Name: Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprenda a técnica de microinjeção de embrião em flebotomíneos (Phlebotomus papatasi) para mutagênese CRISPR/Cas9. Este método permite editar genomas de vetores de doenças com precisão.

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Os autores agradecem a Vanessa Meldener-Harrell pela leitura crítica do manuscrito.

O uso de camundongos como fonte de sangue para alimentação de moscas de areia foi realizado de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Os invertebrados não estão cobertos pelas diretrizes do NIH.
1. Preparação da agulha(Figura 1)
<ol><li>Puxe agulhas e bisel como descrito em Meuti e Harrell19. Brevemente, puxe agulhas em um puxador de micropipette de vidro de dois estágios, usando capilares de vidro borossilicato.</li>
	<li>Afie as agulhas molhadas no beveller de micropipette, usando uma pedra extra fina.</li>
</ol>2. Coleta e micromanipulação de embriões (Figura 2)
<ol><li>Cinco dias antes do dia da injeção, a alimentação sanguínea e as fêmeas voam fêmeas como realizada rotineiramente para a manutenção da colônia. Para obter detalhes sobre as colônias de moscas de areia que criam procedimentos e material necessário, consulte Lawyer et al.1 Mantenha os insetos em incubadoras com 70% de umidade e 26 °C, durante todo o seu desenvolvimento.<ol>
<li>Um dia, após a alimentação sanguínea, capture fêmeas alimentadas com sangue por grupos de 100-150 em potes de gesso com uma porta lateral. Mantenha as fêmeas alimentando-as com solução de açúcar (30% de sacarose – volume suficiente para absorver uma pequena bola de algodão) o que é comum para a manutenção da colônia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia 2-3 pós alimentação sanguínea, NÃO umedeça os potes de gesso. Manter as fêmeas em um substrato seco evitará a colocação prematura de ovos, uma vez que as fêmeas preferem colocar ovos em um ambiente úmido.</li>
	<li>No dia 5 pós-alimentação sanguínea, realize a coleta de embriões, micromanipulação e microinjeção. Introduza um papel filtro úmido na câmara de colocação de ovos. Embriões recém-colocados não têm um acorde totalmente desenvolvido e parecem brancos. Use papel filtro preto durante o procedimento para facilitar a visualização dos embriões brancos.</li>
	<li>Transfira um pequeno grupo de fêmeas da panela de gesso para a câmara de colocação de ovos através das portas laterais usando um aspirador bucal. A presença de um substrato úmido (o papel filtro) induz as fêmeas a oviposit.</li>
	<li>Depois de 30-60 min, recupere cuidadosamente o papel filtro com embriões recém-colocados da câmara. Mantenha o papel filtro e os embriões em uma placa de Petri por até 3 horas. Durante este tempo, avalie regularmente o nível de umidade do papel filtro para garantir que ele permaneça úmido. Durante esse período, repita as etapas 2.4 a 2.6 com novos grupos de fêmeas e colete o maior número possível de embriões.</li>
	<li>Prepare slides de microscópio para a injeção: colete manualmente os ovos um a um com um pincel muito fino e transfira-os cuidadosamente para outro pedaço de papel filtro preto úmido colocado em um slide de microscópio coberto com uma mancha de vidro.<ol>
<li>Adicione água ao papel filtro, o suficiente para manter os embriões úmidos, mas não fazendo com que flutuem para longe da tampa ou sejam sugados sob a tampa. Alinhe os embriões contra o deslizamento. O deslizamento de cobertura age como um backstop impedindo que os ovos se afastem durante a injeção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injeções de Embriões(Figura 3)
<ol><li>Iniciar injeções de 2,5 a 3 horas após o início da coleta de ovos. Realizar injeções à temperatura ambiente e umidade do laboratório ambiente.</li>
	<li>Certifique-se de que os embriões alinhados tenham água suficiente para que sejam mantidos úmidos. NOTA: É fundamental que os embriões sejam mantidos úmidos durante as injeções. Se não estiverem úmidos durante o processo de injeção, as injeções se tornam difíceis porque a agulha tem problemas para perfurar o embrião. A quantidade correta de água é o ponto em que os embriões têm um menisco de água ao seu redor, mas o deslizamento não está flutuando em cima da água fazendo com que os embriões empurrem sob o deslizamento de cobertura. É fundamental monitorar a quantidade de água ao redor dos embriões durante as injeções. Adicione água conforme necessário para manter os embriões úmidos.</li>
