Name: Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a induzir estresse oxidativo em células epiteliais de pigmento retiniano humano ARPE-19 usando H2O2 em pulso único. Este método avalia efeitos antioxidantes de proteínas PEDF e GM-CSF na degeneração neuroretinal.

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Os autores gostariam de agradecer a Gregg Sealy e Alain Conti pela excelente assistência técnica e prof. Zsuzsanna Izsvák do Centro Max-Delbrück em Berlim por fornecer gentilmente os plasmídeos pSB100X e pT2-CAGGS-Venus. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências suíça e pela Comissão Europeia no contexto do Sétimo Programa-Quadro. Z.I foi financiado pelo European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

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<li>Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+macular+carotenoid+lutein+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells.</a> Antioxidants. 6 (4), (2017).</li>
<li>Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+current+and+future+management+of+geographic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Review of current and future management of geographic atrophy.</a> Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).</li>
<li>Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Interventions+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Recent developments in age-related macular degeneration: a review.</a> Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).</li>
<li>Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+complement+membrane+attack+complex+in+dry+and+wet+AMD+-+From+hypothesis+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials.</a> Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).</li>
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<li>Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li>
<li>Alhasani, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gypenosides+protect+retinal+pigment+epithelium+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress.</a> Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).</li>
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<li>Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).</li>
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<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+the+ERK1%2F2+pathways+and+protects+injured+retinal+ganglion+cells+from+induced+death%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death.</a> Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+protects+rat+photoreceptors+from+death+by+activating+the+SRC-dependent+signalling+and+elevating+anti-apoptotic+factors+and+neurotrophins%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Archives+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins.</a> Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).</li>
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<li>Garcia-Garcia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+PEDF+release+in+rat+iris+and+retinal+epithelial+cells+after+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+and+neurogenic+activities+of+Sleeping+Beauty-mediated+PEDF-transfected+RPE+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+H2O2-%2C+HNE-%2C+or+tBH-treated+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).</li>
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<li>Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCP2%2C+a+mitochondrial+protein+regulated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo aqui apresentado oferece uma abordagem para analisar a função antioxidante e protetora do PEDF e GM-CSF produzido por células transfeinadas, que podem ser aplicadas a células transfeinadas com qualquer gene benéfico putativo. Em estratégias terapêuticas genéticas que têm o objetivo de fornecer proteínas ao tecido por meio do transplante de células geneticamente modificadas, é fundamental obter informações quanto ao nível de expressão proteica, à longevidade da expressão e à eficácia da proteína expressa em um...

