Name: Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a transfecção por eletroporação de células epiteliais de pigmento humano primário usando o Sistema Transposon Sleeping Beauty. Este método permite expressão estável de transgenes e secreção proteica para terapia gênica de doenças retinianas degenerativas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Sétimo Programa-Quadro de Investigação, Desenvolvimento Tecnológico e Demonstração da União Europeia, convenção de subvenção n.º 305134. Zsuzsanna Izsvák foi financiada pelo Conselho Europeu de Investigação, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Os autores gostariam de agradecer a Anna Dobias e Antje Schiefer (Departamento de Oftalmologia, Hospital Universitário RWTH Aachen) pelo excelente suporte técnico, e ao Aachen Cornea Bank (Departamento de Oftalmologia, Hospital Universitário RWTH Aachen) por fornecer os olhos do doador humano.

Os olhos dos doadores humanos foram obtidos do Aachen Cornea Bank do Departamento de Oftalmologia (Hospital Universitário RWTH Aachen) após a obtenção do consentimento informado de acordo com os protocolos da Declaração de Helsinque. Os procedimentos para a coleta e uso de amostras humanas foram aprovados pelo comitê de ética institucional.
1. Isolamento das células primárias de EPR humanas
<ol><li>Coloque roupas de proteção estéreis e luvas. Coloque uma cortina estéril sob um fluxo laminar.</li>
	<li>Coloque instrumentos de preparação estéreis e outros equipamentos estéreis necessários sob o fluxo laminar.</li>
	<li>Registre o recebimento dos globos oculares, o início da preparação, bem como possíveis anormalidades. Registre a idade do doador, sexo, causa da morte e o período entre o momento da morte e a remoção dos olhos.</li>
	<li>Coloque o globo ocular em uma compressa de gaze estéril e segure-o com uma mão.</li>
	<li>Separe o segmento anterior do segmento posterior por um corte circunferencial aproximadamente 3,5 mm posterior ao limbo usando um bisturi e uma tesoura ocular extra fina e pontiaguda.</li>
	<li>Depois de inclinar o segmento posterior para baixo, remova cuidadosamente o vítreo e a retina usando pinça colibri.</li>
	<li>Reorganize discretamente o complexo RPE/coroidea colapsado usando pinças retas da íris e, posteriormente, mantenha-o na posição com pinças curvas da íris.</li>
	<li>Encher o copo ocular posterior com 1 mL de Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix (DMEM/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina e 80 μg/mL de estreptomicina (Pen/Strep) e 2,5 μg/mL de anfotericina B (AmphoB). NOTA: Ao contrário do isolamento das células primárias de EPR de olhos de suínos ou bovinos36,37, o copo ocular posterior não precisa ser preenchido e incubado com tripsina.</li>
	<li>Colha as células RPE escovando suavemente o epitélio pigmentar da retina do nervo óptico em direção ao limbo com uma pipeta Pasteur de vidro curvo polido pelo fogo, enquanto fixa o complexo RPE/coroidea no limbo usando pinça colibri. Transfira a suspensão celular para uma placa de Petri.</li>
	<li>Repita os passos 1.8 e 1.9 e recolha todas as células da placa de Petri. Ressuspenda a suspensão da célula cuidadosamente pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta de canal único (100-1.000 μL).</li>
	<li>Sesite a suspensão celular RPE de cada globo ocular em três poços de uma placa de cultura celular de 24 poços e preencha-os até 1 mL com DMEM/F12 suplementado com FBS, Pen/Strep e AmphoB.</li>
	<li>Manter as culturas de células RPE a 37 °C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO2 até se atingir a confluência. Trocar o meio de cultura celular duas vezes por semana.</li>
</ol>2. Eletroporação de células primárias de PSE humano
<ol><li>Preparação da mistura de plasmídeo transposase SB100X /PEDF transposon plasmide
