Desenvolvimento e teste de ensaios quantitativos de PCR específicos para aplicações de DNA ambiental

Ensaios bem otimizados são vitais para a interpretação adequada dos dados de DNA ambiental. Este protocolo descreve as etapas de projeto e teste necessárias para desenvolver tal ensaio. Em geral, o DNA ambiental é um método não invasivo para detectar uma determinada espécie ou conjunto de espécies.

Pode reduzir custos e ser mais sensível em comparação com os métodos convencionais de pesquisa. Este método pode auxiliar na conservação e manejo da vida selvagem por meio da detecção de DNA de uma espécie de interesse, permitindo inferir potencialmente a presença dessa espécie na área amostrada. Devido à grande sensibilidade da PCR quantitativa, a contaminação pode acontecer facilmente, e controles negativos são necessários para identificar as etapas nas quais a contaminação foi introduzida.

O eDNA é um campo repleto de jargões e termos abreviados. Para aqueles que não têm experiência em biologia molecular ou qPCR, as demonstrações visuais podem ajudar no planejamento de um projeto experimental, desde a conceituação até a geração de dados. Demonstrando o procedimento estarão Dannise Ruiz Ramos, bióloga de nosso laboratório, e Trudi Frost, estudante auxiliar de laboratório.

Para começar, pesquise e baixe sequências de várias regiões de genes para espécies de interesse usando o banco de dados de nucleotídeos do NCBI. Selecione todas as sequências que correspondam às especificações e selecione Enviar para.Escolha Registro completo, Arquivo, Formato de download como GenBank ou FASTA e, em seguida, Criar arquivo. Essas sequências agora são salvas no computador.

Repita essas etapas para todas as espécies de interesse. Mantenha as sequências de cada região do gene em um arquivo separado, pois elas serão analisadas separadamente. Para alinhar as sequências de cada região do gene separadamente, importe os arquivos de sequência baixados para um programa de alinhamento de sequência, como o software Geneious Prime.

Crie pastas separadas para cada região do gene e selecione todas as sequências em uma pasta que contenha sequências de uma região do gene. Use a ferramenta Alinhamento múltiplo para criar um alinhamento de nucleotídeos, como Geneious ou MUSCLE das sequências selecionadas. Escolha regiões promissoras para o projeto do ensaio por meio da visualização de dados de sequência alinhados.

Selecione uma região que tenha muitos dados de sequência disponíveis para as espécies de interesse, seja altamente divergente entre as espécies e mostre baixa variação dentro das espécies. Em seguida, projete os primers e a sonda do ensaio. Use o software de design de ensaio qPCR para projetar cinco conjuntos de ensaios qPCR.

Cole a sequência selecionada na caixa Entrada de Sequência. Se o alinhamento criou espaços, exclua-os da sequência. Selecione a sonda de primers qPCR 2 na opção Escolha seu design e baixe os ensaios recomendados.

Copie as sequências do primer direto do primeiro ensaio e procure essa sequência de primer no alinhamento criado anteriormente. Se estiver usando o Geneious Prime, use a ferramenta Annotate Predict para adicionar a região do primer ao alinhamento. Faça isso para todas as combinações de primer e sonda.

Inspecione essas regiões do alinhamento quanto a variações dentro das espécies-alvo, bem como dentro das espécies co-ocorrentes. Teste primers in silico através do Primer-BLAST do NCBI. Cole os primers na caixa use meu próprio primer em Parâmetros do primer.

Nas opções Parâmetros de verificação de especificidade do par de primers, selecione NR como o banco de dados e digite a ordem taxonômica ou a família do organismo de interesse na caixa Organismo. Certifique-se de que os primers selecionados não são suscetíveis de amplificar espécies não-alvo. Teste a eficiência do ensaio in vitro criando uma curva padrão e determine a eficiência da curva e a faixa linear.

Teste pelo menos seis diluições de dez vezes de um padrão de DNA sintético contendo a sequência alvo, em aproximadamente um a um milhão de cópias por reação. Use o software qPCR para traçar o valor CQ de cada padrão no eixo Y e a base logarítmica 10 da concentração padrão inicial em cópias por reação no eixo X. O software qPCR deve executar automaticamente uma regressão linear.

Calcule a eficiência a partir da inclinação da regressão. Inspecione visualmente a curva padrão quanto a viés ou baixo desempenho, conforme medido pela eficiência e valores de R ao quadrado. Use um controle positivo interno para testar a inibição de PCR de amostras de campo reais, o que pode levar a uma diminuição na sensibilidade e falsos negativos.

Determinar os limites de detecção e quantificação para cada ensaio. Teste ensaios com espécies não-alvo para verificar a especificidade e certifique-se de que o ensaio tenha um bom desempenho com um IPC multiplexado. Ensaios com boa sensibilidade, especificidade e eficiência podem passar para as próximas etapas.

Para realizar testes in situ do ensaio, obtenha várias amostras de água e processe-as para qPCR. Execute o ensaio de PCR quantitativo e compare a concentração de eDNA e a frequência de detecção com as diferenças conhecidas no local de ocorrência e abundância. Confirme todas as detecções por sequenciamento.

As sequências disponíveis de todas as espécies de Unionidae no rio Clinch foram baixadas e alinhadas. Depois de projetar vários ensaios, cinco conjuntos de primers e sonda foram adicionados ao alinhamento para avaliação visual. Os conjuntos de primer e sonda foram testados in silico e in vitro.

No laboratório, todos os ensaios foram testados usando extrações de DNA de 27 espécies disponíveis para verificar a especificidade. Um ensaio amplificou com sucesso apenas as espécies-alvo. Um ensaio bem-sucedido com boa eficiência e valores de R ao quadrado é mostrado aqui.

O LOD e o LOQ para o ensaio selecionado foram ambos de cinco cópias por reação. Em contraste, ensaios que produziram uma curva padrão com baixa eficiência foram descartados. Em uma qPCR de qualidade, as diluições padrão amplificam em valores de quantificação de ciclo uniformemente espaçados de aproximadamente 3,3 ciclos para cada diferença de dez vezes na concentração.

Em uma qPCR ruim, os padrões podem exibir variação desigual nos valores de quantificação do ciclo entre as diluições. A amplificação do IPC para amostras desconhecidas deve ser comparada com os resultados do IPC de controle do modelo negativo. Se nenhum inibidor estiver presente nas amostras, toda a amplificação de IPC deve ter um agrupamento apertado no gráfico, com valores de quantificação de ciclo quase iguais aos do controle sem modelo.

Para testes in situ do ensaio, os locais de localização incluíram o fundo do leito de mexilhões no riacho, o fundo do leito muscular perto da costa, 100 metros a jusante do leito no riacho, 500 metros a jusante do leito no riacho e 500 metros a jusante do leito perto da costa. Os ensaios quantitativos de PCR para DNA ambiental podem ajudar no monitoramento de espécies invasoras e ameaçadas de extinção, bem como melhorar nossa compreensão das mudanças espaciais e temporais na detecção de espécies sem ter que capturar fisicamente o organismo individual.