Um ensaio de citometria de fluxo baseado em DNA/Ki67 para análise do ciclo celular de células CD8 T específicas de antígeno em camundongos vacinados
5 de janeiro de 2021
A expansão clonal é uma característica fundamental da resposta celular T específica do antígeno. No entanto, o ciclo celular das células T que respondem antígeno tem sido pouco investigado, em parte devido a limitações técnicas. Descrevemos um método citométrico de fluxo para analisar células CD8 T específicas de antígeno em baço e linfonodos de camundongos vacinados.
Nosso protocolo fornece uma abordagem prática pela qual o baço do rato e os linfonodos podem ser usados para refletir a dinâmica da resposta celular T maior do que fornecer um instantâneo fenotípico de estado estável. Nossa técnica detecta sensivelmente células CD8 T específicas de antígeno que estão engajadas em uma resposta contínua. A proliferação de células CD8 T são medidas sem os efeitos possivelmente confusos do tratamento medicamentoso in vivo ou transferência celular.
Nossa técnica pode fornecer uma janela na dinâmica imunológica em várias configurações. Por exemplo, em relação à resposta à vacinação e infecções, doenças autoimunes e imunoterapia contra o câncer. Prepare o tampão de lavagem de permeabilização fresco de 1x diluindo 10x tampão de permeabilização com água destilada e filtre-o através de um filtro de 0,45 micrômetros para eliminar agregados.
Anticorpo monoclonal diluído Ki67 FITC em 1x tampão de lavagem de permeabilização como determinado com um experimento de titulação para um volume final de 100 microliters por amostra. Adicione 3 mililitros do tampão de lavagem de permeabilização de 1x em cada tubo com células e centrífuga a 400 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante.
Novamente, adicione o tampão de lavagem de 1x pormeabilização e a centrífuga para pelotar as células. Então, descarte o supernatante. Adicione 100 microliters de anticorpo monoclonal diluído Ki67 FITC à pelota, depois vórtice e incubar por 30 minutos no escuro.
Após a incubação, lave as células duas vezes com 4 mililitros de 1x tampão de permeabilização, percrifugando após cada lavagem e descarte o sobrenante. Adicione 350 microliters de PBS à pelota celular para que as amostras sejam adquiridas diretamente no citômetro de fluxo e 250 microliters de PBS à pelota celular para que as amostras sejam incubadas com Hoechst para coloração de DNA. Prepare a solução Hoechst e PBS e adicione-a a cada amostra para que a concentração final seja de dois microgramas por mililitro.
Vórtice e incubar as amostras por 15 minutos no escuro. Em seguida, centrifufique as amostras por cinco minutos e adicione 350 microliters de PBS à pelota celular. Abra o software e crie diferentes grupos correspondentes aos diferentes órgãos a serem analisados clicando em Criar Grupo", na seção fita do espaço de trabalho.
Abra a janela de grupo modificada clicando duas vezes no nome do grupo e sincronize os grupos recém-criados inserindo uma marca de verificação na função sincronizada. Arraste cada arquivo FCS para seu grupo correspondente e crie uma estratégia de gating começando com o grupo A-LN. Abra a janela de gráfico clicando duas vezes na amostra totalmente manchada para exibir os eventos não datados adquiridos para a amostra em um gráfico de pontos.
Observe que o eixo x e y são rotulados como nos arquivos FCS, conforme indicado na tabela dois do arquivo de configurações do citômetro de fluxo deste manuscrito. Verifique se um número suficiente de eventos é exibido para visualização adequada. Se necessário, abra as preferências clicando no ícone do coração na fita do espaço de trabalho, selecione Gráficos e, em seguida, Dot Plot" como tipo de gráfico e verifique se o número de pontos sorteados na caixa correspondente está correto ou altere-o.
Exibir os eventos untados na janela de gráfico em uma trama de pontos com DNA-A no eixo x e DNA-W no eixo y. Use escala linear para ambos os eixos. Se necessário, altere a escala de logarítmica para linear clicando na caixa indicada com um T próximo a cada eixo na janela de gráfico.
Selecione uma única população celular clicando em retângulo na seção de ferramenta gating e clique duas vezes no centro do portão retangular para exibir células únicas em um gráfico de pontos com parâmetro FSC-A no eixo x e célula morta morrer no eixo y. Clique no polígono para selecionar a população de células vivas, que são negativas para a morte de células mortas. Clique duas vezes no centro do portão do polígono para exibir as células em um gráfico de pontos com o parâmetro FSC-A no eixo x e o parâmetro SSC-A no eixo y.
Clique em retângulo e crie um portão relaxado para incluir todas as células vivas únicas nesse gráfico. Clique duas vezes no centro do portão relaxado para exibir as células em um gráfico de pontos com CD3 no eixo x e CD8 no eixo y. Use a escala de acesso apropriada para visualização na janela de gráfico.
