Name: Um modelo murino de lesão isquêmica da retina induzida pela oclusão da artéria da carótida comum bilateral transitória (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprenda a criar um modelo murino de isquemia retiniana por oclusão transitória bilateral da artéria carótida comum. Este método simplificado reduz o tempo cirúrgico e permite estudar retinopatias isquêmicas e triagem de fármacos in vivo.

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Este trabalho foi apoiado por Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 para Toshihide Kurihara e 20K18393 para Yukihiro Miwa) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT).

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina da Universidade keio.
1. Preparação de instrumentos cirúrgicos e animais
<ol><li>Autoclave instrumentos cirúrgicos e mantê-los em 70% de álcool etílico. Antes de cada novo procedimento cirúrgico, limpe os instrumentos cirúrgicos cuidadosamente utilizando 70% de álcool etílico.</li>
	<li>Prepare camundongos BALB/cAJc1 machos (6 semanas de idade, 26-28 kg) em uma sala específica-livre de patógenos (SPF) para manter condições estéreis antes, durante e depois da cirurgia.</li>
</ol>2. Oclusão da artéria carótida comum bilateral transitória (tBCCAO)
<ol><li>Coloque um rato sob anestesia por injeção intraperitoneal com uma combinação de midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) e tartarato butorphanol (50 μg/100 μL), denominado "MMB", como descrito anteriormente8,9. Segure as peles traseiras do mouse para manter o rato longe de bater os olhos até que o rato esteja completamente anestesiado.<ol>
<li>Julgue a profundidade da anestesia beliscando o dedo do mouse até que ele não tenha resposta, do qual o método é comumente usado para verificar anestesia completa10. NOTA: Geralmente, menos de 5 min são necessários para que os ratos durmam. Receitas adequadas para anestesia geral podem ser diferentes pelas instituições.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique uma gota de 0,1% purificada solução de olírio de hialuronato de sódio aos olhos para evitar o ressecamento nos olhos sob anestesia.</li>
	<li>Coloque o mouse de costas e conserte as patas do mouse usando fitas adesivas.</li>
	<li>Desinfete a área do pescoço do rato usando 70% de álcool etílico antes da cirurgia. NOTA: O recorte adicional da pele não foi realizado, pois isso pode causar inflamação posterior da pele11,12.</li>
	<li>Realizar incisão sagital do pescoço com uma lâmina(Figura 1). NOTA: A incisão precisa ser feita na linha média entre o pescoço, esterno e traqueia.</li>
	<li>Separe as duas glândulas salivares cuidadosamente usando dois fórceps e mobilize-as para visualizar os CCAs subjacentes.</li>
	<li>Isole a CCA direita cuidadosamente dos respectivos nervos vagos e veias que acompanham sem prejudicar suas estruturas, e coloque duas suturas de seda 6-0 sob a CCA. Amarre os dois laços firmemente para bloquear o fluxo sanguíneo(Figura 1). NOTA: Durante o procedimento, pequenas veias podem ser danificadas. Se o sangramento for visto, é necessário limpar os CCAs claramente.</li>
	<li>Encontre a CCA esquerda cuidadosamente a partir dos respectivos nervos vagos e veias que acompanham sem prejudicar suas estruturas, e oclua a CCA esquerda por 2 segundos por um grampo(Figura 1). NOTA: É necessário colocar uma agulha de sutura de seda 6-0 sob a CCA esquerda para marcar um local para fixação.</li>
	<li>Após a reabertura da CCA esquerda, sutura feridas do pescoço por uma sutura de seda 6-0 e aplicam um pouco de antibiótico (50 μL) no pescoço para inibir infecção bacteriana. NOTA: Remova suavemente um grampo para evitar danificar a parede arterial ao reabrir a CCA esquerda.</li>
	<li>Injete 0,75 mg/kg de cloridrato de atipamezole intraperitoneally no camundongo para ajudar o rato a se recuperar de anestesia profunda rapidamente. Devolva o mouse para uma gaiola de rato com almofadas pré-aquecidas. NOTA: Não deixe o rato sair sozinho até que o rato recupere a consciência suficiente para manter a recumbência severa.</li>
	<li>Injete 0,4 mg/kg de tartarato butorphanol no mouse para o manejo da dor quando o rato acordar. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Como primeira dica para o sucesso do tBCCAO, pode-se observar a inclinação das pálpebras do mouse(Figura 2).</li>
	<li>Para eutanásia, injete 3x de mistura de MMB nos camundongos e sacrifique-os para experimentos.</li>
</ol>3. Observações gerais (taxas de sobrevivência e inclinação das pálpebras)
<ol><li>Após a cirurgia, verifique as taxas de sobrevivência de todas as causas de morte no dia 0 (após a cirurgia), 1, 3 e 7.</li>