O modelo descrito aqui, oferece uma abordagem útil para avaliar a eficiência dos agentes biofarmacêuticos para reduzir o estresse oxidativo nas células. Utilizamos o modelo para investigar os efeitos protetores do PEDF e do GM-CSF no estresse oxidativo mediado H2O2nas células epiteliais do pigmento retinal, que estão expostas a altos níveis de O2, luz visível, e a fagocitose das membranas do segmento externo fotoreceptor, gerando níveis significativos de espécies reativas de oxigênio (ROS)1, 2. São considerados um dos principais contribuintes para a patogênese da degeneração macular avascular relacionada à idade (aAMD)3,4,5,6,7,8. Além disso, há uma diminuição nos fatores neuroprotetores sintetizados por RPE, especificamente o fator derivado do epitélio pigmento (PEDF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs) e fator estimulante da colônia-colônia granucyte (GM-CSF) levando à disfunção e perda de células RPE, seguidos pela morte de células fotorreceptoras e gânglios da retina (RGC)3,4,5 . A AMD é uma doença complexa que resulta da interação entre fatores metabólicos, funcionais, genéticos e ambientais4. A falta de tratamentos para a AAMD é a principal causa de cegueira em pacientes com mais de 60 anos de idade em países industrializados9,10. A reconstituição do ambiente neuroprotetor e neurogênico da retina pelo transplante subretinal de células RPE geneticamente modificadas que superexpressam PEDF e GM-CSF tem o potencial de prevenir a degeneração da retina, mitigando os efeitos do estresse oxidativo, inibindo inflamação e apoiando a sobrevivência celular11,12,13,14,15,16 . Embora existam várias metodologias para entregar genes às células, escolhemos o sistema transposon da Bela Adormecida hiperativo não viral para entregar os genes PEDF e GM-CSF às células RPE por causa de seu perfil de segurança, a integração dos genes no genoma das células hospedeiras e sua propensão a integrar os genes entregues em locais não transcricionalmente, como mostramos anteriormente17, 18,19.
O estresse oxidativo celular pode ser induzido em células cultivadas in vitro por vários agentes oxidativos, incluindo peróxido de hidrogênio (H2O2),4-hidroynonenal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), altas tensões de oxigênio e luz visível (espectro completo ou irradiação UV)20,21. Altas tensões de oxigênio e luz requerem equipamentos e condições especiais, o que limita a transferência para outros sistemas. Agentes como H2O2,HNE e tBH induzem alterações moleculares e celulares por estresse oxidativo. Escolhemos H2O2 para testar a atividade antioxidante do PEDF e GM-CSF porque é conveniente e biologicamente relevante, pois é produzido por células RPE como um intermediário de oxigênio reativo durante a fagocitose do segmento externo fotoreceptor22 e é encontrado em tecidos oculares in vivo23. Como a oxidação da glutationa pode ser parcialmente responsável pela produção de H2O2 no olho, analisamos os níveis de GSH/glutationa em nossos estudos, que estão ligados ao estresse oxidativo induzido por H2O2e à capacidade regenerativa das células21,22. A análise dos níveis de glutationa é especialmente relevante, pois participa dos mecanismos de proteção antioxidantes no olho24. A exposição a H2O2 é utilizada com frequência como modelo para examinar a suscetibilidade ao estresse oxidativo e a atividade antioxidante das células RPE1,25,26,27,28,29,30, e, além disso, apresenta semelhanças com danos oxidativos induzidos pela luz, fonte "fisiológica" de estresse oxidativo21.
Para avaliar a funcionalidade e a eficácia dos fatores neuroprotetores, desenvolvemos um modelo in vitro que permite que a análise quantifique o efeito antioxidante dos fatores de crescimento expressos por células geneticamente modificadas para superexpressar o PEDF e o GM-CSF. Aqui, mostramos que as células RPE transfeminadas com os genes para PEDF e GM-CSF são mais resistentes aos efeitos nocivos de H2O2 do que são células de controle não transfectadas, como evidenciado pela morfologia celular, densidade, viabilidade, nível intracelular de glutationa e expressão do gene UCP2, que codifica a proteína mitocondrial de desacoplamento 2 que tem sido demonstrada para reduzir espécies reativas de oxigênio (ROS)31.

