Abordagens de espectrometria de massa de eletroforese capilar para caracterização da proteína e corona metabólica adquirida por nanomateriais

Este protocolo é o primeiro a implementar o CESI-MS para a caracterização não apenas da coroa da proteína, mas também da coroa do metabólito dos nanomateriais. O CESI oferece uma separação ortogonal aos métodos tradicionais de LCMS, que é altamente reprodutível e sensível usando apenas alguns nanolitros de amostra. Para começar, divida dois mililitros do plasma humano em alíquotas de um mililitro, uma para o metabólito e a coroa da proteína e outra para a caracterização do metaboloma plasmático.

Incube um miligrama por mililitro de nanomateriais no plasma humano por uma hora a 37 graus Celsius, misturando suavemente a 500 rotações por minuto em um misturador térmico. Em seguida, peletizar os nanomateriais centrifugando a 4.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante plasmático para análise do metabólito corona e retenha o complexo corona da proteína nanomaterial para caracterização da corona da proteína.

Ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão PBS 10X e vortex vigorosamente por dois minutos para remover as proteínas não ligadas. Centrifugar a solução a 4 000 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius para granular os nanomateriais e, em seguida, remover o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o sedimento. Ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão ABC e vortex vigorosamente por dois minutos para remover proteínas e sais não ligados.

Repetir a etapa de centrifugação e rejeitar o sobrenadante. Dissolva o pellet em 20 microlitros de tampão ABC contendo 10 milimolares de ditiotreitol para reduzir as ligações dissulfeto de proteína. Incubar a solução durante 30 minutos a 56 graus Celsius.

Adicione dois microgramas de tripsina de grau de sequenciamento aos 20 microlitros de tampão ABC contendo 0,1% de surfactante e incube a solução de digestão a 37 graus Celsius por 16 horas. Alquilar a amostra adicionando 20 microlitros de iodoacetamida 55 milimolares em 100 milimolares ABC e incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. Adicione 20 microlitros de ácido clorídrico 0,1 molar para clivar o surfactante e deixe a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente.

Enriqueça e dessalinize os peptídeos usando uma ponta de pipeta de dessalinização embalada com C18, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, liofilize a amostra e armazene-a a 20 graus Celsius negativos até a análise. Pegue o plasma de controle e o sobrenadante da incubação do plasma do nanomaterial e coloque-os no gelo.

Alíquota de 50 microlitros de cada amostra em frascos separados e diluir dez vezes com água destilada. Após o vórtice, mova 50 microlitros desta amostra diluída para novos frascos. Adicione 200 microlitros de clorofórmio, 250 microlitros de metanol e 350 microlitros de água destilada e vortex vigorosamente por dois minutos.

Centrifugue a 20.800 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Pegue 500 microlitros do sobrenadante e filtre-o através de um filtro centrífugo de três quilodalton por duas horas a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius. Seque 430 microlitros do ultrafiltrado em um aspirador rápido e congele a amostra.

Antes da instalação dos capilares no instrumento CESI, verifique se as extremidades de entrada e saída dos capilares estão intactas e se não há quebras visíveis no capilar. Em seguida, coloque um novo capilar codificado neutro no instrumento, seguindo as diretrizes do fabricante. Lave o capilar de separação para frente com ácido clorídrico 100 milimolar, depois com BGE e, finalmente, com água destilada, usando as condições descritas no manuscrito do texto.

Em seguida, lave a separação e o capilar condutor com BGE, seguido de água destilada, ácido clorídrico 100 milimolar, água destilada novamente e, finalmente, com BGE. Acople o CESI ao MS usando a fonte de nano spray e o adaptador. Para análise de corona de proteína, ressuspenda as amostras liofilizadas em 20 microlitros de acetato de amônio 50 milimolar em pH quatro.

Realize a análise CESI-MS para as amostras conforme descrito no manuscrito do texto. Colete dados de espectros de massa entre 250 e 2.000 m/z, com aquisição de fragmentação dependente dos 10 principais dados e enxágue o capilar entre as amostras. Coloque um novo capilar de sílica fundida nua no instrumento CESI.

Lave o capilar de separação na direção direta usando 100% de metanol e, em seguida, lave o capilar de separação e o capilar condutor com BGE para garantir a formação de gotículas nas extremidades de saída. Em seguida, lave o capilar com água destilada, seguida de hidróxido de sódio 0,1 molar, água destilada novamente e, finalmente, com BGE. Acople o CESI ao SEMS usando a fonte de nano spray e o adaptador.

Para realizar a análise do metabólito corona, ressuspenda as amostras de plasma expostas e não expostas do nanomaterial em 430 microlitros de água destilada e vore vigorosamente por dois minutos. Filtrar as amostras através de um filtro de membrana de 0,1 micrómetro. Adicione cinco microlitros dos padrões internos, conforme mencionado no manuscrito do texto, a 95 microlitros do filtrado e vórtice vigorosamente.

Centrífuga a 16, 100 vezes G e quatro graus Celsius. Realize a análise CESI-MS para as amostras conforme descrito no manuscrito do texto. O uso de CESI-MS para separação e detecção proteômica e metabolômica demonstra boas janelas de separação em ambos os capilares para cada abordagem, permitindo uma caracterização abrangente da coroa biomolecular.

O método proteómico CESI-MS é capaz de distinguir entre um conjunto de proteínas e concentrações de proteínas na coroa através de uma vasta gama de composições de nanomateriais, e pode distinguir uma coroa proteica única para cada nanomaterial. Esta abordagem metabolômica CESI-MS permite uma análise quantitativa da coroa do metabólito e pode ser usada para descobrir suas impressões digitais exclusivas. Embora essa abordagem caracterize passivamente o metabólito corona do nanomaterial, ela ainda é capaz de descobrir insights interessantes sobre o papel dos metabólitos na coroa biomolecular, como a absorção diferencial de isômeros.

Essa técnica permite caracterizar tanto a proteína quanto o metabólito corona, permitindo uma melhor compreensão de como a coroa biomolecular completa afeta a absorção de nanomateriais pelas células.