um marcador de membrana co-expresso forneceriam um controle alternativo.
Em resumo, prevemos que a metodologia é aplicável a outros sistemas e pode ser implantada para uma variedade de propósitos. Por exemplo, os mesmos repórteres poderiam ser utilizados em outros ambientes inflamatórios, como configurações de infecção ou outros modelos de doenças. O repertório de linhas de repórteres receptores de zebrafish poderia ser expandido para outros receptores de sinalização, para entender mecanismos de sinalização ou relatar a dinâmica de ligantes in vivo. A abordagem pode ser combinada com técnicas de knockdown/nocaute para interrogar a base mecanicista da dinâmica observada. Por exemplo, a perturbação da expressão de ligantes pode indicar a dependência de ligantes para a dinâmica do receptor observado. No futuro, prevemos que o sistema poderia ser refinado para incorporar a inserção de repórteres. Em última análise, os achados que utilizam essa metodologia forneceriam novas percepções valiosas para além da comunidade de zebrafish, dada a conservação desses receptores de sinalização em mamíferos e o desafio relativo de realizar esses estudos em organismos maiores.

A migração de leucócitos é de suma importância para as respostas imunológicas. As células imunes são células migratórias prototípicas, que são notavelmente capazes de atravessar tecidos e vasos sanguíneos e sentir uma série de sinais de orientação química para migrar direcionalmente em direção a micróbios ou outras células hospedeiras de importância. A orientação correta baseia-se no reconhecimento de quimioattractants, entre os quais as quimiocinas representam a categoria1 mais proeminente. As quimiocinas são reconhecidas por receptores acoplados altamente específicos de sete transmembranos G. Após a ligação de quimiocina, os receptores de quimioterapia mudam a conformação levando à ativação de proteínas G trimeric associadas e sua dissociação em subunidades de sinalização funcional que promovem alterações citoesqueléticas e migração direcionada1. Em segundo lugar, os receptores de quimioterapia são fosforilados, e essa modificação leva à dessensibilização ao atrativo, que pode ser seguida por rápida resensibilidade/reciclagem ou degradação intracelular e baixa regulação da superfície celular2. Essas dinâmicas receptoras influenciam a duração e a dose de sinalização recebida pelas células, mas como elas afetam o comportamento de migração de leucócitos tem sido difícil de elucidar in vivo.
O rastreamento da dinâmica dos receptores em leucócitos vivos em sistemas tradicionais de mamíferos enfrenta vários desafios. Para estudos vivos, fusões receptoras com proteínas fluorescentes devem ser expressas nas células. Isso é desafiador em leucócitos primários, particularmente em neutrófilos, e estudos até agora têm usado linhas de células neutrófilas substitutas para expressar receptoresde quimioterapia 3,4. A geração de modelos de camundongos transgênicos, nos quais os leucócitos expressam um receptor fluorescente ou receptores mutantes com defeitos informativos de tráfico 5,6, implica um investimento considerável de tempo e recursos. Mesmo nesses casos, a resolução de imagens e o contraste para a dinâmica do receptor de imagem no animal vivo podem ser limitados e estudos têm usado imunohistoquímica nas seções de tecido fixo5. Dado esses desafios técnicos, nossa compreensão de como a dinâmica dos receptores quimioattractant afeta o comportamento celular em um ambiente de tecido vivo é atualmente limitada.
Aqui fornecemos uma metodologia para monitorar o tráfico de receptores em neutrófilos de zebrafish. Os zebrafish são geneticamente tratáveis, como ratos, mas a transgênese é relativamente mais simples através do uso de sistemas transposon eficientes e manipulação direta de zigoto7. A larva transparente é idealmente agradável à imagem. A dinâmica do receptor de quimiocina foi visualizada em células germinativas primordiais e a linha lateral primordium por expressão de fusões correspondentes com repórteres fluorescentes 8,9,10. As larvas de zebrafish são equipadas com neutrófilos maduros que têm propriedades genéticas e celulares altamente conservadas em relação aos neutrófilos mamíferos. Dinâmicas de sinalização subcelular, como a dinâmica citoesqueléllica e os reguladores de polaridade foram visualizadas nessas células pela geração das linhas transgênicas correspondentes 11,12,13. Recentemente, visualizamos e analisamos funcionalmente a dinâmica do receptor de quimioterapia em neutrófilos durante o curso de respostas inflamatórias a danos teciduais14. Aqui, descrevemos a geração de linhas de repórteres transgênicos para sinalização de quimiocina em neutrófilos, preparação de embriões para imagens vivas, um ensaio de ferida para estudar sinalização de neutrófilo e o protocolo para aquisição e análise de imagens. Também fornecemos um protocolo lateral para testar as respostas do receptor de quimiocina aos ligantes candidatos, o que é útil ao tentar estabelecer padrões de reconhecimento de ligantes em receptores não característicos. Essas técnicas podem ser usadas em combinação com outras manipulações genéticas, como a inibição da expressão endógena da quimiocina ou geração de receptores mutantes com tráfico induzido por ligantes alterados, para questionar como a dinâmica de sinalização específica afeta o comportamento leucócito in vivo. As linhas transgênicas que expressam receptores de quimioterapia fluorescentes também podem ser usadas como repórteres para gradientes endógenos de quimioterapia, que são difíceis de detectar por manchas diretas de anticorpos. A metodologia descrita fornece espaço para a expansão da geração de repórteres para outros receptores de imuno-sinalização.