	<li>Adicione a água cuidadosamente, molhando uma escova com água e transferindo a água para a parte de trás do papel do filtro. Adicionar água desta forma permite que a água seja adicionada de forma lenta e controlada para que apenas o suficiente seja adicionado para manter os embriões úmidos. Muita água pode fazer com que os embriões flutuem para fora do alinhamento, dificultando a injeção dos embriões.</li>
	<li>Misture a injeção de carga na agulha de microinjeção. Adicione aproximadamente 0,5 a 1 μL de mistura de injeção na agulha usando um enchimento de agulha borossilicato desenhado à mão, as pontas de tubulação de carregamento de gel também podem ser usadas. A mistura de injeção é composta de um ou vários RNA guia (80 ng/μL cada) projetado para atingir um lócus específico misturado com proteína Cas9 recombinante comercial (300 ng/μL).</li>
	<li>Começando com a pressão de injeção a 30 psi, pressione o gatilho de injeção para expulsar o ar da ponta da agulha. Isso forçará a mistura de injeção à ponta da agulha permitindo que a mistura de injeção flua. Neste ponto, aumente lentamente a pressão de espera/constante até que o material de injeção comece a fluir, em seguida, recue a pressão de espera/constante para que ele fique logo abaixo do ponto da mistura de injeção que flui da agulha. O ambiente fechado deve fornecer apenas material de injeção suficiente para que uma pequena quantidade de material possa ser vista para entrar no embrião. NOTA: A injeção de embriões de mosca de areia sob óleo de halocarbono semelhante a outros protocolos usados para Drosophila e mosquitos foi inicialmente testada, porém a porcentagem de sobrevivência dessas injeções foi muito baixa. A sobrevivência foi melhorada com a mudança para injeções em papel filtro úmido como descrito acima.</li>
	<li>Insira a agulha na lateral do embrião. Use o deslizamento atrás do embrião como um backstop que ajudará a agulha a perfurar o embrião. Entregue uma pequena quantidade de mistura de injeção no embrião antes de remover suavemente a agulha.</li>
	<li>Imediatamente após a remoção da agulha, pressione o injetor para remover qualquer material reabastecado da ponta da agulha. Isso ajudará a evitar que a agulha entupisse.</li>
	<li>Vá para o próximo embrião. Entre cada injeção, certifique-se de que o papel do filtro está úmido e que a agulha não está entupida.</li>
	<li>Uma vez que todos os embriões tenham sido injetados, conte o número de embriões injetados para manter uma contagem de execução.</li>
	<li>Remova a mancha de cobertura adicionando água ao papel do filtro para que a mancha de cobertura flutue. Neste ponto, use uma sonda (vara aplicadora de madeira com pino de inseto colado na ponta) para manter o papel filtro no lugar enquanto um dedo é usado para puxar a tampa para longe dos embriões injetados.</li>
	<li>Limpe o excesso de água do papel do filtro uma vez que a mancha de cobertura tenha sido removida.</li>
</ol>4. Criação pós-injeção (G0)(Figura 4)
<ol><li>Transfira o papel filtro com os embriões em cima de várias camadas de papel filtro úmido colocado em uma placa de Petri para manter a umidade. Mantenha os embriões aqui durante o tempo necessário para injetar outros embriões. Embriões podem ser mantidos por um máximo de 3 horas como este. Após a injeção, eles vão lentamente ficar marrons.</li>
	<li>Uma vez que todos os embriões tenham sido injetados, transfira manualmente-os para potes de gesso de pequeno porte previamente umedecidos. Não coloque muitos embriões em cada pote e mantenha distância entre eles, para evitar uma possível contaminação fúngica entre os indivíduos. Cubra os potes com uma tela e armazene-os como normalmente seria feito para ovos de colônia de moscas de areia, mantidos em incubadoras a 70% de umidade e 26 °C, durante todo o seu desenvolvimento.</li>
