Polarização de Células e Análises Derivadas de Monócitos Humanos M1 e M2 com Citometria de Fluxo sobre Infecção por Mycobacterium tuberculosis

Este protocolo oferece a oportunidade de acompanhar a polarização imune de células derivadas de monócitos humanos com base na visualização e caracterização profunda de Mtb marcado com proteína fluorescente verde em diversos subconjuntos de macrófagos usando citometria de fluxo de 10 cores. Isso representa um método eficiente e reprodutível para estudar as respostas à infecção por Mtb em macrófagos polarizados M1 ou M2, incluindo avaliação do fenótipo e função antes e depois da infecção. Para isolar o PBMC das camadas amareladas de doadores humanos, use uma pipeta para sobrepor lentamente 15 mililitros de sangue da camada leucocitária ao lado de um tubo de 50 mililitros em 15 mililitros de meio gradiente de densidade e separe as células por centrifugação.

Use uma pipeta Pasteur estéril para remover a camada superior de plasma e transfira cuidadosamente a camada de células mononucleares para um novo tubo de 50 mililitros. Adicione meio RPMI sem soro às células até um volume final de 50 mililitros e inverta suavemente o tubo algumas vezes antes de centrifugar. Em seguida, ressuspenda as células em 20 mililitros de meio sem soro para contagem.

Para iniciar a diferenciação de macrófagos, dilua as células para 5 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro de concentração de meio livre de soro e semeie dois mililitros de células em poços individuais de uma placa de seis poços. Coloque a placa na incubadora de cultura de células por duas a três horas para permitir que as células adiram ao fundo do poço. No final da incubação, lave os alvéolos três vezes com um mililitro de meio sem soro por lavagem e adicione dois mililitros de meio RPMI completo suplementado com 50 nanogramas por mililitro de GM-CSF ou 50 nanogramas por mililitro de M-CSF para diferenciação M1 ou M2, respectivamente, a cada poço de células aderentes.

Três dias após o início da polarização, substitua cuidadosamente um mililitro de sobrenadante de cada poço por um mililitro de meio completo fresco suplementado com os fatores de crescimento apropriados. No sexto dia de cultura, adicione 50 nanogramas por mililitro de interferon gama e 10 nanogramas por mililitro de LPS aos poços tratados com GM-CSF e 20 nanogramas por mililitro de IL-4 aos poços tratados com M-CSF. Verificar regularmente a morfologia das culturas de células derivadas de monócitos por microscopia de luz para garantir que os monócitos mais pequenos se diferenciam em células maiores semelhantes a macrófagos.

Para configurar uma cultura de Mtb, em uma instalação de nível III de biossegurança, misture uma alíquota de um mililitro de suspensão de bactérias descongeladas com nove mililitros de meio completo de TB em um tubo de tampa filtrada de 50 mililitros para uma incubação de 24 horas no tubo da incubadora de cultura de células. No dia seguinte, colete a bactéria por centrifugação e ressuspenda o pellet em 15 a 20 mililitros de meio completo de TB fresco em um novo tubo de cultura de tampa filtrada de 50 mililitros antes de retornar a bactéria à incubadora de cultura de células. Após sete a 10 dias de cultura, lave as bactérias duas vezes em 35 a 40 mililitros de tampão de lavagem estéril por lavagem, ressuspendendo as bactérias em um mililitro de meio RPMI sem soro após a segunda lavagem.

Adicione mais nove mililitros de meio RPMI sem soro às bactérias e sonice as bactérias em um sonicador em banho-maria em gabinete de biossegurança Classe II por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, medir a densidade óptica de um mililitro de suspensão bacteriana em um comprimento de onda de 600 nanômetros em um espectrofotômetro colocado dentro do gabinete de biossegurança. Para infectar as células derivadas de monócitos, dilua as bactérias para uma concentração de 5 vezes 10 elevado à 6ª colônia formando unidades por mililitro em meio livre de soro e substitua o sobrenadante em cada poço da placa de cultura de células de seis poços por um mililitro de meio fresco sem soro e um mililitro de suspensão de bactérias por poço para obter uma multiplicidade de infecção de cinco.

Após uma incubação de quatro horas na incubadora de cultura de células, lave cada poço três vezes com um mililitro de tampão de lavagem estéril por lavagem, inclinando a placa cuidadosamente para remover todo o volume de tampão dos cantos dos poços após cada lavagem. Em seguida, ressuspenda as células derivadas de monócitos infectadas por Mtb em dois mililitros de meio completo sem antibióticos. Para corar as células para citometria de fluxo, incube as células infectadas com um mililitro de tampão FACS suplementado com EDTA 0,5 milimolar por poço por pelo menos 30 minutos.

No final da incubação, colete as células destacadas com pipetagem suave e transfira as células para tubos de microcentrífuga individuais com tampa de rosca para centrifugação. Ressuspenda as células em aproximadamente 50 microlitros de coquetel de anticorpos anti-humanos conjugados com fluorocromo e corante de viabilidade de interesse e incube as células por 30 minutos a quatro graus Celsius protegidas da luz. Após a lavagem, fixe as células com 200 microlitros de tampão de fixação recém-preparado por 30 minutos em temperatura ambiente protegida da luz.

Após a fixação e lavagem, ressuspenda as células em 400 microlitros de tampão FACS e transfira as células para tubos de microcentrífuga de um mililitro. Para analisar as células, use contas de compensação para compensar o sinal fluorescente para cada anticorpo conjugado com fluorocromo no coquetel e use células não coradas para definir a porta para a população de células negativas. Em seguida, adquira um mínimo de 50.000 células por amostra.

As células derivadas de monócitos M1 e M2 exibem uma mudança vertical para uma granularidade mais alta e tamanho celular reduzido após a infecção por Mtb. Uma morte celular aumentada também é observada em células M1 e M2 infectadas por Mtb em uma multiplicidade de infecção de cinco em comparação com células M0 não infectadas. É importante notar que uma expressão substancialmente maior de Mtb GFP é observada em células M2 após quatro horas de infecção em comparação com células M1.

As células M1 e M2 não infectadas podem ser caracterizadas por sua co-expressão do receptor CD64 e CD86 ou CD200 e CD163, respectivamente. Após quatro horas de infecção por Mtb, um aumento da frequência de células positivas para receptores CD200 é observado nas células polarizadas M1 positivas para Mtb GFP, enquanto a expressão de CD163 é reduzida em células M2. A bactéria Mtb GFP também pode ser observada em células M1 CD64 positivas e células M2 CD163 positivas por microscopia confocal.

A análise UMAP revela que quatro horas de infecção por Mtb não são suficientes para afetar a polarização dos macrófagos, enquanto 24 horas de infecção resultam em aglomerados claramente separados de células M1 e M2 não infectadas e infectadas que expressam perfis distintos de expressão de marcadores de superfície. Além disso, a análise do PhenoGraph mostra que 24 clusters diferentes de tamanhos diferentes são distribuídos exclusivamente entre as células M1 e M2 não infectadas e infectadas por Mtb. A eficácia da polarização M1 ou M2 ou da infectividade do Mtb pode variar substancialmente entre os doadores humanos.

E, portanto, recomenda-se a inclusão de pelo menos dois doadores em cada experimento para reduzir as variações experimentais. Este modelo permite a avaliação simultânea de macrófagos humanos usando citometria de fluxo, microscopia confocal, análise de expressão de mRNA, ensaios multiplex de fatores solúveis e quantificação bacteriana usando expressão de GFP ou unidades formadoras de colônias.