Engenharia de Genoma de Células B Humanas Primárias Usando CRISPR/Cas9
3 de novembro de 2020
Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para a engenharia do genoma baseada em CRISPR/Cas9 das células B humanas primárias para nocaute genético (KO) e knock-in (KI) para estudar funções biológicas de genes em células B e o desenvolvimento de terapêuticas de células B.
Este protocolo permite que os pesquisadores eliminem com precisão um gene nas células B, estudem os efeitos da perda de função desse gene ou insiram um gene trans para expressão estável do gene trans que pode ser usado para fins de pesquisa ou terapêuticos. A principal vantagem desse método é que ele fornece uma plataforma universal que possibilita a engenharia fácil e precisa de células B com alta eficiência. Este método pode ser usado para projetar células B para expressar anticorpos ou enzimas recombinantes e, em seguida, transferir essas células B para tratar infecções ou enzimopatias.
Para começar, descongele as células B em banho-maria a 37 graus Celsius. Enquanto espera, transfira dois mililitros de FBS pré-aquecido para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Assim que as células B estiverem completamente descongeladas, adicione imediatamente um mililitro de FBS pré-aquecido, gota a gota, na amostra.
Incube em temperatura ambiente por um minuto. Pipete suavemente para ressuspender a amostra e transfira todo o volume, gota a gota, para um tubo cônico contendo dois mililitros de FBS pré-aquecido. Aumente o volume para 15 mililitros com PBS estéril, tampe o tubo e inverta-o suavemente duas a três vezes.
Centrifugar a amostra a 400 vezes G durante cinco minutos e, em seguida, rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento da célula. Ressuspenda o pellet com um mililitro de meio de expansão de células B pré-equilibrado e conte as células. O número total de células deve ser de aproximadamente 10 elevado à sétima células.
Transferir as células para um frasco contendo 20 mililitros do meio de expansão de células B pré-equilibrado. A concentração final das células deve ser de aproximadamente cinco vezes 10 elevado a quinta células por mililitro. Incubar o frasco verticalmente numa incubadora de cultura de tecidos.
Prepare o substrato de transfecção CRISPR/Cas9 misturando um micrograma de sgRNA quimicamente modificado com 1,5 microgramas de mRNA de núcleo Cas9 de streptococcus pyogenes quimicamente modificado por reação de transfecção. Para controle, adicione um microlitro de tampão TE, em vez de sgRNA, em um tubo de 0,2 mililitro de uma tira de oito tubos. Ligue um eletroporador e prepare os reagentes de infecção nuclear.
Conte e transfira 1 milhão de células B por reação de transfecção, para um tubo cônico estéril. Aumente o volume para 15 mililitros com PBS estéril e centrifugue a 400 vezes G por cinco minutos. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante.
Ressuspender as células com 10 mililitros de PBS estéril e centrifugar a 400 vezes G durante cinco minutos, depois eliminar completamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Adicione 0,5 microgramas de mRNA GFP quimicamente modificado por 1 milhão de células B ao pellet celular. Ressuspenda o pellet com 20 microlitros de reagente de transfecção de células primárias por 1 milhão de células B e misture delicadamente pipetando cinco a seis vezes.
Transfira 20,5 microlitros por reação de transfecção para os tubos de 0,2 mililitro contendo o reagente CRISPR/Cas9. Pipete para cima e para baixo uma vez para misturar e transferir todo o volume para uma cubeta de transfecção. Tampe e bata suavemente a cubeta na bancada para garantir que o líquido cubra o fundo da cubeta.
Use o protocolo de células B primárias humanas no eletroporador para transfecção. Descansar as células eletroporadas na cubeta à temperatura ambiente durante 15 minutos. Em seguida, transfira 80 microlitros do meio de expansão de células B pré-equilibrado para a reação de transfecção na cubeta.
Coloque a cubeta na incubadora de cultura de tecidos por 30 minutos. Canalize suavemente a cabeça algumas vezes para misturar e transferir todo o volume da amostra da cubeta para um poço apropriado de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços contendo um mililitro do meio de expansão de células B. A concentração final das células deve ser de 1 milhão de células por mililitro.
Realizando um experimento de knock-in de gene, transfira o vetor viral tipo seis adeno associado recombinante a 500.000 multiplicidades de infecção para o poço apropriado contendo células eletroporadas. Coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade. No experimento knockout, a contagem de células B mostrou mais de 80% de células viáveis com uma ligeira redução na recuperação celular nas amostras controle e nocaute CD19 24 horas após a eletroporação.
As células B foram coletadas no quinto dia pós-transfecção para citometria de fluxo e análise de marés. Os gráficos de dispersão representativos das amostras controle e knockout mostraram 14 e 95% de células CD19 negativas, respectivamente, demonstrando uma redução significativa na expressão de CD19 nas amostras knockout. Os cromatogramas de sequenciamento genômico mostraram picos duplos nas células B knockout para CD19, indicando inserções ou deleções de nucleotídeos pós-quebras de fita dupla mediadas por CRISPR/Cas9.
A análise Indel dos cromatógrafos das amostras knockout mostrou uma alta porcentagem de formação de indel no locus CD19, o que é consistente com a porcentagem de perda de proteína CD19 detectada por citometria de fluxo. As células B do experimento knock-in foram coletadas no dia 12, após a engenharia. Os gráficos de dispersão mostraram 64% de células positivas para EGFP na amostra que recebeu o vetor viral tipo seis adeno associado recombinante, juntamente com RNP, enquanto nenhuma ou mínima positividade para EGFP foi observada nas amostras controle e somente vetor, respectivamente.