<table><tbody><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 poços</td><td>Greiner</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de 96 poços branca com fundo plano transparente&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3610</td><td>Permite verificar as células antes de medir a luminescência (GSH-Glo Assay)</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Acrilamida 40%</td><td>Biorad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>AMIMED</td><td>4-05F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GMCSF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PA5-24184</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo IgG/IgA/IgM&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PEDF&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-390172</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-penta-His&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fosfo-Akt</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coelho IgG H & L-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coelho de burro Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo de cabra Alexa 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>ARPE-19 linha celular</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>354118</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Duo Set ELISA kit</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>DY215-05</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>ELISAquant kit</td><td>BioProducts MD</td><td>PED613-10-Olhos Humanos</td><td></td></tr><tr><td>(humanos)</td><td>Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Montagem Aquosa Média</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega leitor de placas&nbsp;</td><td>Software BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (versão 8.0)</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH-Glo Ensaio de Glutationa</td><td>Promega</td><td>V6912</td><td></td></tr><tr><td>peróxido de hidrogênio (H2O2)</td><td>Software Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (programa de processamento de imagem)</td><td>W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, EUA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997&ndash; 2014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazol&nbsp;</td>Microscópio DMI4000B Leica <td>A1378.0010</td><td></td> <td>Axonlab</td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II&nbsp;</td><td>Software Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SW1.5.1</td><td>Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Axonlab</td><td>3468.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transfecção de Neon&nbsp;</td>Sistema de Transfecção de Neon <td>MPK5000</td><td></td> <td>da ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>10 &micro; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Câmara Neubauer</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelulose&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-3197</td><td></td></tr><tr><td>Omega Lum G Sistema de Imagem em Gel</td><td>Aplegen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quantabio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp;</td>Kit de Ensaio de Proteína BCA <td>Pierce Sigma-Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Primers ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td>Consulte a Tabela 1 em Materiais Suplementares</td></tr><tr><td>pSB100X (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td> <td>M &aacute; t&eacute; s et al., 2009. Fornecido pelo Prof. Zsuzsanna Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His DNA plasmidial (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td> <td>Construído usando o plasmídeo pT2-CMV-PEDF-EGFP existente relatado em Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td></tr><tr><td>DNA do plasmídeo pT2-CMV-PEDF-His (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td> <td>Construído usando o plasmídeo pT2-CMV-PEDF-EGFP existente relatado em Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>recombinante hGM-CSF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>hPEDF recombinante&nbsp; &nbsp;</td><td>BioProductsMD</td><td>004-096</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Miniprep de célula de RNA ReliaPrep</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td></td></tr><tr><td>Tampão RIPA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto DNase livre de RNase</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Applichem</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>Transferência semi-seca sistema para WB&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperMix qScript</td><td>Quantabio</td><td>95048-025</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com tris (TBS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>AppliChem&nbsp;</td><td>A1390</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL HRP substrato</td><td>Advansta</td><td>K-12045-D50</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose Whatman</td><td>Chemie Brunschwig</td><td>MNSC04530301</td><td></td></tr></tbody></table>

indução e análise do estresse oxidativo em células epiteliais de pigmento epitelial humano transposon-transfected da bela adormecida

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

O estresse oxidativo desempenha um papel crítico em várias doenças degenerativas, incluindo a degeneração macular relacionada à idade (AMD), uma patologia que afeta ~30 milhões de pacientes em todo o mundo. Leva a uma diminuição no epitélio do pigmento da retina (RPE)-fatores neuroprotetores sintetizados, por exemplo, fator derivado do epitélio pigmento (PEDF) e fator estimulante da colônia granutócito-macrófago (GM-CSF), seguido pela perda de células RPE, e eventualmente fotorreceptor e morte de células gânglios de retina (RGC). Temos a hipótese de que a reconstituição do ambiente neuroprotetor e neurogênico da retina pelo transplante subretinal de células RPE transfecidas que superexpressam PEDF e GM-CSF tem o potencial de prevenir a degeneração da retina, mitigando os efeitos do estresse oxidativo, inibindo inflamação e apoiando a sobrevivência celular. Usando o sistema transposon da Bela Adormecida (SB100X)as células RPE humanas foram transfectadas com os genes PEDF e GM-CSF e mostraram integração genética estável, expressão genética de longo prazo e secreção de proteínas usando qPCR, mancha ocidental, ELISA e imunofluorescência. Para confirmar a funcionalidade e a potência do PEDF e gm-CSF secretados pelas células RPE transfeinadas, desenvolvemos um ensaio in vitro para quantificar a redução do estresse oxidativo induzido por H2O2em células RPE na cultura. A proteção celular foi avaliada pela análise da morfologia celular, densidade, nível intracelular de glutationa, expressão genética UCP2 e viabilidade celular. Ambas as células RPE transfectadas que expressam o FPE e/ou GM-CSF e as células não transfetizadas, mas pré-tratadas com PEDF e/ou GM-CSF (comercialmente disponíveis ou purificadas de células transfetizadas) apresentaram proteção celular antioxidante significativa em comparação com controles não tratados. O atual modelo H2O2é uma abordagem simples e eficaz para avaliar o efeito antioxidante de fatores que podem ser eficazes para tratar a AMD ou doenças neurodegenerativas similares.