<table><tbody><tr><td>1-fenil-2-tioureia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar Tubo de Centrífuga</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark capilar de vidro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin Bleach</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de dissecação</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor Dri Block</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps, Joalheiros Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de micropoços com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta pasteur de vidro</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal Leica SP8</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul</td> <td>de metilenoSigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microinjeção</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de Micropipetas</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 microscópio confocal de disco giratório</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincel pequeno</td><td>N / A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pesquisa Aplicada Espectral LMM5 módulo</td><td></td> de laser <td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi cirúrgico nº 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 scanner confocal de disco giratório</td><td>Yokogawa</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem ao vivo de receptores de quimioterapia em neutrófilos de zebrafish durante respostas de feridas

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

A orientação de leucócitos por gradientes químicos é essencial para respostas imunes. Os neutrófilos são as primeiras células a serem recrutadas para locais de danos teciduais onde executam funções antimicrobianas cruciais. Seu tráfico para esses loci é orquestrado por vários quimioattractants inflamatórios, incluindo quimiocinas. No nível molecular, a sinalização de quimioattractant é regulada pelo tráfico intracelular dos receptores correspondentes. No entanto, ainda não está claro como as mudanças subcelulares nos receptores de quimiocina afetam a dinâmica de migração de leucócitos no nível celular e tecidual. Aqui descrevemos uma metodologia para imagens ao vivo e análise quantitativa da dinâmica do receptor de quimioterapia em neutrófilos durante respostas inflamatórias a danos teciduais. Essas ferramentas revelaram que o tráfico diferencial de receptores de quimioterapia em neutrófilos de zebrafish coordena o agrupamento e dispersão de neutrófilos em locais de danos teciduais. Isso tem implicações para nossa compreensão de como as respostas inflamatórias são auto-resolvidas. As ferramentas descritas poderiam ser usadas para entender padrões de migração de neutrófilos em uma variedade de ambientes fisiológicos e patológicos e a metodologia poderia ser expandida para outros receptores de sinalização.

