Caracterização espectroscópica UV-Vis de nanomateriais na mídia aquosa
25 de outubro de 2021
Este estudo apresenta os resultados de benchmarking para uma comparação interlaboratória (ILC) projetada para testar o procedimento operacional padrão (SOP) desenvolvido para dispersões coloidas de ouro (Au) caracterizadas por Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis), entre seis parceiros do projeto H2020 ACEnano para preparação, medição e análise dos resultados.
A espectrofotometria UV-Vis é uma técnica bem estabelecida, fácil de usar e barata para medir o tamanho, concentração, estado de agregação e índice refrativo de nanomateriais. O UV-Vis fornece triagem não invasiva e rápida e rápida e em tempo real e avaliação de características nanomateriais usando medidas simples de absorção. UV-Vis é excepcionalmente simples.
As amostras requerem pouca preparação, e o software tem poucas variáveis e é fácil de usar. Ligue o espectrômetro UV-Vis por pelo menos 20 minutos para permitir que a lâmpada aqueça. Carregue o software e selecione Conectar o instrumento Selecione a opção Varredura de espectro na janela do modo que exibe os modos de operação.
No software, clique em Instrumento e vá para Configurações na barra de comando, selecione Parâmetros para Varredura de Espectro e ajuste as configurações para medição. Vá para a guia Instrumento e selecione ABS para Modo de dados e largura de fenda de 1,5. Vá para a guia Varredura do comprimento de onda e defina um comprimento de onda Start de 680 nanômetros, comprimento de onda final de 380 nanômetros e velocidade de varredura de 400 nanômetros por minuto.
Depois de definir os parâmetros, encha duas cucas com um mililitro de água ultra pura e coloque-as na referência e amostra do suporte celular para cobrir o caminho da luz. Feche a tampa do instrumento e continue com a calibração em branco selecionando em branco da barra de comando e selecione OK. Pegue uma subsample de 500 microliteres de cada amostra de nanopartículas de ouro, e prepare uma diluição com 500 microliters de água ultrapura. Coloque as diluições em cuvetas de um mililitro com uma concentração final de 25 microgramas por mililitro.
Executar uma calibração em branco. Após a calibração em branco, substitua uma das cuvetas em branco no suporte da célula amostra por uma amostra de nanopartículas de ouro, mantendo a cuvette de referência intocada. Selecione medida Inicie na barra de comando para executar a varredura.
Execute três varreduras de espectro para cada amostra de nanopartículas de ouro diluída e amostra desconhecida. Extrair os dados experimentais brutos para cada medição em um arquivo compatível com planilha. Selecione Propriedade na digitalização, na barra de comando, vá para a guia Imprimir/Exportar, clique em Dados, Espectro e parâmetros e pressione OK. Clique em Salvar na barra de comando e salve os dados como um arquivo XLS.
Observe o comprimento máximo de onda de absorção e lambda para cada uma das leituras e grave-as no modelo fornecido. Plote uma curva de calibração com a média de lambda máxima contra tamanho de nanopartículas selecionando dados, inserir gráfico, gráfico de dispersão, adicionar linha de tendência e curva polinomial. Para incluir a equação polinomial para a curva de calibração, selecione opções de Linha de Tendência e escrúba no gráfico da barra de comando.
Finalmente, calcule o tamanho da amostra de nanopartículas de ouro desconhecida isolando a equação polinomial da curva de calibração para se encaixar no valor médio para a lambda máxima desconhecida usando uma derivação da fórmula quadrática. Entre os seis laboratórios, o comprimento de onda máximo apresentou repetibilidade próxima, enquanto os resultados máximos de absorção apresentaram uma gama mais dispersa de valores de dados para diferentes tamanhos de nanopartículas de ouro. As faixas e os meios gerais para cada tamanho de nanopartículas de ouro são mostrados aqui.
O valor máximo de pontuação Z para lambda max foi relatado por laboratório três para as nanopartículas do tamanho de 5 nanômetros, e o maior escore z para absorção máxima foi relatado por laboratório para nanopartículas do tamanho de 40 nanômetros. A maioria dos parceiros calculou o tamanho da nanopartícula desconhecida de 76 a 80 nanômetros, com cinco laboratórios relatando um tamanho maior de 109 nanômetros. Os escores Z para tamanhos desconhecidos foram calculados entre menos 0,25 e menos 0,56 para todos os laboratórios, com a única exceção relatada pelo laboratório cinco, que apresentou o maior escore Z positivo de 2,03.
Certifique-se de que os parâmetros e configurações foram ajustados corretamente. As amostras diluídas devem ser preparadas frescas antes da medição com o UV-Vis. O UV-Vis pode ser facilmente combinado com outras ferramentas, como TEM, DLS e AFM para medir uma grande variedade de atributos se os usuários quiserem caracterizar sua amostra de forma mais abrangente.
Visão Geral
Este estudo estabelece como referência uma comparação interlaboratorial (ILC) para avaliar o procedimento operacional padrão (SOP) para dispersões coloidais de ouro (Au) utilizando espectroscopia UV-Vis. Seis parceiros do projeto H2020 ACEnano participaram do estudo, concentrando-se na preparação de amostras, medição e análise dos resultados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Nanomateriais
- Química Analítica
- Comparações Interlaboratoriais
Antecedentes
- A espectrofotometria UV-Vis é uma técnica amplamente utilizada para caracterizar nanomateriais.