	<li>No primeiro dia pós-injeção, remova todos os embriões danificados e mortos com um pincel. Adicione 100 μL de ácido propiônico de 0,5%, gota a gota, nos potes de gesso contendo os embriões injetados para limitar a contaminação fúngica. A liberação de citoplasma de embriões danificados durante o processo de injeção é particularmente favorável ao crescimento fúngico.</li>
	<li>Verifique os potes de gesso todos os dias e remova os embriões ruins ou mortos. Se o fungo estiver presente, remova todos os embriões infectados e adicione algumas gotas de ácido propiônico de 0,5%.</li>
	<li>Larvas eclodem entre os dias 8 e 12 pós-injeção. Duas vezes por dia, transfira as larvas recém-emergidas para novos potes de gesso, em grupos de 5-10 no máximo. Adicione uma pequena quantidade de comida e verifique a comida 2-3 vezes por semana.<ol>
<li>Monitore cuidadosamente a quantidade de alimentos larvais, pois aumenta muito o risco de contaminação fúngica. Larvas de mosca de areia sobrevivem melhor em grupos, porém podem ser canibais se não houver comida suficiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando as larvas pupar, separe-as por sexo para manter as fêmeas como virgens. Se houver muitos sobreviventes, descarte os machos e mantenha apenas as fêmeas. NOTA: Tanto os machos quanto as fêmeas podem carregar e transmitir mutações. No entanto, como as fêmeas têm que ser mantidas virgens antes de serem cruzadas, é mais fácil usar apenas as fêmeas injetadas do G0 para evitar ter que separar os insetos wt por sexo. Os machos G0 podem ser mantidos como reforço se o número de sobreviventes adultos for baixo e, neste caso, será acasalado com fêmeas virgens classificadas.</li>
</ol>5. Seleção e triagem de alelos mutantes(Figura 5)
<ol><li>Cruze em massa as fêmeas G0 com machos em uma gaiola. Alimenta-os completamente, como seria feito para a manutenção normal da colônia.</li>
	<li>Um dia, após a alimentação sanguínea, transfira cada fêmea G0 com machos de 2-3 wt em tubos individuais de gesso usando um aspirador bucal. Alimente as moscas com açúcar em uma pequena bola de algodão trocada todos os dias e use uma seringa de água para garantir que a umidade do gesso seja adequada para a colocação de ovos.</li>
	<li>Após as fêmeas G0 colocarem ovos (correspondentes ao G1),recolher seus corpos em tubos Eppendorf anotados para genotipagem posterior. Mantenha os embriões como normalmente feito para colônias wt.</li>
	<li>Extrair o DNA das fêmeas G0 pelo método de escolha.</li>
	<li>Trie o DNA para a presença de mutações, por exemplo, projetando um ensaio pcr usando primers em torno da região de cortes crocantes esperados.</li>
	<li>Mantenha apenas os embriões G1 colocados por fêmeas G0 mostrando evidências de transformação. Quando esses embriões G1 se desenvolverem em pupas, separem-nos pelo sexo e mantenham apenas as fêmeas. Cruze as fêmeas G1 do mesmo sexo feminino G0 para os machos, alimenta-os com sangue, depois transfira em pequenos grupos de 2-3 fêmeas e 4-5 machos em recipientes de pequeno porte. NOTA: Todos os indivíduos do G1 têm a chance de carregar uma mutação única, portanto, se o número de indivíduos sobreviventes não é muito alto, então é melhor cruzar as fêmeas G1 individualmente com os machos wt. O caso de várias fêmeas carregando uma mutação diferente presente em um mesmo tubo é raro, mas pode ocorrer. Se esse caso for observado após a genotipagem, as fêmeas progêneras G2 devem então ser acasaladas individualmente para os machos wt. Este esquema de acasalamento evita a possibilidade de múltiplas mutações na prole.</li>
	<li>Após a colocação de ovos, colete os corpos femininos G1 e trie-os para mutações. Mantenha apenas os tubos onde pelo menos uma fêmea mostrou evidência de mutação.</li>
	<li>Para gerações posteriores fazer um par único em cruzes. Depois da colocação de ovos, pais de tela para a presença de mutação. Repita em cada geração até que ambos os pais sejam homozigosos para a mesma mutação. Uma vez identificados, eles serão os fundadores de um estoque mutante homozigoso.</li>
</ol>