Indução do estresse oxidativo nas células epiteliais do pigmento da retina humana As células ARPE-19 e hRPE primária foram tratadas com concentrações variadas de H2O2 por 24 h e o nível intracelular da glutationa antioxidante foi quantificado(Figura 2A,B). H2O2 a 50 μM e 100 μM não afetaram a produção de glutationa, enquanto em 350 μM houve uma diminuição significativa da glutati...

Apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e uso de um modelo de estresse oxidativo, tratando células epiteliais de pigmento da retina com H2O2, analisando morfologia celular, viabilidade, densidade, glutationa e nível UCP-2. É um modelo útil para investigar o efeito antioxidante de proteínas secretadas por células transfeminadas transposon para tratar a degeneração neuroretinal.

Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

O modelo de peróxido de hidrogênio é uma abordagem simples e eficaz para avaliar os efeitos antioxidantes de fatores que podem ser úteis no tratamento da degeneração macular relacionada à idade ou doenças neurodegenerativas semelhantes. O agente oxidante, peróxido de hidrogênio, é fornecido em um único pulso, tornando-o mais rápido e simples de executar do que os modelos em que o tratamento com peróxido de hidrogênio deve ser repetido por vários dias. Como o número de células semeadas influencia o efeito oxidativo do tratamento, é importante contar as células cuidadosamente antes de sua cultura.Demonstrando o procedimento estará Thais Bascuas, pós-doutora do laboratório de Gabriele Thumann. Para a preparação do meio condicionado, 28 dias após a transfecção com PEDF, GM-CSF ou ambos, semeie os frascos T-75 da linha celular ARPE-19 humana de 500.000 células por mililitro de concentração completa do meio. Quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, substitua o sobrenadante por meio completo fresco e colete o novo sobrenadante após 24 horas.Para purificar as proteínas GM-CSF e PEDF marcadas com histidina, centrifugue o sobrenadante para eliminar as células remanescentes em potencial e reserve a amostra. Em seguida, adicione 30 microlitros de solução de níquel NTA a um tubo de 1,5 mililitro. Após a centrifugação, descarte o fluxo de níquel NTA e lave o pellet duas vezes com 200 microlitros de tampão de incubação 1X por lavagem.Após a segunda lavagem, ressuspenda o pellet em 40 microlitros de tampão de incubação 4X e 900 microlitros do meio centrifugado e condicionado. Incubar a solução do meio condicionado durante uma hora à temperatura ambiente e a 70 rotações por minuto. No final da incubação, centrifugue a amostra e lave o pellet duas vezes com 175 microlitros de incubação 1X por lavagem.Após a segunda lavagem, adicione 20 microlitros de tampão de eluição para uma incubação de 20 minutos a 70 rotações por minuto à temperatura ambiente. No final da incubação, centrifugue a amostra. Retirar o sobrenadante e quantificar a proteína total eluída pelo ensaio de proteína BCA de acordo com os protocolos padrão.Para o tratamento de células epiteliais pigmentares da retina não transfectadas com meio condicionado e peróxido de hidrogênio, semeie 3000 células em 200 microlitros de meio completo para cada poço de uma placa de 96 poços para incubação de 24 horas na incubadora de cultura de células. Na manhã seguinte, substitua os sobrenadantes por 200 microlitros de meio condicionado por poço e devolva as células às incubadoras de cultura de células por 10 dias. No dia 11 da cultura, trate as células com peróxido de hidrogênio 350 micromolar em meio completo por 24 horas.Para o tratamento de células RPE não transfectadas com PEDF purificado ou comercial e/ou GM-CSF, semear 3000 células em 200 microlitros de meio completo suplementado com 500 nanogramas por mililitro de PEDF recombinante e/ou 50 nanogramas por mililitro de recombinante para GM-CSF por poço para uma incubação de 48 horas na incubadora de cultura de células. No final da incubação, substituir os sobrenadantes por um meio completo contendo 350 peróxido de hidrogénio micromolar e 500 nanogramas por mililitro de PEDF e/ou 50 nanogramas por mililitro de GM-CSF por alvéolo durante 24 horas. Para o tratamento com peróxido de hidrogênio de células RPE transfectadas, cultive 5.000 células transfectadas em 200 microlitros de meio completo por poço por 24 horas na incubadora de cultura de células antes de tratar as células com peróxido de hidrogênio 350 micromolar, conforme demonstrado.Para medir os níveis de glutationa produzidos em células transfectadas que superexpressam PEDF e/ou GM-CSF, ou células não transfectadas pré-tratadas com fator de crescimento após o tratamento com peróxido de hidrogênio, substitua o