	<ol><li>Purificar a transposase SB100X e o DNA plasmidial transposon PEDF usando kits de purificação plasmídicos habituais, que são identificados como adequados para o uso em aplicações como transfecção, de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Quantificar o conteúdo de DNA plasmídico usando um espectrofotômetro de microvolume e ajustá-los a uma concentração de 250 ng/μL com Tris-HCl de 10 mM (pH 8,5).</li>
		<li>Misture uma porção de DNA plasmidial da transposase de 250 ng/ μL SB100X (por exemplo, 2,5 μL) com 16 porções de DNA plasmidial transposto PEDF 250 ng/μL (por exemplo, 40 μL). A mistura plasmídica residual pode ser armazenada a -20 °C. NOTA: Múltiplos ciclos repetidos de congelamento e descongelamento da mistura plasmídica devem ser evitados.</li>
		<li>Colocar 2 μL da mistura de plasmídeo transposase SB100X/PEDF transposon, contendo 29,4 ng de plasmídeo de transposase SB100X e 470,6 ng de plasmídeo transposon PEDF, num tubo de microcentrífuga de bloqueio seguro estéril de 1,5 ml. Manter no gelo até misturar com as células.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração do sistema de transfecção capilar NOTA: A eletroporação de células primárias de PSE humana foi realizada através de um sistema de transfecção capilar usando o kit de 10 μL de acordo com o protocolo do fabricante. O sistema compreende o dispositivo de transfecção, a pipeta de transfecção e a estação de pipeta. O kit contém pontas de transfecção de 10 μL, tubos tampão, tampão eletrolítico E (tampão E) e tampão de ressuspensão R (tampão R).<ol><li>Conecte a estação de pipeta ao dispositivo de transfecção.</li>
		<li>Encha um tubo tampão com 3 mL de tampão E e insira-o na estação de pipeta até que um som de clique seja ouvido. NOTA: Certifique-se de que o eléctrodo lateral do tubo tampão está ligado ao êmbolo de esferas laterais da estação de pipeta.</li>
		<li>Para a eletroporação de células RPE humanas primárias, defina as seguintes condições de pulso no dispositivo de transfecção: 1.100 V (tensão de pulso), 20 ms (largura de pulso), dois pulsos (número de pulso).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação das células primárias de EPR humanas cultivadas
	<ol><li>Documente a forma e a morfologia das culturas celulares primárias de PSE por microscopia de contraste de fase. Faça micrografias de baixa ampliação para demonstrar o crescimento das células RPE para uma monocamada confluente e integrada, bem como micrografias de maior ampliação para apontar a morfologia típica de paralelepípedos das células RPE.</li>
		<li>Aspirar o meio de cultura celular e lavar as células duas vezes com 1 mL de solução salina de fosfato tamponada (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Tripsinize células primárias de PSE humana com 0,5 mL de tripsina-EDTA a 0,05% a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2 por 7-15 min (máximo). Verifique o descolamento celular microscopicamente.</li>
		<li>Pare a tripsinização com 1 mL de DMEM/F12 suplementado com FBS. Tome uma alíquota de 20 μL para contagem de células usando um hemocitômetro. Centrifugar a suspensão da célula RPE a 106 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Misturar a alíquota de 20 μL com a solução azul de tripano de 20 μL. Pipetar 10 μL em cada metade do hemocitômetro e contar as células sob um microscópio de contraste de fase.</li>
		<li>Após centrifugação, ressuspender o pellet de células RPE em 1 mL de PBS.</li>
		<li>Pegue 10.000-100.000 células RPE por reação de transfecção e centrifuja-as a 106 x g por 10 min. NOTA: Além das reações de transfecção com aplicação de campo elétrico e adição de DNA plasmídico, cada abordagem também inclui duas culturas de controle diferentes: (1) sem aplicação de campo elétrico e sem DNA plasmídico; (2) com aplicação de campo elétrico, mas sem DNA plasmídico.</li>
		<li>Ressuspender o pellet celular em 11 μL de tampão R e combiná-lo com 2 μL da mistura plasmídica transposase/transposon PEDF SB100X (ver etapa 2.1.4). NOTA: Após a ressuspensão no tampão R, as células devem ser processadas dentro de 15 minutos para evitar uma redução na viabilidade celular e na eficiência da transfecção.</li>