<ol><li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42(2017).</li>
<li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9%3A+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li>
<li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li>
<li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098(2008).</li>
<li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542(2009).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li>
<li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li>
<li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies%3A+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li>
<li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62(2009).</li>
<li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486(2011).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li>
<li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769(2018).</li>
<li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651(2020).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008(2018).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+%28Bemisia+tabaci%29%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li>
<li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes+and+Genetics+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li>
</ol>

Apresentamos aqui um método de microinjeção de embriões recentemente desenvolvido para mutagênese direcionada por CRISPR/Cas9 em moscas de areia Phlebotomus papatasi. A microinjeção de embriões para modificação genética de insetos foi desenvolvida em Drosophila em meados da década de 198021 e agora é usada rotineiramente em uma grande variedade de insetos. Outros métodos para a entrega de materiais de modificação genética foram desenvolvidos para uso em insetos, como ReMOT<sup cl...

As doenças transmitidas por vetores são uma grande ameaça à saúde pública em constante evolução. Centenas de espécies vetoriais espalhadas por famílias filogênicas muito distintas (por exemplo, mosquitos, carrapatos, pulgas) são responsáveis pela transmissão de um grande número de patógenos microbianos, resultando em mais de 700.000 mortes humanas por ano, de acordo com a Organização Mundial da Saúde. Entre os insetos vetoriais, as moscas de areia de flebotomina (Diptera, Psychodidae) constituem um vasto grupo, com 80 espécies vetoriais comprovadas exibindo traços fenotípicos distintos e capacidades vetoriais encontradas em diferentes regiões geográficas. São vetores para os parasitas protozoários do gênero Leishmania,causando cerca de 1,3 milhão de novos casos de Leishmanioses e entre 20.000 e 30.000 mortes por ano. Os desfechos clínicos das leishmanioses são diversos, com sintomas que vão desde lesões cutâneas auto-limitantes até disseminação visceral que é fatal na ausência de tratamento.
Moscas de areia são insetos estritamente terrestres. Seu ciclo de vida, relativamente longo em comparação com outros Diptera, dura até três meses, dependendo de diferentes parâmetros, como temperatura, umidade e nutrição. Consiste em um estágio embrionário (6 a 11 dias), quatro estágios larvais (com duração total de 23 a 25 dias) e um estágio pupal (9 a 10 dias) seguido de metamorfose e depois idade adulta. Moscas de areia requerem um ambiente úmido e quente para a criação. Tanto machos quanto fêmeas se alimentam de açúcares, obtidos na natureza a partir de néctars de flores. Apenas as fêmeas são alimentadores de sangue, pois necessitam de proteínas obtidas da farinha de sangue para a produção de ovos1.