Uma amplificação por PCR de junção mostrou amplicons de 1,5 par de quilobases na amostra knock-in e nenhum produto de PCR foi observado na amostra de controle ou somente vetor. As contagens de células mostraram que o processo de engenharia afeta a recuperação celular na amostra knock-in mais do que as amostras de controle ou somente vetor. No entanto, todas as amostras se recuperaram rapidamente dentro de três dias após a engenharia.
Este procedimento também pode ser usado para introduzir agentes editores de base para alterar pares de bases simples, a fim de induzir ou corrigir mutações pontuais no genoma da célula B. Também pode ser usado para introduzir códons de parada prematura ou para alterar locais de splice, permitindo vários nocautes de genes sem o risco de translocações cromossômicas. Antes que essa técnica fosse desenvolvida, a engenharia de células B humanas inquiriria o uso de outras abordagens de engenharia genética mais desafiadoras.
Esta técnica é uma alternativa mais fácil, menos dispendiosa e mais rápida. Também poderia ser usado para sintetizar produtos de terapia celular para uso clínico.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo detalhado para engenharia genômica baseada em CRISPR/Cas9 em linfócitos B humanos primários, permitindo a interrupção e a inserção gênica para explorar funções gênicas e desenvolver terapêuticas baseadas em células B.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Genômica
- Biologia Celular
- Desenvolvimento Terapêutico
Antecedentes
- Importância do estudo da função gênica em linfócitos B
- Tecnologia CRISPR/Cas9 permitindo edições precisas
- Aplicações potenciais em doenças infecciosas e enzimopatias
Métodos Utilizados
- Transfecção de células B primárias com CRISPR/Cas9
- Células B humanas primárias como modelo biológico
- Eletroporação para entrega de ferramentas de edição gênica
Resultados Principais
- Eliminação bem-sucedida do gene CD19 com redução superior a 95% na expressão
- Altas taxas de formação de inserções e deleções no locus CD19 confirmadas por sequenciamento genômico
- Capaz de introduzir transgenes e editar pares de bases para estudos funcionais
Conclusões
- Este protocolo aprimora efetivamente o estudo da biologia e terapêutica de linfócitos B.
- Oferece uma plataforma robusta para edição gênica, com implicações significativas para a pesquisa médica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a engenharia genômica precisa de linfócitos B humanos primários utilizando CRISPR/Cas9, apoiando a validação de alvos e a expressão de proteínas terapêuticas. Ele fornece uma plataforma escalonável para o desenvolvimento de terapias baseadas em linfócitos B para doenças infecciosas e enzimopatias. O método aumenta a confiança preditiva em estudos de função gênica e reduz os riscos no avanço translacional.
Aplicações Estratégicas na P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação funcional dos efeitos da perda de função gênica em linfócitos B humanos primários.
- Valor Operacional: Possibilita a eliminação eficiente de genes endógenos para esclarecer vias biológicas e mecanismos.
- Valor Estratégico: Facilita a redução de riscos em alvos ao validar a essencialidade gênica em um modelo celular imune relevante para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera linfócitos B modificados com expressão estável de transgenes para leituras funcionais consistentes.
- Valor Operacional: Permite a produção em larga escala de anticorpos recombinantes ou enzimas para aplicações de triagem posteriores.
- Valor Estratégico: Fornece um sistema celular renovável para o desenvolvimento de ensaios direcionados às respostas imunes humorais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a avaliação pré-clínica de terapêuticas baseadas em linfócitos B por meio da integração estável e expressão de transgenes.
- Valor Operacional: Demonstra a cinética de recuperação após engenharia genética, fornecendo subsídios para cronogramas de dosagem e produção.
- Valor Estratégico: Permite o avanço com ajuste de risco ao associar edições gênicas a desfechos funcionais em um tipo celular clinicamente relevante.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao estágio inicial de descoberta para validação de alvos, avança para a identificação de compostos líderes por meio da expressão de transgenes e apoia trabalhos pré-clínicos por meio da engenharia funcional de células B.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses por meio da interrupção de genes de interesse em linfócitos B humanos primários.
- Triagem: Gera populações padronizadas e expansíveis de linfócitos B para avaliação consistente de compostos ou antígenos.
- Análises: Fornece resultados quantitativos, incluindo citometria de fluxo, sequenciamento genômico e PCR de junção para validação da edição.
- Pesquisa Translacional: Conecta a edição gênica ao potencial terapêutico por meio da expressão de anticorpos ou enzimas recombinantes.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para edição gênica iterativa em múltiplos alvos na terapia com linfócitos B.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Alta eficiência de edição com mais de 95% de eliminação do CD19 e taxas de inserção de 64%, permitindo estudos mecanicistas confiáveis.
- Valor Operacional: A entrega por eletroporação garante reprodutibilidade e escalabilidade entre reações de transfeção.
- Valor Estratégico: Reduz a dependência de abordagens complexas de engenharia genética, diminuindo os prazos e custos de desenvolvimento.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de prosseguimento ou interrupção do projeto ao fornecer dados funcionais sobre a essencialidade gênica e o rendimento de proteínas terapêuticas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de células primárias, eletroporação e preparação de reagentes CRISPR/Cas9.
- Depende do acesso a eletroporadores, reagentes de transfeção e infraestrutura para produção de vetores rAAV.
- Necessita protocolos padronizados para isolamento de células B, expansão e equilíbrio do meio entre diferentes equipes.
- Requer considerações de adaptação para diferentes alvos gênicos ou cassetes de transgênico em células B primárias.
- As limitações práticas incluem recuperação variável das células após a engenharia, embora as amostras normalmente se recuperem dentro de três dias.