		<li>Insira a cabeça da pipeta de transfecção na ponta de transfecção de 10 μL até que a braçadeira pegue totalmente a haste de montagem do pistão. Desenhe a solução celular/plasmídeo na ponta de transfecção. NOTA: Evite a geração de bolhas de ar e sua aspiração na ponta de transfecção.</li>
		<li>Fornecer 1 mL de DMEM/F12 suplementado com FBS, mas sem Pen/Strep e sem AmphoB, no número necessário de poços de uma placa de cultura celular de 24 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Processo de eletroporação
	<ol><li>Insira a pipeta de transfecção no tubo tampão colocado na estação de pipeta (ver passo 2.2.2) até que um som de clique seja ouvido. NOTA: Certifique-se de que a cabeça metálica da pipeta de transfecção está conectada ao êmbolo de esferas dentro da estação de pipeta e ao tubo tampão.</li>
		<li>Pressione Start (Iniciar ) na tela sensível ao toque do dispositivo de transfecção. Antes da aplicação do pulso elétrico, o dispositivo verifica automaticamente se o tubo tampão e a pipeta de transfecção estão inseridos corretamente. Após a entrega dos pulsos elétricos, o Complete é exibido na tela sensível ao toque.</li>
		<li>Retirar cuidadosamente a pipeta de transfecção da estação de pipeta e libertar imediatamente as células eletroporosas da ponta de transfecção de 10 μL, pipetando a solução celular/plasmide para os poços preparados da placa de cultura celular (ver passo 2.3.10).</li>
		<li>Manter culturas de células de PSE transfectadas a 37 °C em atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2. Adicione Pen/Strep e AmphoB com a primeira troca média 3 dias após a eletroporação.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análises de células primárias de EPR humanas transfectadas
<ol><li>Preparação da amostra
	<ol><li>Após um tempo de cultivo de 3 semanas, por fim, incubar as culturas de células de PSE em um volume definido de 1,0 mL de DMEM/F12 suplementado com FBS, Pen/Strep e AmphoB por um tempo definido de 24 h.</li>
		<li>Pegue os sobrenadantes da cultura celular e armazene-os a -20 °C até processamento próximo do tempo ou a -80 °C para amostras termicamente instáveis e armazenamento a longo prazo.</li>
		<li>Tripsinize culturas de células RPE transfectadas com 0,5 mL de tripsina-EDTA a 37 °C a 37 °C em atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO2 por 10 min.</li>
		<li>Pare a tripsinização com 1 mL de DMEM/F12 suplementado com FBS. Tome pequenas alíquotas para a contagem de células usando um hemocitômetro (ver etapa 2.3.5). Centrifugar as suspensões de células RPE a 106 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Conservar os pellets de células RPE a -80 °C até processamento posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação da secreção de PEDF por western blotting NOTA: Para uma avaliação qualitativa, os sobrenadantes da cultura celular (ver passo 3.1.2) são analisados através de eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e subsequente western blotting. Dependendo do PEDF transposon plasmide DNA usado, os sobrenadantes têm que ser processados de forma diferente.<ol><li>Purificação de proteínas de fusão PEDF marcadas com His a partir de sobrenadantes de cultura celular
		<ol><li>Colher 30 μL de pasta de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) por amostra, utilizando uma ponta cortada em chanfro, e repeltar a resina Ni-NTA por centrifugação (2.660 x g durante 30 s).</li>
			<li>Ressuspender cuidadosamente a resina Ni-NTA com 200 μL de tampão de incubação 1x (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) e pellet-la por centrifugação (2.660 x g por 30 s).</li>
			<li>Repita a etapa anterior.</li>
			<li>Ressuspender cuidadosamente a resina Ni-NTA com tampão de incubação 40 μL 4x (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0) por amostra.</li>