sobrenadante em cada poço por 100 microlitros de mistura de reagentes 1X recém-preparada por poço e misture as células com uma mistura de reagentes por 14 segundos a 500 rotações por minuto em um agitador orbital. Após agitar, incube a placa em temperatura ambiente por 30 minutos antes de adicionar 100 microlitros de reagente de detecção de luciferina reconstituída a cada poço. Misturar a solução durante 15 segundos no agitador, seguido de uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente.No final da incubação, carregue a placa em um leitor de placas e selecione Alterar layout. Na guia Parâmetros básicos, a placa de 96 poços e a óptica superior devem ser selecionadas e o atraso de posicionamento deve ser definido como 0.1, a hora de início da medição como zero, o tempo do intervalo de medição como um e o tempo para normalizar os resultados como zero. Defina os espaços em branco, os padrões e as amostras e clique em Iniciar medição.Em seguida, exporte os dados como um arquivo de planilha e calcule a concentração de glutationa em cada amostra por interpolação da curva padrão. Para medir a viabilidade celular, substituir o sobrenadante em cada poço por 100 microlitros de meio completo suplementado com 1%FBS por poço, e colocar as células na incubadora de cultura celular até a análise. Depois de coletar células ARPE-19 não tratadas da cultura, ressuspenda as células a 100.000 células por mililitro em meio DMEM Hams F-12 suplementado com concentração de 1% de FBS.Em seguida, prepare sete diluições seriais 1:1 em 200 microlitros de meio suplementado com 1%FBS e transfira 100 microlitros de cada padrão para os poços apropriados de uma placa de 96 poços em duplicata. Adicione 50 microlitros de mistura de reagentes recém-preparada a todo o poço e misture as células com a mistura por 15 segundos no agitador antes de incubar a placa por 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, meça a luminescência conforme demonstrado.Após obter a medição, adicione 50 microlitros de reagente de lise a cada poço para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, depois meça a luminescência novamente e use a fórmula para calcular a porcentagem de células viáveis. 24 horas de tratamento com peróxido de hidrogênio 50 e 100 micromolares não afetam a produção intracelular de glutationa, enquanto uma diminuição significativa da glutationa é observada quando as células são tratadas com peróxido de hidrogênio 350-500 ou 700 micromolares concentração. Morfologicamente, as células tratadas com peróxido de hidrogênio parecem menos espalhadas e mais arredondadas com o aumento das concentrações do composto.Este efeito foi menos proeminente para células transfectadas por PEDF e GM-CSF tratadas com peróxido de hidrogênio. É importante notar que o número de células influencia o estresse oxidativo mediado pelo peróxido de hidrogênio, pois o nível de glutationa diminuiu estatisticamente significativamente após o tratamento com peróxido de hidrogênio em poços semeados com apenas 5.000 células. As células tratadas ou transfectadas para expressar PEDF e / ou GM-CSF produzem significativamente mais glutationa em comparação com as células de controle não tratadas em condições oxidativas.Além disso, o nível de expressão do gene UCP2 em células transfectadas por PEDF e GM-CSF é aumentado após o peróxido de hidrogênio, embora o aumento não seja estatisticamente significativo. A análise de Western blot de AKT fosforilada de um lisado de células transfectadas com GM-CSF expostas ao peróxido de hidrogênio mostra apenas uma pequena diminuição na fosforilização em comparação com as células de controle não tratadas, indicando que o GM-CSF pode proteger as células de danos causados pelo estresse oxidativo. É importante semear as células nas densidades corretas, usar solução fresca de peróxido de hidrogênio e adicionar proteínas frescas ao meio.Uma vez que o efeito antioxidante dos fatores de crescimento tenha sido corroborado usando o modelo de peróxido de hidrogênio, os fatores podem ser testados em um modelo de doença ocular relacionada ao estresse oxidativo. O atual modelo de estresse oxidativo de peróxido de hidrogênio permite avaliar os efeitos antioxidantes que diferentes fatores podem ter e, portanto, apoia o desenvolvimento de novas terapias gênicas.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Um método de triagem para detectar ambientes oxidativo celular é medir a oxidação do CM-H2DCFDA. Uma vez oxidada dentro de uma célula, CM-H2DCFDA muda de não-fluorescentes em um composto fluorescente. Esta mudança de fluorescência é medida por citometria de fluxo e indica o número de células em um ambiente oxidativo.