A ferida da barbatana ventral é seguida pela rápida mobilização de neutrófilos do CHT para a barbatana ventral e agrupamento na margem da ferida, dentro de 30-60 min (Figura 1). Visualizamos a distribuição de dois receptores de quimiocina, Cxcr1 e Cxcr2, que são expressos por neutrófilos de zebrafish24 e reconhecem Cxcl8a e Cxcl8b14, usando microscopia confocal de disco giratório. Geramos duas linhas transgênicas correspondentes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) e Tg(lyz:Cxcr2-FT), nas quais os neutrófilos expressam uma construção do temporizador fluorescente (FT) do receptor, ou seja, uma fusão com um tandem de sfGFP e tagRFP (Figura 2 e referência14). O uso dos dois fluoroforos destinava-se a permitir o monitoramento de uma ampla gama de destinos receptores e fornecer estimativas de tempo de rotatividade de proteínas na membrana plasmática, já que receptores recém-sintetizados fluoresceriam em verde e progressivamente se tornariam vermelhos à medida que envelheciam 8,14 anos. No entanto, esses receptores apresentaram rápida rotatividade constitutiva na membrana plasmática de neutrófilo e que o tempo de residência foi menor do que o tempo de maturação do tagRFP, com sfGFP mostrando localização de membrana e tagRFP mostrando localização vesicular em estado estável (Vídeo Suplementar 1 e ref14). Por isso, focamos na distribuição do SFGFP para monitorar a internalização induzida por ligantes em locais de danos teciduais. O padrão de distribuição do receptor foi quantificado utilizando-se a métrica de contraste, que relata diferenças de intensidade entre pixels vizinhos. A lógica é que quando a distribuição do receptor é membranous e suave, o valor de contraste é baixo. Quando a distribuição do receptor é vesicular e mais pontual, então o valor de contraste é alto (Figura 3).
Um método alternativo é quantificar a razão dos níveis de receptor (intensidade sfGFP) sobre os níveis de um marcador de membrana de controle, por exemplo, membrana CFP (mCFP) (Figura 3). Ambos os métodos poderiam detectar a internalização do receptor, como indicado por um padrão de distribuição de receptores mais vesiculares globalmente na célula (maior valor de contraste) ou níveis de receptores mais baixos na membrana (menor razão sfGFP/mCFP). No entanto, a métrica de contraste também poderia detectar internalização do receptor em aglomerados de neutrófilos na ferida, em que a segmentação da membrana era menos precisa e não aplicável (Figura 3). Utilizando esta métrica, conseguimos quantificar diferenças visíveis entre o tráfico de Cxcr1 e Cxcr2 em neutrófilos em feridas (Figura 4 e Vídeo Suplementar 2). Cxcr1-FT internalizado em células localizadas na ferida, enquanto Cxcr2-FT permaneceu membranous em neutrófilos na ferida (Figura 4A-C, Vídeo Suplementar 2 e Vídeo Suplementar 3). A supressão de Cxcl8a e Cxcl8b, através do tratamento de morfolino, afetou diferencialmente a internalização Cxcr1-FT nas feridas (Figura 4C,D). Para validar ainda mais que o Cxcr1-FT responde ao Cxcl8a, realizamos ensaios de resposta de quimioterapia em embriões precoces. Descobrimos que cxcr1-FT foi significativamente internalizado em embriões nos quais Cxcl8a foi co-expresso (Figura 5). Ao todo, esses resultados indicam que os métodos descritos podem ser implantados para medir a internalização do receptor induzido pela quimiocina em neutrófilos e estabelecer a identidade do ligante mediando esses efeitos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figura 