	<li>Avalie a inclinação das pálpebras por uma escala de classificação de 4 pontos: 1 = sem inclinação, 2 = inclinação leve (~50%), 3 = inclinação severa (acima de 50%) e 4 = inclinação severa com descarga ocular.</li>
</ol>4. Perfusão sanguínea retinana
<ol><li>Injete 200 μL de FITC-dextran (25 mg/mL) no ventrículo esquerdo do camundongo, que é comumente usado para a observação da perfusão sanguínea nos vasos de retina do rato13,14.</li>
	<li>2 minutos após a circulação, enuclear os olhos e fixar em 4% paraformaldeído por 1 hora. As retinas foram cuidadosamente obtidas e montadas planas, como descrito anteriormente15, e examinadas através de um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Tire fotos das montagens inteiras da retina em 4x de ampliação e mescle em um único usando um analisador de mesclagem, descrito anteriormente16.</li>
	<li>Meça as áreas perfundidas através de uma ferramenta de análise de embarcações no software NIH Fiji/ImageJ.</li>
</ol>5. Mancha ocidental
<ol><li>3 e 6 horas após tBCCAO, obtenha os olhos dos ratos e transfira imediatamente para uma placa de Petri contendo PBS frio para isolar as retinas.</li>
	<li>Após o isolamento das retinas, realize manchas ocidentais, como descrito anteriormente9.</li>
	<li>Incubar com anticorpos para fator indutível de hipóxia-1α (HIF-1α; um marcador geral de hipóxia) e para β-Actin (um controle de carregamento interno) durante a noite seguido da incubação de anticorpos secundários conjugados pelo HRP. Visualize os sinais via chemiluminescência.</li>
</ol>6. PCR quantitativo (qPCR)
<ol><li>6, 12 e 24 horas após tBCCAO, processe as retinas obtidas para qPCR, como descrito anteriormente17.</li>
	<li>Execute qPCR via sistema PCR em tempo real. Os primers utilizados estão listados na Tabela 1. Calcule as alterações de dobra entre os níveis de diferentes transcrições pelo método ΔΔCT.</li>
</ol>7. Imunohistoquímica (IHC)
<ol><li>3 dias após tBCCAO, obtenha os olhos de ratos e incorpore em parafina.</li>
	<li>Corte os olhos embutidos na parafina por um microtome para obter as seções oculares.</li>
	<li>Desparafinar e manchar as seções oculares de 5 μm de espessura como descrito anteriormente13.</li>
	<li>Incubar com um anticorpo para proteína ácida fibrilar gliana (GFAP; um marcador confiável para astrócitos e células Müller na retina) durante a noite seguido pela incubação do anticorpo secundário Alexa Fluor 555-conjugado.</li>
	<li>Use DAPI (4′,6-diamidino-2-fenildole) para coloração do núcleo na retina. Visualize sinais através de um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Avalie a pontuação da morfologia por uma escala de classificação de 4 pontos, como descrito anteriormente13,18: 0 = sem sinal, 1 = poucos pés finais gliais positivos na camada de célula de gânglio (GCL), 2 = poucos processos rotulados que atingem de GCL à camada nuclear externa (ONL) e 3 = a maioria dos processos rotulados que atingem de GCL para ONL.</li>
</ol>8. Eletroretinografia (ERG)
<ol><li>3 e 7 dias após a tBCCAO, realize o ERG utilizando uma cúpula ganzfeld, sistema de aquisição e estimuladores led, como descrito anteriormente9.</li>
	<li>Após adaptação escura da noite para o dia, anestesia os ratos com uma combinação de MMB sob luz vermelha fraca.</li>
	<li>Use uma solução mista de 0,5% de trópico e 0,5% de fenilefrina para dilatar as pupilas.</li>
	<li>Coloque os eletrodos ativos na lente de contato e coloque o eletrodo de referência na boca.</li>
	<li>Obtenha respostas de ERG de ambos os olhos de cada animal.</li>
	<li>Registos scotopic registro sob adaptação escura com vários estímulos.</li>
	<li>Meça as amplitudes de uma onda da linha de base até o ponto mais baixo de uma onda.</li>
	<li>Meça as amplitudes da onda B do ponto mais baixo de uma onda até o pico da onda B.</li>
	<li>Mantenha todos os ratos aquecidos durante o procedimento usando almofadas de calor.</li>
</ol>9. Tomografia de coerência óptica (OCT)
<ol><li>2 semanas após tBCCAO, realize o OCT usando o sistema SD-OCT, como relatado anteriormente8,9.</li>
	<li>Para a medição, sujeitos camundongos à micrária por uma solução mista de 0,5% de tropamida e 0,5% fenilefrina, e à anestesia geral por uma mistura de MMB.</li>
	<li>Obtenha imagens de varredura B de fatias equatoriais de varreduras en-face.</li>
	<li>Examine as retinas a 0,2, 0,4 e 0,6 mm da cabeça do nervo óptico.</li>
	<li>Meça a espessura da retina da camada de fibra nervosa da retina (NFL) até a membrana limitante externa (ELM), e considere a média dos valores medidos como espessura da retina de um camundongo individual.</li>
	<li>Plote os resultados como diagramas de aranha.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

