Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

Espera-se que os protocolos aqui descritos facilitem estudos futuros sobre defeitos oligodendrogliais, na patogênese da neurodegeneração. Este é um método aprimorado que pode ser usado para gerar células funcionais de linhagem de oligodendrócitos humanos em apenas três a quatro semanas e estabelecer um sistema de co-cultura para modelar as conexões de oligodendrócitos de neurônios. O protocolo pode ser usado para estudar não apenas a doença de Alzheimer, mas qualquer outro aspecto associado à doença das interações dos neurônios oligodendrócitos.

Para começar, coloque aproximadamente um milhão de células HEK293T em cada frasco T75 para atingir 40% de confluência e, em seguida, transfecte-as com plasmídeos que expressam NGN2 induzível por tetraciclina e gene transativador de tetraciclina resistente à puromicina, juntamente com os três plasmídeos auxiliares. Use PEI para transfecção. Altere a mídia após 16 horas.

A Harvest liberou partículas virais coletando meios de cultura todos os dias e substituindo-os por meios frescos por três dias. Agrupe os meios coletados para purificação, filtre o vírus através de um filtro de 0,22 micrômetro e centrifugue a 49.000 vezes G por 90 minutos. Após centrifugação, ressuspenda o pellet no volume apropriado de glicose PBS.

Use células ES humanas H1 disponíveis comercialmente para realizar a indução de neurônios. Cultive as células em placas de 6 poços revestidas com solução de matriz extracelular com meio de manutenção ESL e incube as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Dois dias antes da indução da diferenciação, desprenda as células ES adicionando um mililitro de solução de descolamento celular e incubando em temperatura ambiente por 10 minutos.

Transfira as células para um tubo, depois lave o poço com dois mililitros de meio e adicione-o ao mesmo tubo. Centrifugar as células a 300 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, ressuspenda o pellet no meio e coloque as células em placas de 6 poços revestidas com matriz na densidade de assentamento de um vezes 10 elevado à quinta célula por poço.

No dia seguinte, adicione lentivírus, expressando NGN2 mais puro. R e transativador de tetraciclina junto com polibreno em meio de manutenção de células ES frescas. No dia zero, adicionar dois microgramas por mililitro de doxiciclina em meio DMEM/F-12 suplementado com N2 e sem morfógenos.

No primeiro dia, adicione puromicina em DMEM / F-12 fresco, mais N2 e doxiciclina até a concentração final de um micrograma por mililitro. Selecione as células transduzidas em puromicina por pelo menos 24 horas. No segundo dia, retire os neurônios diferenciadores com solução de descolamento celular e coloque-os novamente em placas de 24 poços revestidas com solução de matriz.

Mantenha-os em meio MBA B27 sem doxiciclina. Cultura de neurônios puros induzidos nas placas, revestidos com soluções baseadas em matriz extracelular. Para realizar a geração de células progenitoras neurais, cultive células ES humanas H1 e transdiferencie-as em células progenitoras neurais, conforme descrito no manuscrito do texto.

No dia negativo, semeie de 0,5 a um milhão de células em meio de manutenção de células ES em cada poço de uma placa de 6 poços revestida com solução de matriz reduzida por fator de crescimento. No dia zero, trate as células por 24 horas com meio de manutenção de células ES suplementado com 2% de DMSO. Do primeiro ao sexto dia, troque o meio completo por meio de indução neural quente contendo alguns inibidores de adição de um kit comercial.

No sétimo dia, passe os NPCs usando solução de desprendimento de células e coloque-os em uma densidade de assento de uma a duas vezes 10 elevado ao quinto poço por poço de uma placa de 24 poços. Avaliar a eficiência de diferenciação por coloração imuno-histoquímica para ausência de marcador de pluripotência e presença de marcadores NPC. Para gerar as células precursoras de oligodendrócitos, coloque os NPCs em meio de indução neural quente com alguns inibidores de adição de um kit comercial.

No oitavo dia, prepare uma solução de 1% de DMSO no meio de diferenciação OPC e trate os NPCs plaqueados por 24 horas. No nono dia, substitua o meio por meio de diferenciação OPC novo sem DMSO e, em seguida, alimente as células em dias alternados até o dia 15. Se as células atingirem a confluência antes do dia 15, passe-as para a densidade de assentos de uma a duas vezes 10 elevado à quinta célula por poço.

No dia 14, coloque OPCs em meio de diferenciação OPC a uma densidade de uma a duas vezes 10 elevado à quinta célula por poço, em uma placa de 24 poços. Testar células para a presença de marcadores específicos de OPC por coloração IHC ou qPCR e para a ausência de marcadores NPC. No dia 15, substitua o meio por meio de maturação OL.

Mude o meio a cada dois dias ou todos os dias. Quando as células atingirem 90% de confluência, divida-as em uma proporção de um para três por até duas passagens ou até que a divisão celular diminua substancialmente. Se os OPCs se dividirem muito rápido e atingirem a confluência em menos de três dias, adicione Ara-C a uma concentração de dois a cinco micromolares por um a três dias.

No dia 14, coloque as IOPCs em uma densidade de uma vezes 10 elevado a quinta células por poço em uma placa de 24 poços em meio de diferenciação OPC. No dia seguinte, desconecte os neurônios humanos induzidos com solução de descolamento celular. Adicione neurônios aos OPCs cultivados, plaqueando na densidade de assentos de duas vezes 10 elevado ao quinto células por poço.

Use meio de co-cultura contendo meio neurobasal A, suplemento de 2% de B27 e 100 nanogramas por mililitro de triiodotironina T3. Mude o meio no dia seguinte e depois em dias alternados. Se os OPCs proliferarem muito rápido e atingirem a confluência em menos de três dias, adicione dois a cinco Ara-C micromolares.

É importante que as células-tronco pluripotentes humanas iniciais exibam um alto grau de pluripotência para a geração bem-sucedida de neurônios induzidos, ou OPCs e oligodendrócitos. Portanto, as células devem ser coradas para marcadores específicos, como OCT-4 e SOX2, antes de iniciar qualquer um dos protocolos de indução. Células H1 humanas foram usadas para obter neurônios excitatórios induzidos do prosencéfalo.

Neurônios puros em cultura começaram a expressar sinapses em um no dia 14 a 16. As IOPCs foram geradas em duas semanas e os oligodendrócitos maduros em quatro a cinco semanas. O tratamento com DMSO enriqueceu o número de células na fase inicial do G1 para uma melhor integração de sinalização.

Marcadores específicos de OPC foram detectados duas semanas após o plaqueamento das células ES H1. A população IOPC em duas semanas foi bastante homogênea, com mais de 95% das células positivas para coloração 04 e um alto nível de imunorreatividade para outros marcadores. Após o início da maturação dos oligodendrócitos, marcadores específicos de oligodendrócitos foram detectados a partir do dia 28.

As densidades ideais de plaqueamento para neurônios induzidos e IOPCs precisam ser determinadas com uma série de titulações de número de células para obter a diferenciação adequada. Após quatro semanas, em co-culturas, as IOPCs devem ser adequadamente diferenciadas em oligodendrócitos positivos para marcadores específicos, como a MBP. Este sistema de co-cultura pode aumentar de forma robusta o número de sinapses, indicando que as IOPCs fornecem um suporte neuronal por meio do contato físico ou liberação de fatores tróficos.

Este procedimento descrito pode ser ainda mais sofisticado adicionando diferentes tipos de células cerebrais. Por exemplo, células-tronco derivaram astrócitos humanos para modelar novos aspectos das interações gliais dos neurônios na saúde e na doença.