Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

Este protocolo facilita a preparação de fatias horizontais do cérebro do hipocampo para seu uso em várias aplicações científicas. Esta técnica preserva a integridade de todas as vias de fibras do hipocampo dentro de uma única fatia do hemisfério. Este protocolo slice é ideal para avaliar alterações neurológicas que ocorrem em patologias cerebrais que se desenvolvem e se manifestam no giro denteado.

O aspecto mais importante deste protocolo é encontrar o equilíbrio entre uma execução o mais rápida possível e o manuseio suave do tecido cerebral. Para preparar um litro de ACSF, misture lentamente todos os produtos químicos sólidos conforme indicado em 800 mililitros de água sob agitação constante com uma barra de agitação magnética antes de pingar lentamente nos volumes apropriados de sulfato de magnésio e cloreto de cálcio. Em seguida, use um osmômetro de pressão de vapor para validar a osmolaridade entre 305 a 315 miliosmoles e borbulhe continuamente a solução ACSF à temperatura ambiente com carbogênio para definir o pH entre 7,3 e 7,4.

Para preparar 250 mililitros de solução de fatia com alto teor de sacarose, adicione os compostos a 25 mililitros de solução pré-fatiada, conforme indicado na tabela, e verifique se a osmolaridade está entre 320 e 325 miliosmole. Em seguida, borbulhe a solução de fatia com alto teor de sacarose por 10 a 15 minutos com carbogênio para definir o pH entre 7,3 e 7,4 e armazene a solução de fatia com alto teor de sacarose por 20 a 30 minutos a 80 graus Celsius negativos até que esteja parcialmente congelada. Para preparar um espaço de trabalho para a dissecção, encha uma câmara de recuperação com solução ACSF carbogenada e coloque a câmara em banho-maria a 32 graus Celsius.

Defina o vibratomo para o programa de corte apropriado e encha o suporte com gelo, monte-o no vibratomo e prenda uma lâmina ao braço do vibratome. Use uma espátula para esmagar e misturar a solução de fatia de alta sacarose parcialmente congelada até obter uma lama heterogênea. Em seguida, borbulhe a solução com carbogênio e use a solução para hidratar um pedaço de papel de filtro em cima de uma placa de cultura de 90 milímetros gelada e encha uma placa de cultura de 35 milímetros com gelo.

Para colher o cérebro, use uma tesoura de dissecção para abrir o couro cabeludo de um camundongo macho de duas a seis semanas de idade e abrir a calvária ao longo da sutura sagital. Use uma pinça curva para remover o crânio até que todo o cérebro, incluindo os bulbos olfatórios, esteja visível e use uma espátula para retirar cuidadosamente o tecido cerebral intacto. Coloque o cérebro na placa de cultura de 35 milímetros e use uma pipeta Pasteur cheia de solução de fatia de sacarose para remover suavemente qualquer cabelo ou partículas de sangue do tecido.

Use a espátula para transferir o cérebro limpo para o pedaço de papel de filtro embebido e use uma lâmina para cortar o cérebro longitudinalmente ao meio. Coloque os dois hemisférios no lado medial recém-cortado e use a lâmina para fazer um corte paralelo na parte superior dorsal de cada hemisfério para remover a região dorsal de cada pedaço de cérebro. Coloque os dois hemisférios no lado dorsal recém-cortado com a parte ventral do cérebro voltada para cima e coloque uma gota de super cola em uma placa de amostra.

Use uma ponta de pipeta para espalhar a cola em uma área grande para acomodar os dois pedaços de tecido e toque um pedaço de tira de papel de filtro no lado ventral de um hemisfério. Use outra tira de papel de filtro para secar cuidadosamente o lado dorsal do cérebro e posicione o lado dorsal do hemisfério para baixo na cola na placa da amostra. Use duas tiras de papel de filtro adicionais para posicionar o segundo hemisfério na cola como acabamos de demonstrar e coloque a placa de amostra na câmara de fatiamento.

Em seguida, cubra o prato com uma solução de fatia de sacarose com alto teor de sacarose gelada. Para adquirir seções do tecido cerebral, posicione a lâmina do vibratomo na frente do lado medial dos hemisférios e levante a mesa do vibratomo de modo que a lâmina fique na mesma altura dos lados ventrais dos hemisférios, que agora estão voltados para cima. Use o controle do vibratomo para abaixar a lâmina 600 mícrons mais na direção dorsal e corte o tecido até que as duas primeiras fatias estejam completamente separadas dos dois hemisférios.

Quando as duas primeiras fatias de tecido forem obtidas, inverta a direção de corte e abaixe a lâmina mais 300 mícrons antes de cortar novamente. Quando o hipocampo se tornar visível, use uma pipeta de plástico Pasteur alargada para coletar e transferir as fatias para a câmara de recuperação no banho-maria. Deixe as fatias na câmara de recuperação cheia de ACSF por uma hora e, em seguida, coloque a câmara de recuperação em temperatura ambiente por 30 minutos antes de realizar registros eletrofisiológicos das amostras de tecido.

Aqui, podem ser observados registros representativos de potencial pós-sináptico excitatório de campo negativo e positivo de fatias de baixa e alta qualidade, respectivamente. O traço de exemplo negativo exibe uma grande amplitude de voleio de fibra após a despolarização das fibras neuronais estimuladas que é ainda maior do que a amplitude real de fEPSP, enquanto o traço de alta qualidade demonstra uma pequena proporção de voleio de fibra para fEPSP e uma alta amplitude de fEPSP. A viabilidade de uma fatia de cérebro também pode ser analisada traçando inclinações de potencial pós-sináptico excitatório de campo versus as amplitudes de voleio de fibra.

As curvas de entrada/saída que são normalmente usadas para determinar a qualidade do corte podem ser obtidas aplicando estímulos de corrente crescente ao fatia do cérebro e monitorando as respostas subsequentes do fEPSP. Devido às propriedades de condução abaixo do ideal do tecido cerebral mal preservado, fatias cerebrais de baixa qualidade demonstram curvas de entrada/saída reduzidas. Fatias cerebrais viáveis têm linhas de base de transmissão sináptica estáveis, enquanto fatias cerebrais com uma linha de base instável não podem ser usadas para protocolos de condicionamento adicionais para estudar a plasticidade sináptica dos circuitos cerebrais.

Os registros de linha de base do fEPSP também podem ser úteis para monitorar os efeitos das drogas na própria transmissão sináptica. Além disso, as fatias de cérebro podem ser usadas em combinação com um indicador de cálcio para adquirir registros de imagem de fluorescência e estudar influxos de cálcio sob diferentes condições ou tratamentos de fatia. Certifique-se de que a dissecção cerebral seja realizada em não mais de 1,5 minutos após o sacrifício e isso ainda garante que o tecido cerebral fique apenas brevemente sem resfriamento e suprimento de oxigênio.

As fatias do cérebro do hipocampo têm muitas aplicações diferentes, desde técnicas de biologia molecular até eletrofisiologia. Este procedimento facilita as intensas investigações da anatomia do hipocampo e dos processos neurológicos.