Se necessário, modifique a escala x e y clicando na caixa, indicada com um T próximo a cada eixo, escolha Personalizar a Função de Acesso e modifique décadas extras com bases e décadas positivas conforme necessário. Selecione as células CD3+CD8+clicando no polígono. Clique duas vezes no centro do portão CD3+CD8+para exibir as células em um gráfico de pontos com tetr-gag no eixo x e pent-gag no eixo y.
Selecione as células CD8 T específicas do antígeno clicando no polígono. Clique duas vezes no centro do portão específico da mordaça para exibir as células em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e Ki67 no eixo y. Selecione as células nas diferentes fases do ciclo celular clicando em Quad"na seção de ferramenta de gating da janela de gráfico.
Copie a estratégia de gating criada em uma amostra para o grupo correspondente para aplicar os portões a todas as amostras do grupo. Em seguida, copie estratégias de gating para os grupos b-baço e CBM, conforme descrito no manuscrito do texto. Verifique se todos os portões são apropriados para cada amostra dos três grupos.
Se necessário, dessincronize o grupo e modifique portões conforme descrito no manuscrito. Exibir as células BM do portão relaxado em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e Ki67 no eixo y. Visualize os resultados clicando no Editor de layout"na seção fita do espaço de trabalho.
Arraste cada portão da estratégia de gating no painel de amostra para o editor de layout e coloque as parcelas de acordo com a sequência do gating. Se necessário, altere o tipo de gráfico clicando duas vezes no gráfico correspondente no layout e selecionando o tipo apropriado na janela de definição do gráfico. Clique no grupo e iterar por funções na fita de layout para visualizar os resultados obtidos em células CD8 T específicas de antígeno de cada órgão e comparar amostras diferentes.
Visualize resultados de células de medula óssea representando um controle positivo. Um exemplo típico de análise do ciclo celular das células da medula óssea é mostrado aqui. O protocolo rendeu um baixo coeficiente de variação de G0 para G1 e G2 para M picos de DNA, indicando excelente qualidade da coloração de DNA.
Uma estratégia de cinco passos foi empregada para identificar células CD8 específicas de antígeno. Dois multimers foram usados para melhorar a sensibilidade da detecção de células CD8 T específicas da mordaça em camundongos vacinados sem aumentar o fundo de coloração em camundongos não tratados. As células CD8 T específicas da mordaça nos linfonodos drenantes e no baço contêm uma alta proporção de células nas fases S-G2/M no terceiro dia após o impulso.
Além disso, as células CD8 T específicas da mordaça nas fases S-G2/M apresentaram FSC-A e SSC-A elevados quando sobrepostas às células CD8 T totais do mesmo órgão. Os histogramas offset mostraram que a expressão CD62L por células CD8 T específicas da mordaça era baixa, como esperado para células T ativadas, exceto por algumas células em G0 nos linfonodos. Este método foi projetado para células T para obter uma excelente qualidade de coloração de DNA juntamente com a membrana e a coloração ki67.
A análise de dados de citometria de fluxo é um ponto-chave. Certifique-se de usar o controle apropriado para posicionamento do portão. Usando este método, descobrimos células T em fases S-G2/M do ciclo celular em camundongos e sangue periférico humano.
Esta técnica foi útil em estudos de imunomonitoramento em diabetes tipo 1, mononucleose infecciosa e COVID-19.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método de citometria de fluxo para analisar linfócitos T CD8 específicos para antígenos em expansão clonal no baço e nos linfonodos de camundongos vacinados. A técnica permite a detecção de respostas de linfócitos T sem os efeitos confundidores do tratamento com fármacos in vivo ou da transferência de células.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Imunologia
- Citometria de Fluxo
- Biologia das Células T
Contexto
- A expansão clonal é crucial para as respostas de linfócitos T específicos por antígeno.
- O ciclo celular de linfócitos T em resposta tem sido pouco explorado devido a desafios técnicos.
- Compreender a dinâmica dos linfócitos T é essencial para obter insights sobre as respostas imunológicas.
- Este estudo aborda a necessidade de um método para analisar as respostas de linfócitos T em tempo real.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para analisar linfócitos T CD8 específicos para antígenos in vivo.
- Fornecer informações sobre a proliferação de linfócitos T durante respostas imunes.
- Facilitar o estudo da dinâmica dos linfócitos T em diversos contextos imunológicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de tampão de lavagem de permeabilização fresco para coloração celular.
- Uso do anticorpo monoclonal Ki67 FITC para detectar linfócitos T em proliferação.
- Análise por citometria de fluxo para avaliar populações de linfócitos T e seus estados de ativação.
- Estratégias de seleção para isolar linfócitos T CD8 específicos para antígenos de populações mistas.
Resultados Principais
- O método detecta com sucesso linfócitos T CD8 específicos para antígenos envolvidos em respostas ativas.