			<li>Misturar 900 μL de sobrenadante de cultura celular com 260 μL de tampão de incubação 4x e 55 μL de pasta de Ni-NTA pré-tratada (ver passo 3.2.1.4).</li>
			<li>Incubar a mistura num agitador de balanço à temperatura ambiente durante 60 min.</li>
			<li>Pellet a resina Ni-NTA por centrifugação (2660 x g por 60 s).</li>
			<li>Ressuspender cuidadosamente a resina Ni-NTA com 175 μL de tampão de incubação 1x e resina pellet por centrifugação (2.660 x g por 60 s).</li>
			<li>Repita a etapa anterior.</li>
			<li>Ressuspender cuidadosamente a resina Ni-NTA com 30 μL de tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) e incubar a mistura num agitador de balanço à temperatura ambiente durante 20 minutos.</li>
			<li>Pellet a resina Ni-NTA por centrifugação (2.660 x g por 30 s).</li>
			<li>Pegue cuidadosamente o sobrenadante e misture-o com 2x buffer de amostra SDS47.</li>
			<li>Aqueça a mistura a 95 °C durante 5 min e separe as proteínas purificadas por Ni-NTA num gel de poliacrilamida SDS a 10%.</li>
			<li>Realizar western blotting utilizando anticorpos anti-Penta-His (monoclonal de camundongo, 1:500) e anticorpos anti-camundongo conjugados com peroxidase de rábano (HRP) (policlonal de coelho, 1:1.000) conforme descrito anteriormente36,37.</li>
		</ol></li>
		<li>Análise direta de proteínas PEDF não marcadas
		<ol><li>Pegue 15 μL de sobrenadante de cultura celular e misture-o com 2x buffer de amostra SDS47.</li>
			<li>Aquecer a mistura a 95 °C durante 5 min e separar as proteínas num gel de poliacrilamida SDS a 10%.</li>
			<li>Realizar western blotting usando anticorpos anti-PEDF humanos (policlonal de coelho, 1:4.000) e anticorpos anti-coelho conjugados com HRP (policlonal de cabra, 1:2.000), conforme descrito anteriormente38.</li>
		</ol></li>
		<li>Quantificação da secreção de PEDF por ELISA
		<ol><li>Analise os sobrenadantes da cultura celular (ver etapa 3.1.2) usando um kit PEDF ELISA humano de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
			<li>Relacionar a quantidade de PEDF secretado com o tempo e o número de células determinado para cada reação de transfecção (ver etapa 3.1.4).</li>
		</ol></li>
		<li>Análise da expressão gênica do PEDF em células RPE transfectadas
		<ol><li>Isolar o ARN total dos pellets de células RPE (ver passo 3.1.5) utilizando um kit comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
			<li>Quantifique o conteúdo de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume.</li>
			<li>Realizar a transcrição reversa em 0,1 μg de RNA usando um sistema de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
			<li>Execute qPCR em tempo real, conforme descrito anteriormente38.</li>
		</ol></li>
		<li>Análise dos sítios de inserção transgênica em células RPE transfectadas
		<ol><li>Isolar o ADN genómico dos pellets de células RPE (ver passo 3.1.5) utilizando um kit comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
			<li>Quantifique o conteúdo de DNA usando um espectrofotômetro de microvolume.</li>
			<li>Gerar bibliotecas de sites de inserção usando um esquema de PCR hemi-específico assistido por computação, conforme descrito anteriormente38.</li>
			<li>Realizar análise computacional conforme descrito anteriormente38.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Zoltán Ivics e Zsuzsanna Izsvák são inventores de várias patentes sobre a tecnologia de transposição SB

Em nosso projeto, visamos a produção não viral de células primárias geneticamente modificadas de PSE humanas que continuamente superexpressam e secretam um fator eficaz, a fim de usar as células transfectadas como terapêuticas de longo prazo para o estabelecimento e manutenção de um ambiente protetor. Estabelecemos a introdução do gene que codifica o PEDF, uma proteína multifuncional onipresente e expressa com funções antiangiogênicas e neuroprotetoras. O protocolo descrito aqui pode ser usado para transfectar de forma e...

