Análise de rastreamento de nanopartículas de nanopartículas de ouro na mídia aquosa através de uma comparação inter-laboratorial

Este protocolo usa análise de rastreamento de nanopartículas para realizar medições precisas, confiáveis e reprodutíveis dos diâmetros hidrodinâmicos dos nanomateriais de interesse. O método é rápido e fácil de executar, facilitando a medição do diâmetro hidrodinâmico equivalente esférico das partículas, via análise visual em tempo real partícula por partícula e preparação mínima da amostra. Antes de realizar uma medição, filtre o volume de água ultrapura a ser usado para a análise através de um filtro de seringa de 0,02 mícron.

Diluir a amostra adequadamente na água filtrada. Para esta amostra de dispersão coloidal de ouro de 60 nanômetros, diluir volumetricamente por um fator de 50. Conecte o instrumento NTA, a bomba de seringa e o computador e ligue o hardware e o software.

Remova o módulo de laser do sistema e use um lenço de papel e ar comprimido para secar completamente as superfícies de vidro e os canais internos, tubos e portas fluídicas do LVFC. Coloque o LVFC no módulo de laser e prenda-o com os quatro parafusos apertando-os diagonalmente. Conecte a tubulação de saída à porta no lado direito da célula.

Insira o tubo de entrada no frasco de resíduos e lave 900 microlitros de solução de limpeza o mais rápido que a contrapressão permitir. Substitua a seringa conectada ao tubo de entrada por uma nova seringa contendo um mililitro de água filtrada e conecte o tubo de entrada à porta esquerda da célula de fluxo. Em seguida, introduza lentamente aproximadamente 500 microlitros de fluido na câmara de amostra, tomando cuidado para que nenhuma bolha de ar seja introduzida durante o carregamento.

Para carregar o módulo de laser, insira o LVFC cheio de água no instrumento e trave a célula no lugar. Prenda a seringa e o suporte da bomba da seringa e clique em Iniciar câmera na interface do software para inicializar a câmera. Na guia de hardware, clique em Dispersão para mover a posição de referência e definir o nível da câmera para 16.

Ajuste o foco manualmente para verificar se há partículas no diluente e clique com o botão esquerdo e arraste na janela de visualização principal para ajustar a posição do campo de visão para verificar se há partículas. Para limpar o sistema, substitua a seringa por uma seringa cheia apenas de ar e substitua lentamente a água na câmara por ar. Remova a célula do módulo de laser do instrumento e desconecte os pedaços de tubo.

Limpe o vidro óptico do módulo de laser e as superfícies de vidro do LVFC com água e seque com um lenço de papel e ar comprimido. Depois de remontar o LVFC e o módulo de laser e preparar o tubo, conecte uma seringa contendo um mililitro da suspensão de nanopartículas de ouro de 60 nanômetros à porta inferior e injete lentamente 750 microlitros da amostra na câmara LVFC. Depois de carregar o módulo de laser e inicializar a câmera, clique em Dispersão para mover o foco de referência para a posição, confirmando se o foco está definido corretamente para fornecer uma imagem clara das partículas.

Verifique se o campo de visão está definido centralmente em relação à posição do feixe de laser e execute a função de configuração automática para otimizar automaticamente o foco e o nível da câmera para garantir que a qualidade de imagem ideal seja alcançada. Para analisar a amostra, abra a guia Procedimento Operacional Padrão de Medição Padrão e configure o instrumento para adquirir cinco vídeos de 60 segundos sob fluxo lento e constante. Em seguida, defina o nome do arquivo e o local dos dados e inicie a execução.

Para analisar os dados, arraste a barra deslizante na guia Limite de detecção para definir o limite de detecção para que o maior número possível de partículas visíveis seja detectado e rastreado. Certifique-se de que não sejam observadas mais de cinco cruzes azuis indicativas de ruído. Para processar automaticamente os vídeos de análise de rastreamento de partículas, clique em Configurações, OK e deixe todos os parâmetros de processamento em suas configurações automáticas.

Após a conclusão do processamento de dados, exporte os dados como um arquivo de resultados do formulário CSV. Aqui, são mostrados os resultados da comparação entre laboratórios obtidos usando várias configurações de instrumentos de análise de rastreamento de nanopartículas. Com exceção do laboratório seis, a repetibilidade entre as cinco repetições de captura foi boa, embora vários laboratórios tenham registrado um tamanho de modo maior do que o esperado.

A precisão do resultado da análise de rastreamento de nanopartículas da terceira rodada foi aprimorada por todos os laboratórios que implementaram o mesmo procedimento operacional padrão e configurações de instrumentos com um modo médio em todos os laboratórios de 62,02 mais ou menos 1,97 nanômetros. O diâmetro médio das partículas pode ser calculado usando imagens de microscopia eletrônica de transmissão como uma técnica complementar ao NTA para validar o tamanho, morfologia e proporção das partículas. Nesta análise, as partículas parecem ser principalmente esféricas com uma proporção média de 1,1.

É importante certificar-se de que a célula de fluxo de baixo volume esteja bem limpa antes do uso, que a amostra esteja adequadamente diluída, bem carregada e focalizada e que o SOP seja seguido. Este método pode ser usado para qualquer outra caracterização de nanopartículas, incluindo exossomos e vírus para apoiar estudos de estabilidade e processos de qualidade controlada.