Avaliando o impacto da fratura hidráulica nos córregos usando assinaturas moleculares microbianas

Este protocolo pode ser usado para responder à questão de se e como a fratura hidráulica afeta bactérias em córregos próximos e por extensão os próprios córregos. A principal vantagem dessa técnica é sua natureza holística, pois leva o pesquisador da coleta de amostras até a análise de dados. Demonstrando o procedimento estarão Jeremy Chansee, um bioinformático do meu laboratório, Sydney Regal, uma estudante de graduação no Juniata College, e Gillian Leister, minha gerente de laboratório.

Para coletar amostras de sedimentos para extração de ácido nucleico, use luvas para submergir um tubo cônico de 50 mililitros na água do córrego da costa. Enquanto o tubo estiver submerso, remova a tampa e use a tampa para colher aproximadamente três mililitros de sedimentos de uma profundidade de um a três centímetros no tubo. Depois de coletar a amostra, despeje todos, exceto aproximadamente um mililitro de água do tubo e use uma pipeta de 1.000 microliteres para adicionar três mililitros de conservante de DNA/RNA à amostra.

Gire o tubo cônico tampado por cinco segundos para misturar completamente o conservante e amostrar e armazenar a amostra no gelo. Ao retornar ao laboratório, armazene a amostra a menos 20 graus Celsius para análise de DNA 16S ou menos 70 graus Celsius para análise de RNA metatranscriptomics. Para a coleta do filtro, encha completamente e esvazie uma garrafa inteira estéril de um litro com água do córrego três vezes para condicionar a garrafa antes de encher a garrafa uma última vez.

Em uma superfície estável, desenhe um volume total de água do córrego em uma seringa de bloqueio estéril e conecte a seringa a um filtro polietrofone de 1,7 centímetro de diâmetro livre e estéril e DNA/RNA com um tamanho de poro de 0,22 mícrons. Lave todo o volume de água do córrego através do filtro. Quando todo o volume da amostra tiver sido filtrado da mesma forma, desenhe aproximadamente 20 mililitros de ar para dentro da seringa e empurre o ar através do filtro para remover qualquer excesso de água do filtro.

Em seguida, use uma micropipette P1000 para adicionar dois mililitros de conservante de DNA/RNA à abertura maior do filtro enquanto segura o filtro horizontalmente com a ponta da pipeta no barril do filtro para garantir que o conservante entre no filtro. Em seguida, sele o filtro com quadrados bem embrulhados de filme de parafina em torno de cada abertura e coloque o filtro em um saco de amostra estéril no gelo. Ao retornar da amostragem, armazene os filtros para 16S ou para análise metatranscriômica, conforme demonstrado.

Antes de iniciar uma transferência amostral, limpe a área de trabalho com 10% de alvejante e 70% de etanol. Para extração de ácido nucleico de uma amostra de sedimentos, use uma ferramenta metálica esterilizada por chama e etanol para transferir aproximadamente 250 miligramas de amostra para um tubo de microcentrífuga. Para extração de ácido nucleico a partir de uma amostra de filtro, use um aperto de vício esterilizado de 70% de etanol e chama para quebrar o invólucro do filtro na superfície estéril e remover o núcleo da carcaça.

Use um bisturi estéril para cortar na parte superior, inferior e ao longo da costura do núcleo e use pinças estéreis para dobrar o papel do filtro antes de cortá-lo em pequenos pedaços com o bisturi. Em seguida, coloque cuidadosamente as peças do filtro em um tubo de microcentrifuuagem sem entrar em contato com nenhuma superfície não esterilizada. Para a lise das células dentro de qualquer tipo de amostra, submia o tubo a um disruptor celular em alta velocidade.

Após pelo menos cinco minutos, centrifufique as amostras e transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrifuuge estéril. Adicione o tampão de lise ao supernasciente em uma proporção de um para um e transfira a solução para o filtro fornecido. Coloque o filtro em um novo tubo de microcentrifusagem e adicione 400 microliters de tampão de preparação ao tubo.