A idade avançada é descrita como o principal risco para doenças neurodegenerativas. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma doença poligênica que leva à perda de visão grave em pacientes com mais de 60 anos de idade, pertence às quatro causas mais comuns de cegueira e deficiência visual1 e espera-se que aumente para 288 milhões de pessoas em 20402. Disfunções do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma única camada de células bem compactadas localizadas entre o coriocapilar e os fotorreceptores da retina, contribuem para a patogênese da DMRI. O PSE cumpre múltiplas tarefas que são essenciais para uma função retiniana normal3 e secreta uma variedade de fatores de crescimento e fatores essenciais para manter a integridade estrutural da retina e do coriocapilar, apoiando assim a sobrevivência dos fotorreceptores e fornecendo uma base para a circulação e o fornecimento de nutrientes.
Em olhos saudáveis, o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) é responsável por equilibrar os efeitos do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e protege os neurônios contra a apoptose, previne a proliferação de células endoteliais e estabiliza o endotélio capilar. Uma relação VEGF-para-PEDF deslocada está relacionada à neovascularização ocular, o que foi observado em modelos animais4,5, bem como em amostras de pacientes com neovascularização da coroide (NVC) por DMRI e retinopatia diabética proliferativa 6,7,8,9,10 . A concentração aumentada de VEGF é o alvo para o tratamento padrão atual. Os fármacos anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept e, mais recentemente, brolucizumab melhoram a acuidade visual em cerca de um terço dos pacientes com NVC, ou melhor, estabilizam a visão em 90% dos casos11,12,13. No entanto, as injeções intravítreas frequentes, muitas vezes mensais, acarretam o risco de eventos adversos14, prejudicam a adesão do paciente e representam um ônus econômico significativo para os sistemas de saúde15. Além disso, certa porcentagem de pacientes (2%-20%) não responde ou apenas reage mal à terapia anti-VEGF16,17,18,19. Esses concomitantes negativos requerem o desenvolvimento de tratamentos alternativos, por exemplo, implantes intraoculares, abordagens terapêuticas celulares e/ou genéticas.
A terapia gênica tem evoluído como tratamento promissor para doenças hereditárias e não hereditárias e pretende restaurar sequências gênicas não funcionais ou suprimir as de mau funcionamento. Para doenças poligênicas, onde a identificação e a substituição dos fatores causadores dificilmente são possíveis, as estratégias visam a entrega contínua de um fator protetor. No caso da DMRI, várias terapias aditivas têm sido desenvolvidas, como a expressão estável de endostatina e angiostatina20, o antagonista do VEGF solúvel fms-like tirosina quinase-1 (sFLT-1)21,22, o cluster de proteínas reguladoras do complemento de diferenciação 59 (CD59)23 ou o PEDF 24,25 . O olho, e especialmente a retina, é um excelente alvo para uma medicação baseada em genes devido à estrutura fechada, boa acessibilidade, tamanho pequeno e privilégio imunológico, permitindo assim uma entrega localizada de baixas doses terapêuticas e tornando os transplantes menos suscetíveis à rejeição. Além disso, o olho permite o monitoramento não invasivo, e a retina pode ser examinada por diferentes técnicas de imagem.