- A proliferação de linfócitos T CD8 pode ser medida com precisão, sem variáveis confundidoras.
- A técnica revela informações sobre a dinâmica dos linfócitos T durante vacinação e infecção.
- Os resultados demonstram a utilidade deste método no estudo de doenças autoimunes e imunoterapia do câncer.
Conclusões
- O método citométrico de fluxo desenvolvido é eficaz para analisar respostas de células T.
- Essa abordagem aprimora a compreensão da dinâmica imunológica em diversos contextos.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para explorar o comportamento das células T na saúde e na doença.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a quantificação precisa da proliferação de linfócitos T CD8 específicos para antígenos in vivo, preenchendo uma lacuna crítica no imunomonitoramento para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapias. Ao distinguir as fases G0, G1 e S-G2/M sem depender de análogos de nucleotídeos ou diluição de corantes, fornece um instantâneo mecanicista da dinâmica de expansão clonal. Isso apoia a validação de alvos e a identificação de candidatos promissores ao associar o reconhecimento do antígeno a estados proliferativos funcionais em modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da correlação entre especificidade antigênica e progressão do ciclo celular em linfócitos T responsivos.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura reprodutível por citometria de fluxo para validação funcional de alvos, independente das limitações de BrdU ou CFSE.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao quantificar a proporção de linfócitos T específicos por antígeno comprometidos com a mitose em comparação com aqueles em G1 ou G0.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Gera saídas quantitativas padronizadas (DNA-A vs Ki67) adequadas para triagem em alta produtividade de candidatos a vacinas ou imunomoduladores.
- Reprodutibilidade: Utiliza Hoechst 33342 para discriminação de picos de DNA de alta resolução, garantindo separação consistente entre G0/G1 e G2/M em diferentes amostras.
- Escalabilidade: Compatível com análise multiorgânica (baço, linfonodos, medula óssea) e adaptável a espécies pré-clínicas para comparação entre estudos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para Doenças: Aplicável a estudos de eficácia de vacinas, conforme demonstrado em camundongos vacinados com vetor HIV-gag, que apresentaram enriquecimento em S-G2/M em linfócitos T CD8 específicos para antígeno.
- Continuidade Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao fornecer uma medida cineticamente resolvida da expansão de linfócitos T, preditiva da magnitude da resposta imune.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Permite critérios de prosseguir/não prosseguir com base na cinética proliferativa de clones específicos para antígeno, reduzindo a dependência exclusiva de marcadores fenotípicos de ponto final.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo a avaliação precoce da capacidade proliferativa de linfócitos T após imunização e orientando a otimização de compostos líderes por meio de perfilagem imunológica funcional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar o reconhecimento de antígenos (por meio de multímeros de MHC) ao estado do ciclo celular, esclarecendo se o engajamento induz proliferação ou anergia.
- Triagem: Fornece dados quantitativos prontos para ensaio sobre a distribuição do ciclo celular, permitindo comparar plataformas de vacinas ou os efeitos de adjuvantes na expansão de linfócitos T.
- Análises: Gera leituras multiparamétricas (conteúdo de DNA, Ki67, dispersão, especificidade antigênica) que permitem comparação estatística de índices proliferativos entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao identificar subconjuntos de linfócitos T ativados e em divisão celular que se correlacionam com imunidade protetora em modelos de infecção e câncer.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de imunomonitoramento para estudos longitudinais em programas de doenças autoimunes, infeciosas e imuno-oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao resolver a heterogeneidade proliferativa dentro de populações de células T específicas para antígenos.
- Valor Operacional: Proporciona padronização por meio de uma estratégia fixa de seleção de eventos (gating) e coloração de DNA baseada em Hoechst, minimizando a variabilidade entre ensaios.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir a eliminação precoce de candidatos imunomoduladores com base na cinética funcional das células T.
- Impacto no Portfólio: Orienta o avanço ajustado ao risco ao quantificar a fração proliferativa de células T específicas para antígenos como um biomarcador da qualidade da resposta.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em citometria de fluxo multicolorida, incluindo controles de compensação para os sinais FITC-Ki67 e Hoechst.
- Necessita de acesso a um citômetro de fluxo capaz de excitação por luz ultravioleta para detecção de Hoechst 33342 e conjuntos apropriados de filtros.
- Exige protocolos padronizados de permeabilização e lavagem para preservar a integridade do epítopo para Ki67, multímeros e marcadores de superfície.
- Envolve a otimização da concentração de Hoechst (2 µg/mL) e do tempo de incubação para evitar citotoxicidade, ao mesmo tempo que se obtém resolução ideal dos picos de DNA.
- Depende de uma hierarquia adequada de seleção de eventos (gating), iniciando com exclusão de células singletas e células viáveis, para garantir a identificação precisa de linfócitos T específicos por antígeno.