No estudo, mostramos que o tBCCAO, utilizando suturas simples e um grampo, poderia induzir isquemia de retina e disfunção retinista. Além disso, demonstramos que nosso protocolo atual para o desenvolvimento de um modelo de camundongo de isquemia de retina é mais fácil e rápido em comparação com outros protocolos anteriores para o desenvolvimento de modelos de lesão isquêmica de retina2,3,7.
Anatomicam...

A retina é um tecido neurossensorial para função visual. Uma vez que uma quantidade substancial de oxigênio é necessária para a função visual, a retina é conhecida como um dos tecidos mais exigentes de oxigênio no corpo1. A retina é suscetível a doenças vasculares, pois o oxigênio é entregue através dos vasos sanguíneos. Vários tipos de doenças vasculares, como a retinopatia diabética e a oclusão dos vasos sanguíneos da retina (veias ou artérias), podem induzir isquemia da retina. Para investigar mecanismos patológicos de isquemia da retina, são considerados necessários modelos experimentais reprodutíveis e clinicamente relevantes de isquemia de retina. A oclusão da artéria cerebral média (MCAO) por inserção de um filamento intraluminal é o método mais utilizado para o desenvolvimento de modelos de roedores in vivo de isquemia cerebral experimental2,3. Devido à proximidade da artéria oftalmológica (OpA) com a MCA, os modelos de MCAO também são utilizados simultaneamente para entender a fisiopatologia da isquemia da retina4,5,6. Para induzir isquemia cerebral junto com isquemia de retina, filamentos longos são tipicamente inseridos através da incisão da artéria carótida comum (CCA) ou da artéria carótida externa (ECA). Esses métodos são difíceis de realizar, requerem muito tempo para completar a cirurgia (mais de 60 minutos para um rato), e levam a altas variabilidades nos desfechos após a cirurgia7. É importante desenvolver um modelo melhor para melhorar essas preocupações.
Neste estudo, bastamos usar a oclusão bilateral de CCA transitória curta (tBCCAO) com agulhas e um grampo para induzir isquemia de retina em camundongos e analisamos resultados típicos de lesões isquêmicas na retina. Neste vídeo, vamos dar uma demonstração do procedimento tBCCAO.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de atipamezol</td><td>Zenoaq</td><td>Antisedan</td><td>Para anti-anestesia</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Fast</td><td>Applied Biosystems-Para</td><td></td> <td>qPCR</td></tr><tr><td>Tartarato de butorfanol</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>Vetorphale</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>BZ-II Analyzer</td><td>KEYENCE-Para</td><td></td> <td>uma fusão de imagens</td></tr><tr><td>BALB/cAJc1</td><td>CLEA-Mouse</td><td></td><td> Cepa</td></tr><tr><td>&beta;-Actina (8H10D10) Mouse mAb</td><td>CST</td><td>3700</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Braçadeira Fórceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI 500451</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>Pinça Dumont #</td>5 <td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Para</td></tr><tr><td>cirurgia Solução DAPI</td><td>Dojindo</td><td>340-07971</td><td>Para</td></tr><tr><td>IHC Envisu SD-OCT sistema</td><td>Leica</td><td>R4310</td><td>Para os PTU</td></tr><tr><td>FITC-dextran</td><td>Merk</td><td>FD2000S</td><td>para perfusão sanguínea retiniana</td></tr><tr><td>microscópio de fluorescência</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td>Para detecção de fluorescência</td></tr><tr><td>Hidrato de gatifloxacina</td><td>Senju Pharmaceutical</td><td>Gachifuro</td><td>Para infecção antibacteriana</td></tr><tr><td>GFAP Anticorpo monoclonal (2.2B10)</td> <td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>Para</td></tr><tr><td>IHC Almofada de aquecimento</td><td>Marukan</td><td>RH-200</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>HIF-1&alpha; (D1S7W) XP Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>36169</td><td>Para western blot</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 mini</td><td>GE</td> <td>Healthcare-Para</td> <td>quimioluminescência</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Sandoz K.K</td><td>SANDOZ</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Micrótomo Tissue-Tek TEC 6</td><td></td> <td>Sakura-Para</td> <td>seccionamento</td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Orion Corporation</td><td>Domitor</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Agulha suporte</td><td>Handaya</td><td>HS-2307</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>PuREC</td><td>MAYO</td> <td>Corporation-Para</td> <td>ERG</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>Para cirurgia</td></tr><tr><td>Hialuronato de sódio</td><td>Santen Pharmaceutical</td><td>Hyalein</td><td>Para lubrificação ocular</td></tr><tr><td>Cloridrato de tropicamida / penilefrina</td><td>Santen Pharmaceutical</td><td>Mydrin-P</td><td>Para midríase</td></tr><tr><td>6-0 sutura de seda</td><td>Natsume</td><td>E12-60N2</td><td>Para cirurgia</td></tr></tbody></table>