- O método é não invasivo e permite a avaliação em tempo real das características da amostra.
- Mensurações simples de absorção fornecem informações sobre tamanho, concentração e estado de agregação.
- Procedimentos operacionais padrão são essenciais para obter resultados consistentes entre laboratórios.
Objetivo do Estudo
- Comparar o Padrão Operacional Padrão (POP) para dispersões de coloides de ouro entre múltiplos laboratórios.
- Avaliar a repetibilidade e a confiabilidade das medições por UV-Vis.
- Analisar os resultados e identificar discrepâncias nas medições de tamanho de nanopartículas.
Métodos Utilizados
- Preparação de amostras de nanopartículas de ouro e suas diluições.
- Calibração do espectrômetro UV-Vis e medições do branco.
- Realização de múltiplas varreduras espectrais para cada amostra.
- Extração e análise de dados para determinar os tamanhos das nanopartículas.
Resultados Principais
- Alta repetibilidade nas medições de comprimento de onda máximo entre laboratórios.
- Variabilidade nos resultados de absorbância máxima para diferentes tamanhos de nanopartículas.
- A maioria dos laboratórios estimou tamanhos de nanopartículas desconhecidas entre 76 e 80 nanômetros.
- O laboratório cinco relatou um valor discrepante de 109 nanômetros.
Conclusões
- O estudo destaca a importância de procedimentos padronizados para medições no UV-Vis.
- Discrepâncias nos dados de absorbância sugerem a necessidade de investigação adicional.
- A colaboração entre laboratórios pode aumentar a precisão e a confiabilidade das medições.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A espectroscopia UV-Vis permite a triagem rápida e não invasiva do tamanho, concentração e estado de agregação de nanomateriais, auxiliando a caracterização físico-química inicial no desenvolvimento de nanomedicamentos. Protocolos padronizados melhoram a reprodutibilidade entre laboratórios, reduzindo a variabilidade na avaliação pré-clínica de nanomateriais. Isso aumenta a confiança preditiva na seleção de candidatos promissores e reduz os riscos associados ao comportamento inconsistente de nanomateriais em sistemas biológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar as propriedades físico-químicas de nanomateriais que influenciam interações biológicas e o engajamento com alvos.
- Valor Operacional: Fornece uma avaliação inicial rápida e de baixo custo para priorizar candidatos a nanomateriais para avaliação adicional.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de absorção adequados para estabelecer curvas de calibração e relações entre tamanho e concentração.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio de faixas definidas de comprimento de onda, velocidades de varredura e larguras de fenda para medições consistentes.
- Valor Estratégico: Facilita a preparação para triagem em alta produtividade, permitindo o monitoramento em tempo real de agregação e estabilidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece métricas repetíveis de tamanho e agregação essenciais para correlacionar as propriedades de nanomateriais com resultados de eficácia e toxicidade pré-clínicos.
- Valor Operacional: Permite a comparação de dados entre laboratórios quando os POPs são seguidos, apoiando estudos pré-clínicos multicêntricos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A caracterização por UV-Vis insere-se na sequência de descobertas que vai da síntese inicial de nanomateriais até a avaliação pré-clínica, especialmente quando integrada a técnicas ortogonais como MET ou DLS para uma análise abrangente.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre como o tamanho e a agregação afetam a captação celular e a ligação ao alvo.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios ao fornecer feedback rápido e em tempo real sobre a estabilidade de nanomateriais durante a incubação com compostos.
- Análises: Fornece valores de lambda máximo e absorbância que permitem estimar o tamanho e o estado de agregação por meio de curvas de calibração.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao oferecer um método padronizado para acompanhar as propriedades de nanomateriais em diferentes condições de formulação e armazenamento.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade escalável e reutilizável de controle de qualidade de nanomateriais em todas as fases de descoberta e desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no comportamento de nanomateriais ao reduzir a ambiguidade mecanicista decorrente de amostras mal caracterizadas.
- Valor Operacional: Promove padronização, reprodutibilidade e escalabilidade entre laboratórios e projetos.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer dados físico-químicos confiáveis no início do desenvolvimento.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base em perfis consistentes de tamanho e agregação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em espectrofotometria e manipulação de nanomateriais para garantir a preparação adequada das amostras e a calibração correta do instrumento.
- Depende da estabilidade da fonte de luz e da precisão do comprimento de onda, exigindo aquecimento regular do equipamento e manutenção periódica.
- Exige acordo entre as equipes sobre os procedimentos operacionais padrão (POPs) para fatores de diluição, seleção de cubetas e formatos de exportação de dados, a fim de assegurar comparabilidade.
- Deve levar em conta as limitações na detecção de nanomateriais com tamanho inferior a 5 nm ou em matrizes biológicas complexas sem purificação prévia.
- Beneficia-se da integração com técnicas complementares (por exemplo, MET, DLS) para uma caracterização físico-química completa quando a espectrofotometria UV-Vis isoladamente for insuficiente.