Após a centrifugação, adicione 700 microliters de tampão de lavagem ao tubo e centrifufique o filtro novamente. Depois de descartar o fluxo, adicione 400 microliters de tampão de lavagem ao tubo para uma centrifugação adicional e transfira o filtro para um novo tubo de microcentrifuge estéril. Para elutar o DNA, trate o filtro com 50 microlitres de água sem DNase/RNase por cinco minutos em temperatura ambiente.

Enquanto isso, coloque um filtro de três HRC em um tubo de coleta e adicione 600 microliters da solução de preparação HRC. Após a centrifugação, transfira o filtro para um novo tubo de microcentrífuga estéril e transfira o DNA elucido para o filtro para centrifugação. O fluxo contém o DNA extraído.

Para criar uma biblioteca de RNA de DNA 16S, primeiro use o produto de DNA recém-extraído para amplificação rna ribossômica 16S com um protocolo PCR padrão. Misture sete microliters do produto PCR resultante e 13 microliters de água sem DNase e carregue a solução PCR em um gel de 2% de agarose. Em seguida, execute o gel a 90 volts por 60 a 90 minutos para verificar se há um tamanho de banda de 386 pares de base como evidência de uma amplificação bem sucedida.

Para purificar a biblioteca de RNA ribossômico de DNA 16S, piscina 10 microliters dos produtos PCR que produziram bandas brilhantes e 13 microliters das amostras que produziram bandas fracas em um tubo de microcentrifuuge estéril e carregam cerca de 150 a 200 nanogramas de cada amostra agrupada em poços individuais de um novo gel de 2%. Depois de executar o gel como demonstrado, extirpa as 386 bandas de par base do gel e use um kit comercial para purificar o DNA. Em seguida, elute o DNA purificado com 30 microlitres de 10 mililitros tris e embalar as bibliotecas purificadas em gelo seco antes de enviar para o sequenciamento de próxima geração.

Nesta análise representativa, todas as extrações, exceto uma, seriam apelidadas de bem sucedidas. Bandas brilhantes observadas após a amplificação do PCR indicam sucesso para o protocolo 16S. As amostras 16S devem ter um mínimo de 1.000 sequências com pelo menos 5.000 sendo ideais, enquanto amostras metatransóricas devem ter um mínimo de 500.000 sequências com pelo menos 2 milhões sendo ideais.

Amostras de sedimentos de 21 locais diferentes em 13 fluxos diferentes para análise de 16S e metatranscriptomics são mostradas. Desses 21 locais, 12 foram a jusante da atividade fracking e classificados como fraturamento hidráulico positivo, e nove eram a montante da atividade fracking ou em uma bacia hidrográfica em que a fracking estava ausente e classificada como fraturamento hidráulico negativo. Conforme avaliado pela análise PERMANOVA, a separação observada entre os dados hidráulicos de fraturamento positivo e negativo sugere que as amostras positivas de fraturamento hidráulico foram impactadas pelo fracking.

Os mais importantes preditores florestais aleatórios revelariam quais características eram mais essenciais para diferenciar corretamente as amostras. Se um tátil for identificado como importante pelo modelo florestal aleatório, seu perfil de resistência antimicrobiana em amostras positivas de fraturamento hidráulico pode ser comparado ao seu perfil em amostras negativas de fraturamento hidráulico. Se eles diferem muito, isso poderia sugerir que o fluido fracking contendo biocidas entrou no córrego.

Micróbios estão por toda parte, então a contaminação é um problema potencial significativo com esse tipo de trabalho. As etapas iniciais de transferência de amostras são especialmente propensas a isso. Se alguém estiver interessado em biodegradação microbiana ou outros metabolismos, o sequenciamento de espingarda de RNA pode ser usado para investigar a expressão genética microbiana ativa.

Esta técnica permite a padronização de técnicas moleculares para investigar comunidades bacterianas in situ, bem como análises bioinformáticas de dados de sequência bacteriana.