1: Migração de neutrófilo para feridas de barbatana ventral. (A) (Esquerda) Desenho de 3 larvas dpf mostrando a localização do tecido hematopoiético caudal (CHT), a circulação de vênus (VC, azul), a barbatana ventral (VF) e o local da ferida. (À direita) Desenho animado retratando a área da ferida (W) com neutrófilos sendo mobilizados do CHT e agrupando-se na ferida. O plexo da veia caudal (CVP) do tecido CHT é desenhado em azul. (B) Imagem de campo brilhante (esquerda) e projeção confocal (direita) mostrando a ferida da barbatana ventral e a distribuição de neutrófilos em larvas Tg (mpx:GFP) a 2 h após o ferimento. As linhas tracejadas mostram contornos VF e CHT. Barra de escala = 25 μm. Desenho animado e imagem fluorescente modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figura 2: Imagem ao vivo do tráfico de receptores de quimioterapia em neutrófilos. (A) Construções utilizadas para expressão transgênica específica de neutrófilo de Cxcr1-FT (Temporizador Fluorescente) e Cxcr2-FT. Projeções confocal de neutrófilos na cabeça de uma larva transgênica de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), topo; Tg(lyz:Cxcr2-FT), inferior) mostrando canais tRFP (magenta) e sfGFP (verde). Barra de escala = 20 μm. (B) Esquema anatômico de 3 dpf larva como na Figura 1A. Abaixo da larva estão esquemas que retratam a área da ferida (W) com neutrófilos sendo mobilizados a partir do CHT (topo) ou realizando quimitaxis ao entrar na barbatana ventral (inferior). O quadrado tracejado indica área imagem em instantâneos à direita. (C) Nêutrons em larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP) após a mobilização do CHT (painéis superiores) ou quimiotaxis em direção à ferida (painéis inferiores). As flechas mostram as mesmas células ao longo do tempo. Os pontos de tempo na imagem direita são minutos decorridos após a imagem à esquerda. Barra de escala = 10 μm. (D) Representação esquemática da abordagem experimental para imagem ao vivo do tráfico de receptores de quimioterapia. Painéis A-C modificados a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figura 3: Exemplos de quantificação da dinâmica dos receptores. Neutrófilos únicos (azuis) ou agrupados (verdes) em feridas ou neutrófilos não mobilizados na CHT (vermelho, laranja) foram segmentados e analisados por diferentes métodos para comparar resultados. As mesmas células de exemplo mostradas foram analisadas com dois métodos para relacionar o que é visto na imagem com a gama de valores extraídos. (A) A superfície das células selecionadas, exemplo, foi segmentada com base na definição de contorno no canal sfGFP. (B) O contraste foi computado a partir das células de exemplo mostradas em A. (C) A membrana das células selecionadas, exemplo, foram segmentadas com base na definição de contorno no canal CFP. Análise ratiométrica do sfGFP/CFP seguido. (D) A razão de sfGFP/CFP foi calculada nas células de exemplo mostradas em C. As barras de erro representam S.E.M. de células individuais, em casos de n&gt;1, valores aqui não foram utilizados para análise estatística, mas apenas para exemplificar medições obtidas com os diferentes métodos de quantificação. Barra de escala = 10 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figura 4: Dinâmica diferencial de Cxcr1 e Cxcr2 em resposta ao ferimento. (A) Projeção confocal de neutrófilos em larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) ou Tg (lyz:Cxcr2-FT) na ferida a 80 min pós-ferida (canal sfGFP mostrado). Barra de escala = 10 μm.  (B) Neutrófilo Cxcr1-FT ampliado (esquerda) e Cxcr2-FT (direita) na ferida. Receptor verde é mostrado em cinza. Barra de escala = 5 μm. (C) Contraste normalizado (contraste por neutrófilo individual normalizado ao contraste médio de células não mobilizadas no CHT). cxcl8a refere-se à injeção de um bloqueio de emendas juntamente com um morfolino bloqueador de tradução para cxcl8a. cxcl8b refere-se à injeção com um morfolino bloqueador de emendas para cxcl8b. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 células (CHT), n=47 células (ferida) de 8 larvas. Para Tg (lyz:Cxcr1-FT) com morfolnos: n=28 células (Cxcl8a-MO) de 5 larvas, n=16 células (Cxcl8b-MO) de 5 larvas. Para Tg (lyz:Cxcr2-FT): n=10 células (CHT) e n=20 células (ferida) de 3 larvas. Os dados foram agrupados de larvas independentes adquiridas em 1-5 sessões de imagem. Teste de Kruskal-Wallis com o teste de comparações múltiplas de Dunn para Tg (lyz:Cxcr1-FT), teste mann-whitney não pago de duas caudas para Tg (lyz:Cxcr2-FT). (D) Projeção confocal de neutrófilos em Tg(lyz:Cxcr1-FT) larvas transgênicas tratadas com cxcl8a morpholino (MO) (esquerda) e cxcl8b MO (direita) respondendo a feridas de barbatana (canal sfGFP mostrado em verde). Instantâneo tirada em pontos de tempo de acúmulo de neutrófilo equivalente (85 min pós-ferimentos na imagem esquerda e 45 minutos pós-ferimentos na imagem direita). Barra de escala = 10 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figura 5: Ensaio de resposta de quimiocina em embriões primitivos. Fatias confocal de escaneamento a laser de embriões gastrulating mostrando expressão e distribuição de Cxcr1-FT. 100 pg de Cxcr1-FT mRNA foram injetadas em um estágio celular com ou sem 150 pg Cxcl8a mRNA. Receptores verdes e vermelhos são mostrados em canais separados. O marcador CFP da membrana de controle (mCFP) é mostrado no canal ciano. Barra de escala = 20 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme suplementar 1: Neutrófilos transgênicos na cabeça de uma larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (esquerda) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (direita) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 5 fps. Barra de escala = 20 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Filme suplementar 2: Neutrófilos em Tg (lyz:Cxcr1-FT) (esquerda) e Tg (lyz:Cxcr2-FT) (direita) larvas transgênicas respondendo a feridas na barbatana. O filme começa dentro de 10 min pós-ferida e dura 60 min. sfGFP (verde), tagRFP (magenta). O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 10 fps. CHT = tecido hematopoiético caudal. VF = barbatana ventral. Barra de escala = 25 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Filme suplementar 3. Exemplos adicionais de neutrófilos de uma larva transgênica Tg(lyz:Cxcr1-FT) ferida (larva diferente da mostrada no Vídeo 2), adquirida em maior resolução, mostrando internalização receptora (canal sfGFP mostrado em verde) após mobilização no CHT ou na entrada e quimipeso na barbatana ventral. O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 2 fps. Barra de escala = 10 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Arquivo complementar 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui descrevemos protocolos para realizar imagens ao vivo e análise quantitativa da dinâmica do receptor quimioattractant em neutófilos de zebrafish