um modelo murino de lesão isquêmica da retina induzida pela oclusão da artéria da carótida comum bilateral transitória

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

Diversas doenças vasculares, como retinopatia diabética, oclusão de veias da retina ou artérias e síndrome isquêmica ocular podem levar à isquemia da retina. Para investigar mecanismos patológicos da isquemia da retina, são necessários desenvolver modelos experimentais relevantes. Anatomicamente, um dos principais vasos de abastecimento sanguíneo da retina é a artéria oftalmômica (OpA) e a OpA é originária da artéria carótida interna da artéria carótida comum (CCA). Assim, a interrupção da CCA poderia efetivamente causar isquemia retinista. Aqui, estabelecemos um modelo de camundongo de isquemia de retina por oclusão da artéria carótida comum transitória (tBCCAO) para amarrar a CCA direita com suturas de seda 6-0 e ocluir a CCA esquerda transitoriamente por 2 segundos através de um grampo, e mostrou que o tBCCAO poderia induzir isquemia aguda de retina levando à disfunção da retina. O método atual reduz a dependência de instrumentos cirúrgicos usando apenas agulhas cirúrgicas e um grampo, encurta o tempo de oclusão para minimizar a morte inesperada de animais, o que é frequentemente visto em modelos de camundongos de oclusão da artéria cerebral média, e mantém a reprodutibilidade de achados isquêmicos comuns da retina. O modelo pode ser utilizado para investigar a fisiopatologia de retinopatias isquêmicas em camundongos e ainda pode ser usado para triagem in vivo de medicamentos.

Após a circulação sistêmica do FITC-dextran por 2 minutos, foram examinadas vasculaturas de retina das retinas esquerda e direita nos camundongos operados por sham e camundongos operados por tBCCAO(Figura Suplementar 1). FITC-dextran era totalmente visível nas duas retinas nos camundongos operados por farsa e na retina esquerda nos camundongos operados por tBCCAO, enquanto era parcialmente detectável na retina direita nos camundongos operados por tBCCAO.
Após tBCCAO, foi exami...

Aqui, descrevemos um modelo de camundongo de isquemia de retina por oclusão da artéria carótida comum bilateral transitória usando suturas simples e um grampo. Este modelo pode ser útil para entender os mecanismos patológicos da isquemia da retina causada por anormalidades cardiovasculares.

Um modelo murino de lesão isquêmica da retina induzida pela oclusão da artéria da carótida comum bilateral transitória

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...