Um foco importante da pesquisa é identificar a natureza das interações vetor/parasita que levam ao desenvolvimento de infecções transmissíveis. Assim como outros insetos vetoriais, parâmetros intrínsecos às moscas de areia têm mostrado impacto em sua competência vetorial, que é definida como sua capacidade de transportar e transmitir patógenos para seus hospedeiros. Por exemplo, a expressão de galectinas pelos phlebotomus papatasi e células midgut de mosca, agindo como receptores reconhecendo componentes da superfície parasita, pode influenciar diretamente sua competência vetorial para Leishmania maior2,3. A via de resposta imune ao inseto, Immune Deficiency (IMD), também é crucial para a competência vetorial de phlebotomus papatasi para a Leishmania maior4. Um papel crítico para as vias de resposta imune a insetos vetoriais no controle de sua transmissão de patógenos infecciosos tem sido relatado da mesma forma nos mosquitos Aedes aegypti 5,6,7, na mosca tsé-tsé Glossina morsitans8, e em Anopheles gárdias mosquitos 9,10.
Estudos de interações de moscas deareia/Leishmania têm sido limitados pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses insetos. Apenas a desregulamentação genética por RNA de pequena interferência (siRNA) havia sido realizada11,12,13,14 até recentemente. A técnica, limitada pela mortalidade associada à microinjeção de fêmeas adultas, leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração.
A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a pesquisa genômica funcional em organismos não-modelo, como moscas de areia. Modificado do sistema imunológico adaptativo em procariotes para defesa contra bacteriófagos15,16, o sistema CRISPR Cas9 foi rapidamente adaptado como uma ferramenta de edição de genomas para organismos eucarióticos superiores, incluindo insetos. O princípio da edição de genoma direcionada do CRISPR/Cas9 baseia-se na complementaridade de um único guia RNA (sgRNA) a um lócus genômico específico. A nuclease Cas9 se liga ao sgRNA e cria uma quebra de DNA de duas vertentes (dsDNA) no DNA genômico onde o sgRNA se associa à sua sequência complementar. O complexo Cas9-sgRNA é guiado à sequência de destino por 17 a 20 bases complementares no sgRNA para o lócus escolhido, o rompimento dsDNA pode então ser reparado por duas vias independentes: junção final nonhomologous (NHEJ) ou reparo direcionado à homologia (HDR)17. O reparo do NHEJ envolve um simples fechamento do intervalo, mas frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. A reparação de DNA através do HDR usa uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Insetos possuem ambas as máquinas.
A tecnologia CRISPR/Cas9 pode gerar mutações em um lócus escolhido, através da via de reparo NHEJ; ou para estratégias de edição de genomas mais complexas, como knock-ins ou repórteres de expressão, através da via HDR com um modelo de doador apropriado. Em moscas de areia, alelos mutantes nulos do fator de resposta imune Relish foram gerados através de CRISPR mediado por NHEJ em Phlebotomus papatasi4. Embriões de mosca de areia também foram injetados em outro estudo com uma mistura CRISPR/Cas9 visando a codificação genética Amarela. Ainda assim, nenhum adulto portador da mutação foi produzido18. Descrevemos aqui um método detalhado de mutagênese direcionada à mosca-da-areia pelo CRISPR/Cas9 mediado pela NHEJ, com um foco particular na microinjeção do embrião, um passo crítico do protocolo.