Ensaio de triagem para Estresse Oxidativo em uma linhagem de células Feline astrocitária, G355-5

Aqui relatamos um protocolo para medir o estresse oxidativo em embriões vivos de peixe-zebra. Este procedimento permite a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tecidos embrionários inteiros e populações unicelulares. Este protocolo realizará análises qualitativas e quantitativas.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

A luz de xenônio não coerente foi passada através de interferência de banda estreita e filtros de densidade neutra para fornecer luz de comprimento de onda e intensidade variados para células cultivadas. Este protocolo foi usado para avaliar os efeitos da terapia com luz vermelha / infravermelha próxima na produção de espécies reativas in vitro: nenhum efeito foi observado usando os parâmetros testados.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo In Vitro

Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

Desenvolvemos um protocolo para transfectar células epiteliais primárias de pigmento humano por eletroporação com o gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) usando o sistema de transposon da Bela Adormecida (SB). A transfecção bem-sucedida foi demonstrada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), immunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA).

Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

O presente protocolo descreve um método para detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) nos organoides murinas intestinais utilizando imagens qualitativas e ensaios quantitativos de citometria. Este trabalho pode ser potencialmente estendido a outras sondas fluorescentes para testar o efeito de compostos selecionados em ROS.

Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível à espécie de oxigênio reativa

Aqui, propomos um protocolo sistematizado, acessível e reprodutível para detectar espécies de oxigênio reativa celular (ROS) usando uma sonda diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) em células gliais Müller (MGCs). Este método quantifica os níveis ros celulares totais com um citómetro de fluxo. Este protocolo é muito fácil de usar, adequado e reprodutível.

Quantificação de espécies reativas de oxigênio usando 2′,7′-Sonda diacetato de diclorofluoresceína e flução-citometria em células gliais Müller

O estado metabólico das células epiteliais pigmentares da retina humana (H-RPE) reflete sua saúde e função. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para examinar o fluxo metabólico em tempo real de H-RPE usando respirometria de alta resolução.

Análise em Tempo Real da Bioenergética em Células Epiteliais Pigmentares Pigmentares Humanas Primárias Usando Respirometria de Alta Resolução

Apresentamos um novo dispositivo para medir as taxas de consumo de oxigênio (OCR) em culturas epiteliais pigmentares da retina (RPE). O dispositivo pode medir o OCR por semanas a fio em RPE cultivado em placas de cultura de células padrão com meio padrão, enquanto as placas estão em uma incubadora de cultura de células padrão.

Monitoramento de longo prazo das taxas de consumo de oxigênio em culturas epiteliais pigmentares retinianas altamente diferenciadas e polarizadas

Um método de identificação de condutores desconhecidos da carcinogénese, utilizando uma abordagem imparcial é descrito. O método utiliza...

Identificação de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR

Aprenda a induzir estresse oxidativo em células epiteliais de pigmento retiniano humano ARPE-19 usando H2O2 em pulso único. Este método avalia efeitos antioxidantes de proteínas PEDF e GM-CSF na degeneração neuroretinal.

Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida (Vídeo) | JoVE Journal

Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida

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