O modelo de camundongo estabelecido com este protocolo pode ser utilizado para investigar a fisiopatologia das retinopatias isquêmicas e para triagem de drogas in vivo. O método atual pode reduzir a dependência de vários instrumentos cirúrgicos e encurtar o tempo de operação para induzir isquemia retiniana. A patogênese de doenças vasculares, como retinopatia diabética, oclusão de veias ou artérias da retina e síndrome isquêmica ocular pode ser compreendida.Demonstrando o procedimento estará Deokho Lee, nosso aluno de doutorado do meu laboratório. Yukihiro Miwa, DVM, PhD, e professor assistente do meu laboratório ajudará a demonstrar o procedimento. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e mantenha-os em álcool etílico a 70% antes do procedimento cirúrgico.Preparar ratinhos BALB/c machos numa sala específica isenta de agentes patogénicos para manter as condições estéreis antes, durante e após a cirurgia. Aplique uma gota de solução de colírio de hialuronato de sódio purificado a 0,1% nos olhos do animal para evitar o ressecamento sob anestesia. Coloque o mouse de costas e fixe as patas com fita adesiva.Desinfete a área do pescoço com álcool etílico 70% antes da cirurgia. Usando uma lâmina, faça uma incisão sagital no pescoço. Separe cuidadosamente as glândulas salivares usando duas pinças e coloque-as de lado para visualizar o CCA subjacente.Isole o CCA direito dos respectivos nervos vagais e veias acompanhantes e coloque duas suturas de seda 6-0 sob o CCA. Amarre as duas pontas firmemente para bloquear o fluxo sanguíneo. Limpe o sangue que escorre das pequenas veias danificadas durante o procedimento para uma visibilidade clara do CCA.Encontre o CCA esquerdo sem prejudicar as veias acompanhantes e coloque uma agulha de sutura 6-O sob ele para marcar um local para pinçamento, oclua-o por dois segundos. Remova suavemente o clamp para evitar danificar a parede arterial e reabra o CCA esquerdo. Após a reabertura, suture as feridas no pescoço com uma sutura de seda.Quando terminar, aplique um pouco de antibiótico no pescoço para inibir a infecção bacteriana. Injete no camundongo 0,75 miligramas por quilograma de cloridrato de atipamezol por via intraperitoneal para ajudá-lo a se recuperar rapidamente da anestesia profunda e, em seguida, retorne o camundongo a uma gaiola com almofadas pré-aquecidas. Quando o camundongo acordar, injete-o com 0,4 miligramas por quilograma de tartarato de butorfanol para controle da dor.A queda palpebral foi examinada após tBCCAO. O olho direito apresentava queda leve e severa da pálpebra, enquanto os olhos esquerdos não apresentavam queda, exceto por um camundongo. Immunoblots e análises quantitativas para HIF-1 alfa e beta-actina mostraram que o HIF-1 alfa foi estabilizado na retina direita três e seis horas após tBCCAO.A gliose reativa retiniana foi examinada três dias após o tBCCAO. A média dos escores morfológicos para a marcação GFAP na retina direita foi a mais alta entre as retinas nos camundongos operados por simulação e a retina esquerda nos camundongos operados por tBCCAO. As amplitudes da onda b no olho direito diminuíram três e sete dias após tBCCAO, conforme mostrado no ERG adaptado ao escuro.Já as análises quantitativas mostraram uma diminuição nas amplitudes da onda b no olho direito sem qualquer alteração da amplitude da onda a. Imagens representativas de OCT nas retinas operadas por simulação e tBCCAO e análises quantitativas mostraram que houve um aumento na espessura da retina na retina direita e nenhuma alteração na retina esquerda. Ao tentar este protocolo, é importante lembrar que o CCA correto deve ser ocluído claramente.E então o CCA esquerdo tem que ser rigorosamente ocluído. Com este método, hipertensão ou hipoglicemia podem ser aplicadas para imitar condições de doenças oculares humanas. Este modelo mostra os resultados da isquemia retiniana comum e os mecanismos de isquemia retiniana.

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Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

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Induzindo isquemia via oclusão do cérebro médio e da artéria carótida comum em um modelo de rato

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Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

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O protocolo atual descreve um modelo de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média em ratos que preserva a estrutura anatômica dos vasos cerebrais sem causar danos.

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Este protocolo descreve o processo de preparação para a reperfusão da oclusão da artéria cerebral média através da artéria carótida comum.

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Um modelo de camundongo para comprometimento cognitivo vascular e demência baseado em estenose bilateral assimétrica da artéria carótida comum guiada por agulha

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método reprodutível para realizar uma craniectomia seguida de oclusão permanente e seletiva da artéria cerebral média em ratos, para aplicação em estudos experimentais de déficits de memória motora e espacial.

Oclusão Seletiva e Permanente da Artéria Cerebral Média em Ratos: Uma Abordagem Experimental para Estudar Déficits de Memória Motora e Espacial

Aprenda a criar um modelo murino de isquemia retiniana por oclusão transitória bilateral da artéria carótida comum. Este método simplificado reduz o tempo cirúrgico e permite estudar retinopatias isquêmicas e triagem de fármacos in vivo.

Um modelo murino de lesão isquêmica da retina induzida pela oclusão da artéria da carótida comum bilateral transitória

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