<table><tbody><tr><td>Papel de Filtro Preto 4.25CM PK100</td><td>VWR</td><td>28342-012</td><td>Corte em retângulos com aproximadamente 46 X 22mm. Estes são colocados entre a lâmina e a lamínula e atuam como uma camada de base úmida para os embriões durante a injeção.</td></tr><tr><td>Coverwashs</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecação</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para alinhar embriões</td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Camada de base da configuração de microinjeção Figura 2A</td></tr><tr><td>Gaiola de insetos</td><td>feita sob medida ou várias opções comerciais</td><td></td><td>gaiola de policarbonato para adultos segurando e acasalando Advogado, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. &ldquo; Colonização laboratorial e criação em massa de flebotomíneos (Diptera, Psychodidae)." Parasita 24. Acessado em 6 de agosto de 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Comida larval</td><td>feita</td><td></td> sob medida <td>uma mistura de ração de coelho e fezes de coelho Advogado, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. " Colonização laboratorial e criação em massa de flebotomíneos (Diptera, Psychodidae)." Parasita 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Microcaps 100 ml</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Usado para enchimento de agulhas de microinjeção</td></tr><tr><td>Aspirador de boca</td><td>John W. Hock Company</td><td>Modelo 612</td><td>aspirador de boca com filtro HEPA</td></tr><tr><td>Olympus SZX12</td><td>Olympus Life Sciences</td><td></td><td>Microscópio de microinjeção</td></tr><tr><td>Ovipots</td><td>Nalge company</td><td></td><td>ovipots são feitos de frascos de plolipropileno de 125 ml ou 500 ml de lados retos modificados por furos de 2,5 cm no fundo e preenchidos com 1 cm de gesso de Paris. Advogado, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. &ldquo; Colonização laboratorial e criação em massa de flebotomíneos (Diptera, Psychodidae)." Parasita 24. Acessado em 6 de agosto de 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Pincel 6-0</td><td>Qualquer Empresa de Suprimentos de Arte</td><td>n/a</td><td>Usado para alinhar embriões</td></tr><tr><td>Ácido propiônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>agente antifúngico</td></tr><tr><td>Capilares de vidro padrão</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td>Usado para fazer agulhas de microinjeção</td></tr><tr><td>Controlador Trio-MPC100 e Manipulador MP845</td> Controlador de Microinjeção <td>Sutter Instruments</td><td></td><td>e Micromanipulador</td></tr></tbody></table>

sand fly (phlebotomus papatasi) microinjeção de embrião para mutagenesis crispr/cas9

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Moscas de areia são os vetores naturais da espécie Leishmania, parasitas protozoários produzindo um amplo espectro de sintomas que vão desde lesões cutâneas até patologia visceral. Decifrar a natureza das interações vetor/parasita é de importância primária para uma melhor compreensão da transmissão de Leishmania aos seus hospedeiros. Entre os parâmetros que controlam a competência vetorial da mosca de areia (ou seja, sua capacidade de transportar e transmitir patógenos), parâmetros intrínsecos a esses insetos mostraram-se um papel fundamental. A resposta imune a insetos, por exemplo, impacta a competência vetorial da mosca da areia para a Leishmania. O estudo desses parâmetros tem sido limitado pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses organismos não-modelo. A baixa genética por RNA de pequena interferência (siRNA) é possível, mas além de ser tecnicamente desafiador, o silenciamento leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração. Mutagênese direcionada pela tecnologia CRISPR/Cas9 foi recentemente adaptada para a mosca de areia Phlebotomus papatasi. Essa técnica leva à geração de mutações transmissíveis em um lócus especificamente escolhido, permitindo estudar os genes de interesse. O sistema CRISPR/Cas9 conta com a indução de quebras de DNA de dois fios direcionados, posteriormente reparados por NHEJ (Non-Homólogos End Joining) ou por Homology Driven Repair (HDR). O NHEJ consiste em um simples fechamento da quebra e frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. Em contraste, o HDR usa a presença de uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Aqui, apresentamos um método de microinjeção de embriões de mosca de areia para mutagênese direcionada pelo CRISPR/Cas9 usando NHEJ, que é a única técnica de modificação do genoma adaptada aos vetores de mosca de areia até o momento.