Imagem ao vivo de receptores de quimioterapia em neutrófilos de zebrafish durante respostas de feridas

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Os neutrófilos são importantes células inflamatórias que se infiltram nas feridas em resposta a ligantes químicos produzidos localmente. Este protocolo permite a visualização da dinâmica do receptor em resposta a tais ligantes in vivo. O uso de repórteres de receptores de quimiocinas pode ser expandido para outros ambientes fisiológicos, como modelos de infecção e tumor e para outras células imunológicas.O método torna possível rastrear quando e onde no tecido os leucócitos detectam moléculas atraentes de química. Isso pode permitir uma melhor compreensão de como as respostas imunológicas se desdobram e se resolvem. Realizar um ferimento da barbatana ventral em larvas de peixe-zebra requer manipulação de larvas finas, portanto, é necessária alguma prática em larvas não destinadas a fins experimentais.No dia 2,5 a 3,5 após a fertilização, coloque as larvas de peixe-zebra anestesiadas sob um escopo de dissecação fluorescente e selecione as larvas com expressão de receptores transgênicos. Transfira as larvas selecionadas para uma placa de Petri de 120 milímetros contendo Tricaína suplementada com meio E3 e use um bisturi estéril para cortar a barbatana ventral de cada larva com profundidade suficiente para causar recrutamento substancial de neutrófilos sem cortar os vasos do tecido hematopoiético caudal. Adicione 500 microlitros de 2X Tricaine a um prato com fundo de vidro, depois adicione 500 microlitros de solução de agarose e misture mexendo delicadamente com a ponta da pipeta.Use uma pipeta para transferir as larvas de peixe-zebra anestesiadas feridas para o prato e oriente o embrião lateralmente enquanto empurra suavemente para baixo para que a parte caudal do peixe fique o mais próximo possível do fundo do vidro. Quando o embrião estiver em posição, deixe a agarose esfriar. Após cinco a 10 minutos, toque suavemente o gel com um pincel pequeno para confirmar a solidificação e adicione dois mililitros de meio E3 suplementado com 0,2 miligramas por mililitro de Tricaína à placa.Visualize o local da ferida usando um microscópio confocal de disco giratório. Assim que possível, após a agarose endurecer, transfira o embrião para a plataforma de disco giratório de imagem confocal e use o joystick de platina e a objetiva do microscópio para localizar os peixes. Usando a objetiva de 30 a 40X, concentre-se na área da ferida e selecione o campo para obter imagens ao redor da ferida.Selecione o laser e ajuste o tempo de exposição, configure um lapso de tempo a cada 30 segundos para a duração desejada e obtenha uma imagem de campo claro para documentar o campo de visão. Para quantificar a internalização do receptor de neutrófilos no local da ferida, abra os conjuntos de dados de imagem em Fiji e use o controle deslizante de tempo para selecionar um período de tempo representativo de interesse para cada conjunto de dados. No MATLAB, crie um novo script e inclua funções para leitura de imagens, abertura e seleção manual dos pontos de interesse.Execute o script para abrir o quadro de interesse e clique nos neutrófilos para análise. Registre uma estimativa de seus centróides, tanto na ferida da nadadeira ventral quanto no tecido hematopoiético caudal. Segmente os neutrófilos em cada quadro usando a técnica de contornos ativos e crie o script para adicionar o cálculo da matriz de co-ocorrência do nível de cinza para cada neutrófilo, incluindo o cálculo do contraste dos neutrófilos com base na matriz de co-ocorrência do nível de cinza.Adicione comandos para salvar os valores separadamente para neutrófilos individuais na nadadeira ventral, incluindo o cálculo do valor médio do contraste de neutrófilos de todos os neutrófilos do tecido hematopoiético caudal. Inclua a normalização do valor de contraste de neutrófilos individuais no local da ferida para o contraste médio calculado dos neutrófilos do tecido hematopoiético caudal para obter um contraste normalizado que reflita o quão pontilhada é a aparência de um receptor dentro das células que respondem individualmente em relação às células de controle não respondedoras. Em seguida, clique em executar para executar o script.A ferida da nadadeira ventral é seguida por rápida mobilização de neutrófilos do tecido hematopoiético caudal para a nadadeira ventral e agrupamento na margem da ferida dentro de 30 a 60 minutos após a indução da lesão. Nesta análise, os receptores de quimiocinas CXCR1 e CXCR2 expressos por neutrófilos de peixe-zebra foram fotografados usando microscopia confocal de disco giratório. O padrão de distribuição do receptor foi quantificado usando a métrica de contraste, que relata diferenças de intensidade entre pixels vizinhos.Um método alternativo é quantificar a proporção dos níveis de receptores sobre os níveis de um marcador de membrana controlado. Usando a métrica de contraste para detectar a internalização do receptor em aglomerados de neutrófilos na ferida, as diferenças visíveis entre o tráfego de CXCR1 e CXCR2 em neutrófilos no local da ferida podem ser quantificadas. Por exemplo, nesta análise, a internalização do CXCR1 marcado com fluorescência nas células localizadas no local da ferida aumentou com o tempo, enquanto o CXCR2 marcado com fluorescência permaneceu nas membranas dos neutrófilos na ferida.A supressão dos ligantes CXCR1 e CXCR2 por meio do tratamento com morfolino resulta na internalização diferencial de CXCR1 marcada com fluorescência no local da ferida. Além disso, em embriões iniciais, o CXCR1 marcado com fluorescência é marcadamente internalizado em embriões nos quais o ligante do receptor é co-expresso. Ao tentar este protocolo, lembre-se de que a imagem deve ser realizada o mais rápido possível após a ferida para capturar a dinâmica do receptor durante o recrutamento de neutrófilos para as feridas.Após a imagem dos receptores de quimiocinas em larvas normais, os pesquisadores podem realizar imagens comparativas em larvas mutantes com inflamação desregulada.

