Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

O modelo de epiderme humana in vitro ou construído foi desenvolvido pela primeira vez na década de noventa com o objetivo principal de desenvolver métodos alternativos de teste para experimentação animal. Esses modelos epidérmicos 3D são agora comumente usados para testar tanto a segurança quanto a eficácia dos ingredientes cosméticos. Considerando que pode ser comprado de vários fornecedores de tecidos, poder reconstituir um modelo 3D em laboratório dá mais flexibilidade ao ponto final de interesse.

Existem vários artigos de pesquisa descrevendo brevemente o protocolo de reconstituição de um modelo epidérmico 3D, mas não havia, até o momento, nenhum vídeo disponível mostrando as etapas críticas do processo de reconstituição. Esta é a razão por trás da publicação deste vídeo. A preparação de epiderme humana reconstruída internamente permite muita liberdade no processo de cultivo, como alterações na composição média da cultura, gatilhos de estresse pró-inflamatório ou oxidativo, silenciamento de genes de interesse e inibição ou estimulação de certos processos biológicos.

Para começar, descongele um frasco com 1 milhão de queratinócitos epidérmicos normais preservados por crio-preservados, ou NHEKs, em um banho de água a 37 graus Celsius submergindo parte do frasco na água. Incubar o frasco por um a dois minutos no banho de água, até que apenas uma pequena lasca de gelo seja visível. Resuspenda as células com muito cuidado, encanar para cima e para baixo duas a três vezes.

Transfira a suspensão da célula em dois frascos T75 contendo um total de 15 mililitros de meio de descongelamento pré-avisado, resultando em uma densidade de semeadura de 6,7 vezes 10 para as quartas células por centímetro quadrado. Pré-encha 24 placas de poço com 1,5 mililitros de meio submerso, idealmente usando uma pipeta dispensadora. Após a cultura das células até 80%, elas estão prontas para semeadura em pastilhas para o cultivo de epiderme humana reconstruída, ou RHEs.

Remova o meio basal dos frascos T75 com os NHEKs. Enxágüe as células adicionando cinco mililitros de PBS pré-aquecidos a cada frasco T75 e, em seguida, remova o PBS dos frascos. Adicione dois a três mililitros de 0,05% trypsin-EDTA pré-aquecidos a cada frasco, certificando-se de que a solução de trippsina seja igualmente distribuída na área de cultura celular do frasco.

Coloque os frascos na incubadora de cultura celular por quatro minutos e verifique se as células se desprendem usando o microscópio em uma ampliação de 10 X. Rap o frasco para ajudar as células a se libertarem da superfície do frasco. Uma vez que todas as células são separadas, adicione um volume igual de inibidor de trippsina pré-aquecido a cada frasco T75, e transfira a suspensão celular dos frascos para um tubo de centrífuga.

Enxágüe os frascos com cinco mililitros de PBS pré-aquecidos e transfira-os para o tubo de centrífuga contendo a suspensão celular. Centrifugar as células colhidas a 400 vezes G por cinco minutos. Descarte cuidadosamente a maioria dos supernasceres deixando aproximadamente 100 a 200 microliters no tubo.

Gire suavemente o tubo com os dedos para soltar cuidadosamente a pelota. Levemente resuspenque a pelota das células em um baixo volume de meio submerso, pipetando para cima e para baixo 5 a 10 vezes para garantir uma suspensão uniforme da célula. Comece com um volume baixo para evitar a formação de agregados celulares, e adicione até um mililitro de meio submerso por frasco T75 inicial.

Conte as células na suspensão usando o método de exclusão azul trypan. Diluir a suspensão celular com meio submerso adicional para atingir uma concentração de 3.525 vezes 10 para as quintas células por mililitro, usando a primeira equação fornecida no manuscrito do texto. Realize uma segunda contagem celular da solução diluída e use a segunda equação no manuscrito do texto para calcular o volume de suspensão celular a ser semeado na inserção de cultura.

Pendure as 24 inserções de cultura de poço na posição mais alta da placa portadora, e transfira a placa portadora para a placa de 24 poços pré-preenchida com meio submerso. Adicione o volume determinado da suspensão da célula a cada inserção, tomando cuidado para não tocar na inserção. Após a semeadura, incubar as 24 placas do poço por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente para superar um efeito de borda.

Não mova as placas durante este tempo. Transfira as placas para a incubadora de cultura celular, e deixe-as em condições submersas por três dias. Após uma incubação de três dias na incubadora de cultura celular, exponha as células que aderiram à superfície da membrana à interface líquida do ar, ou ALI, removendo o meio submerso do compartimento apical com um sistema de aspiração e uma pipeta Pasteur de vidro.

Encha novas 24 placas de poço com 1,5 mililitros de meio ALI pré-aquecido fresco, e transfira as placas portadoras com as pastilhas de cultura para as novas placas multi-poço. Transfira as placas multi-poços de volta para a incubadora de cultura celular. Atualize o meio ALI a cada dois ou três dias, durante 14 dias.

Os queratinócitos na cultura 2D exibem uma morfologia tradicional com uma forma poligonal consistente. Após 15 dias na ALI, a epiderme humana reconstruída forma um tecido totalmente estratificado, que é indicado por suas quatro principais camadas epidérmicas. A análise ultraestrutural da epiderme humana reconstruída em diferentes pontos de tempo no protocolo de reconstituição revela o processo de cornificação, com um número aumentado de camadas de córneas ao longo do tempo.

Os queratinócitos na epiderme apresentam diferentes perfis de expressão proteica de acordo com seu estágio de diferenciação. A expressão involucrina aparece mais predominantemente na camada SG, enquanto a expressão de filaggrin e loricrin está localizada nas camadas superiores. A expressão queratina-10 foi encontrada em todas as camadas viáveis, exceto na camada SB.

A epiderme humana reconstruída exibe junções desmosômicas funcionais, como indicado pela expressão de Desmoglein-1 no espaço intercelular das camadas epidérmicas viáveis. As propriedades da barreira do modelo de epiderme reconstruída foram investigadas pela avaliação da viabilidade tecidual no tratamento tópico com um disruptor de barreira conhecido, e pela avaliação da integridade do tecido. A integridade do tecido foi determinada após 15 dias medindo o TEER com um voltímetro.

A resposta da epiderme ao Lipopolisacarídeo e ao Fator de Necrose Tumoral alfa foi investigada. Ambos os tratamentos alfa lps e TNF não eram tóxicos. em relação ao controle Triton X-100.

A liberação de Interleukin-1 alfa e Interleucina-8 no meio RHE foi quantificada por meio de il lysis. O tratamento lps resultou em um aumento estatisticamente significativo na liberação de Interleukin-1 alfa e Interleukin-8. O tratamento alfa TNF resultou em uma regulação estatisticamente significante na liberação de Interleukin-1 alfa.

No entanto, uma clara tendência de aumento dos níveis de Interleucina-8 também foi observada após a estimulação com TNF alfa. Seguindo este protocolo, o TEER pode ser medido como um valor para a integridade da barreira. A viabilidade ou citotoxicidade pode ser medida por um ensaio MTT ou LDH, por exemplo.

O supernante pode ser usado para medir a secreção de citocinas ou outras proteínas. Além disso, o tecido pode ser usado para estudar a expressão de proteínas ou genes de interesse.