O protocolo de microinjeção CRISPR/Cas9 descrito aqui para gerar mutantes de moscas de areia foi estabelecido em uma publicação anterior4. Essa abordagem produziu mutagênese altamente eficiente, já que 11 dos 540 indivíduos sobreviveram ao procedimento, dos quais 9 eram mutantes. Ao projetar guias para mutação CRISPR/Cas9, um primeiro passo crítico é sequenciar a região ao redor da área a ser alvo. O modelo para sequenciamento deve ser da cepa que será usada como fonte de embriões para injeção. É ...

Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

A mutagênese direcionada foi adaptada para flebotomíneos apenas recentemente e é uma técnica crucial para entender o papel e a função dos genes de interesse nesses insetos vetores. A microinjeção de embriões é uma etapa muito importante na edição do genoma do inseto, mas precisa ser adaptada às espécies com as quais você está trabalhando, no nosso caso, flebotomíneos. Em comparação com as outras espécies de insetos, os embriões de flebotomíneos são muito pequenos.Demoram muito para se desenvolver e são particularmente sensíveis ao nível de umidade. Cinco dias antes da injeção, o sangue alimenta os flebotomíneos fêmeas para manutenção de rotina da colônia. Um dia após a alimentação, capture as fêmeas alimentadas com sangue em vagens de gesso com uma porta lateral em grupos de 100 a 150 e alimente as moscas com uma solução de sacarose a 30%.No quinto dia após a alimentação com sangue, coloque um pedaço branco de papel de filtro úmido na câmara de postura. E use um aspirador bucal para coletar e transferir cerca de 10 fêmeas da vagem de gesso para a câmara de postura. Após 30 a 60 minutos, retire a placa de Petri e o papel de filtro da câmara de ovo.Cuidando disso, o papel de filtro permanece úmido e continua a coletar novos grupos de fêmeas e embriões ao longo desse período. Quando todos os embriões tiverem sido coletados, use um microscópio estéreo e um pincel muito fino para transferir cuidadosamente cerca de 50 embriões para pedaços individuais de papel de filtro preto úmido, coloque em lâminas de microscópio, cobertas com uma única lamínula por lâmina. Adicione água suficiente a cada papel de filtro para manter os embriões úmidos sem flutuar ou serem sugados sob as lamínulas e alinhe os embriões contra as lamínulas.Duas a três horas após o início da coleta de ovos, coloque uma lâmina sob um microscópio de dissecação e use o pincel para adicionar água cuidadosamente à extremidade traseira do papel de filtro. Carregue de volta 0,5 a um microlitros de injeção de carga misture em uma agulha de microinjeção e monte a agulha em um controlador de injeção pneumática, ajustado para 30 libras por polegada quadrada de pressão sob o microscópio. Pressione o gatilho para expelir o ar da ponta da agulha.Quando o ar for liberado, aumente lentamente a pressão de retenção. Quando o material de injeção começar a fluir, diminua a pressão de retenção até que esteja logo abaixo do ponto da mistura de injeção que flui da agulha e insira a agulha na lateral do primeiro embrião. Usando a lamínula atrás do embrião como um batente traseiro, aplique uma pequena quantidade de mistura de injeção no embrião antes de remover suavemente a agulha.Imediatamente após remover a agulha, pressione o injetor para remover qualquer material preenchido da ponta da agulha e prossiga para o próximo embrião. Quando todos os embriões tiverem sido injetados, conte o número de embriões injetados para manter uma contagem contínua e adicione água ao papel de filtro para que a lamínula flutue. Em seguida, use uma sonda para segurar o papel de filtro no lugar enquanto puxa a lamínula para longe dos embriões.E ele era papel de filtro para enxugar o excesso de água do escorregador. Transfira o papel de filtro para uma pilha de papel de filtro úmido em uma nova placa de Petri e transfira manualmente cada embrião para vagens de gesso umedecidas e pequenas, sem aglomeração. Em seguida, cubra as cápsulas com uma tela e armazene-as em uma incubadora de 26 graus a 70% de umidade.Tal como acontece com a maioria dos protocolos de microinjeção bem-sucedidos, uma boa agulha de microinjeção adequada aos embriões que estão sendo injetados é importante. Boas agulhas afiadas podem penetrar facilmente no embrião sem permitir que o material escape após a injeção. As agulhas puxadas não devem ter um cone muito longo.Caso contrário, o lúmen da agulha torna-se muito estreito para a maior parte do cone, dificultando a obtenção da pressão de injeção alta o suficiente para forçar o material através da agulha. Os embriões criados após a injeção que são saudáveis devem ser retidos, enquanto os embriões danificados contaminados, dessecados ou deformados por fungos devem ser descartados. Alelos mutantes potenciais podem ser identificados em indivíduos criados após a injeção por análise de PCR da região ao redor dos locais de corte esperados.Após o estabelecimento da linha mutante usando os embriões injetados, a genotipagem da PCR permite a identificação de cruzamentos homozigotos de irmãos mutantes. É essencial ter uma boa agulha para ser gentil e manipular e injetar os embriões. E para garantir que os embriões sejam hidratados durante todo o procedimento.A edição do genoma em algumas moscas está apenas começando. Essa técnica é realmente um primeiro passo que deve ser seguido por estratégias de modificação do genoma mais complexas.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