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

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Este vídeo demonstra o rastreamento do recrutamento de leucócitos usando larvas de peixe-zebra transgênicas que expressam proteína fluorescente verde fotoconversível. A pré-injeção de bactérias marcadas com corante fluorescente vermelho na vesícula ótica e a indução da fotoconversão permitem a observação da migração, fagocitose e dispersão dos leucócitos por todo o corpo, fornecendo informações valiosas sobre a dinâmica da resposta imune.

Rastreamento de leucócitos baseado em fotoconversão em peixe-zebra transgênico infectado por bactérias

O vídeo demonstra uma técnica de dispositivo de ferimento e aprisionamento de peixe-zebra para observar a infecção por patógenos fúngicos marcados com fluorescência em larvas de peixe-zebra. A infecção inicial atrai macrófagos e, à medida que a infecção persiste, o recrutamento de neutrófilos progride no local da injeção.

Uma técnica zWEDGI para visualizar larvas de peixe-zebra infectadas por patógenos fúngicos

Estudar os primeiros eventos de progressão de células pré-neoplásicas e interação célula imune inato é fundamental para compreender e tratar o câncer. Aqui nós descrevemos um método para induzir condicionalmente transformações de células epiteliais e do subsequente imagens ao vivo de interação célula imune inato com HRAS G12V expressando células da pele em larvas do peixe.

Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração e imagem de uma infecção bacteriana localizada na vesícula ótica do peixe-zebra.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

Modelos de infecção sistêmica e localizada de peixe-zebra para o vírus influenza A humano são demonstrados. Usando um modelo de infecção sistêmica, o peixe-zebra pode ser usado para rastrear medicamentos antivirais. Usando um modelo de infecção localizada, o peixe-zebra pode ser usado para caracterizar as respostas das células imunes do hospedeiro.

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

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Aqui nós apresentamos um protocolo para a reparação de ferida de geração de imagens ao vivo e a resposta inflamatória associada à alta resolução espaço-temporal na vivo. Este método utiliza o estágio de pupa de Drosophila desenvolvimento para habilitar a longo prazo de imagem e rastreamento de populações de células específicas ao longo do tempo e é compatível com a inativação de genes mediada por RNAi eficiente.

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

Para testar o efeito de um quimiocina no recrutamento do macrófago in vivo, a hibridação in situ da montagem inteira foi usada para detectar a expressão ectópica do quimiocina, e a imunomarcação foi usada para etiquetar macrófagos. A imagem latente viva foi usada para a observação tempo real da migração do macrófago.

Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo

Zebrafish visando eletrófilos reativos e oxidantes (Z-REX) é um método baseado em biologia química para a investigação da sinalização de pequenas moléculas reativas. Esta técnica pode ser aplicada a peixes vivos de diferentes estágios de desenvolvimento. Aqui, acoplamos ensaios padrão em zebrafish com Z-REX para análise de vias de sinalização.

Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

Aprenda a visualizar dinâmicas de receptores de quimioatrantes em neutrófilos de zebrafish durante respostas inflamatórias. Este protocolo utiliza microscopia confocal de disco giratório para analisar o tráfico de CXCR1 e CXCR2 em feridas.

Imagem ao vivo de receptores de quimioterapia em neutrófilos de zebrafish durante respostas de feridas

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