A mosca-das-frutas do Mediterrâneo Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) é uma praga mundial da agricultura. Uma compreensão mais profunda de sua biologia é fundamental para controlar as populações de moscas e, assim, reduzir o impacto econômico. A microinjeção de embriões é uma ferramenta fundamental que permite tanto a transformação da linha germinativa quanto os estudos genéticos reversos nesta espécie.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Microinjeção de Nasonia vitripennis embriões é um método essencial para gerar modificações hereditárias do genoma. Aqui descrito é um procedimento detalhado para microinjeção e transplante de embriões Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente a manipulação futura do genoma deste organismo.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

Este protocolo descreve procedimentos de microinjeção para embriões culex quinquefasciatus que são otimizados para trabalhar com ferramentas de edição de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica pode gerar eficientemente mutações de germes específicas, hereditárias e germinais que podem ser usadas para a construção de tecnologias genéticas neste vetor de doença subestudado.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

Aqui, descrevemos métodos para injeções pupais eficientes e adultas em Nasonia vitripennis como alternativas acessíveis à microinjeção de embriões, permitindo a análise funcional de genes de interesse usando RNA-silenciamento via interferência de RNA (RNAi) ou nocaute genético via edição de genoma CRISPR/Cas9.

Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis

Muitas características da eussocialidade dos insetos dependem da comunicação dentro da colônia e da divisão do trabalho. A manipulação genética de genes-chave reguladores em embriões de formigas via microinjeção e mutagênese mediada por CRISPR fornece insights sobre a natureza do comportamento altruísta em insetos eussociais.

Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

Trata-se de protocolos de coleta e microinjeção de embriões pré-celulares de cigarrinhas de milho com a finalidade de modificar seu genoma via edição genômica baseada em CRISPR/Cas9 ou para a adição de elementos transponíveis marcados por meio de transformação germinativa.

Microinjeção de cigarrinha de milho, Peregrinus maidis, Embriões para edição do genoma CRISPR/Cas9

Este trabalho apresenta os protocolos passo-a-passo para a mutagênese CRISPR/Cas9 da mosca da fruta oriental Bactrocera dorsalis. Passos detalhados fornecidos por este protocolo padronizado servirão como um guia útil para a geração de moscas mutantes para estudos de genes funcionais em B. dorsalis.

Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

Este artigo toma como exemplo a transgênese mediada por integrase phiC31 em Drosophila e apresenta um protocolo otimizado para microinjeção de embriões, uma etapa crucial para a criação de moscas transgênicas.

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Aprenda a técnica de microinjeção de embrião em flebotomíneos (Phlebotomus papatasi) para mutagênese CRISPR/Cas9. Este método permite editar genomas de vetores de doenças com precisão.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

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