Os vetores virais são, devido à sua alta eficiência de transdução, o principal veículo para entregar genes terapêuticos nas células-alvo. Entretanto, dependendo do vetor viral utilizado, diferentes reações adversas têm sido descritas, como respostas imunes e inflamatórias26, efeitos mutagênicos e oncogênicos 27,28 ou disseminação em outros tecidos29. As limitações práticas incluem um tamanho de embalagem restrito30, bem como dificuldades e custos associados à produção de lotes de grau clínico31,32. Essas desvantagens promoveram o desenvolvimento de vetores não virais, baseados em plasmídeos, que são transferidos via lipo / poliplexos, ultrassom ou eletroporação. No entanto, a integração genômica do transgene no genoma do hospedeiro geralmente não é promovida com vetores plasmídicos, resultando em uma expressão transitória.
Transposons são fragmentos de DNA de ocorrência natural que mudam sua posição dentro do genoma, uma característica que foi adotada para a terapia gênica. Devido a um mecanismo de integração ativa, os sistemas vetoriais baseados em transposon permitem uma expressão contínua e constante do transgene inserido. O transposon da Bela Adormecida (SB), reconstituído a partir de um antigo transposon do tipo Tc1/marinheiro encontrado em peixes33 e melhorado pela evolução molecular resultando na variante hiperativa SB100X34, possibilitou uma transposição eficiente em várias células primárias e foi utilizado para a correção fenotípica em diferentes modelos de doenças35. Atualmente, 13 ensaios clínicos foram iniciados usando o sistema de transposição SB . O sistema de transposon SB100X consiste em dois componentes: o transposon, que compreende o gene de interesse ladeado por repetições invertidas terminais (TIRs), e a transposase, que mobiliza o transposon. Após a entrega do DNA plasmídico às células, a transposase se liga aos TIRs e catalisa a excisão e a integração do transposon no genoma da célula.
Desenvolvemos uma terapia aditiva não viral baseada em células para o tratamento da DMRI neovascular. A abordagem compreende a inserção baseada em eletroporação do gene PEDF em células epiteliais pigmentares primárias (PE) por meio do sistema de transposon SB100X 36,37,38. A informação genética da transposase e do PEDF é fornecida em plasmídeos separados, permitindo assim o ajuste da razão de transposição ideal SB100X-para-PEDF. A eletroporação é realizada usando um sistema de transfecção capilar baseado em pipeta que é caracterizado por um tamanho de folga maximizado entre os eletrodos, minimizando sua área de superfície. O dispositivo demonstrou atingir excelentes taxas de transfecção em uma ampla gama de células de mamíferos 39,40,41. A pequena área de superfície do eletrodo proporciona um campo elétrico uniforme e reduz os vários efeitos colaterais da eletrólise42.
A funcionalidade antiangiogênica do PEDF secretado por células epiteliais pigmentares transfectadas foi demonstrada em vários experimentos in vitro analisando a brotação, migração e apoptose de células endoteliais da veia umbilical humana43. Além disso, o transplante de células transfectadas por PEDF em um modelo de neovascularização corneana de coelho44 e em um modelo de rato de CNV43,45,46 mostrou declínio da neovascularização.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a inserção estável do gene PEDF em células primárias de EPR humanas através do sistema de transposon SB100X usando um sistema de transfecção capilar. As células transfectadas foram mantidas em cultura por 21 dias e, posteriormente, analisadas em termos de expressão gênica de PEDF por reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR) e em termos de secreção de proteína PEDF por imunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA, Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Isolamento de células primárias de RPE humanas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-Well Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td>0030722019</td><td></td></tr><tr><td>anfotericina B [250 &micro; g/mL] (AmphoB)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Colibri</td><td>Geuder, Heidelberg, Alemanha</td><td>G-18950</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Íris Curvada&nbsp;</td><td>Geuder, Heidelberg, Alemanha</td><td>G-18856</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Descartável (Nº 11)</td><td>Pena, Osaka, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Olho Extra Fino e Pontiagudo&nbsp;</td><td>Geuder, Heidelberg, Alemanha</td><td>G-19405</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino [0.2 &micro; m Filtrado Estéril] (FBS)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipetas</td><td>Marca, Wertheim, Alemanha</td><td>747715</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina [10.000 unidades/mL] e Estreptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta (1000 &micro; L)</td> <td>Starlab, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de canal único (100-1000 &micro; L)</td> <td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campo estéril</td><td>Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressa de Gaze Estéril&nbsp;</td><td>Fink-Walter, Merchweiler, Alemanha</td><td>321063</td><td></td></tr><tr><td>Luvas Estéreis</td><td>Sempermed, Wien, Áustria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Estéril (Falcon 60 mm x 15 mm)</td> <td>Corning, Corning, NY</td><td>351007</td><td></td></tr> Bata <tr><td>Cirúrgica Estéril</td><td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Íris Reta&nbsp;</td><td>Geuder, Heidelberg, Alemanha</td><td>G-18855</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporação de células RPE humanas primárias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 12 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td>0030722019</tr><tr><td>Anfotericina B [250 &micro; g/mL] (AmphoB)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock (1.5 mL)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino [0.2 &micro; m Filtrado Estéril] (FBS)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Alemanha</td> Espectrofotômetro de Microvolume <td>Leica DMi8</td><td></td></tr><tr><td>(Espectrofotômetro NanoDrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transfecção Capilar (Sistema de Transfecção de Néon)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td>MPK5000</tr><tr><td>Sistema de Transfecção Neon 10 &micro; L Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro (Câmara Neubauer)</td><td>Paul Marienfeld, Lauda-K&ouml; nigshofen, Alemanha</td><td>0640110</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco sem Ca2+ sem Mg2+</td><td>Biochrom, Berlim, Alemanha</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina [10.000 unidades/mL] e Estreptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta (10 &micro; L)</td><td>Starlab, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta (1000 &micro; L)</td><td>Starlab, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (200 &micro; L)</td><td>Starlab, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit Maxi de Plasmídeo</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de Canal Único (0.1-10 &micro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de canal único (100-1000 &micro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de canal único (10-200 &micro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução Azul de Tripano</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Análises de células RPE humanas primárias transfectadas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Tampão de incubação (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Tampão</td><td></td><td></td><td></td>de amostra SDS</tr><tr><td>4x Tampão de incubação (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran Suportado 0.2 &micro; m&nbsp; Membrana de Nitrocelulose</td><td>Cytiva, Marlborough, MA</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B [250 &micro; g/mL] (AmphoB)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos Anti-PEDF (Policlonal de Coelho)</td><td>BioProducts, Middletown, MD</td><td>AB-PEDF1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos Anti-Penta-His (Monoclonal de Camundongo)</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio/Presunto' s Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha</td><td>P04-41150</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino [0,2 &micro; m Filtrado Estéril] (FBS)</td><td>PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro (Câmara de Neubauer)</td><td>Paul Marienfeld, Lauda-K&ouml; nigshofen, Alemanha</td><td>0640110</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anti-camundongo conjugados com peroxidase de rábano (policlonal de coelho)</td><td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anti-coelho conjugados com peroxidase de rábano (policlonal de cabra)</td><td>Abcam, Cambridge, Reino Unido</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA PEDF Humano&nbsp;</td><td>BioProducts, Middletown, MD</td><td>PED613</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 Imaging System</td><td>Fujifilm, Minato, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 1.2 Instrument</td><td>Roche Life Science, Penzberg, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td><td>Roche Life Science, Penzberg, Alemanha</td><td>12239264001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&nbsp; Capilares (20 &mu; l)</td> <td>Roche Life Science, Penzberg, Alemanha</td><td>4929292001</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de Microvolume (Espectrofotômetro NanoDrop)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Módulo de Fundição de Tetra Células</td><td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha</td><td>1658015</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Célula de eletroforese vertical Tetra para mini géis pré-moldados, 4 géis</td><td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina [10.000 unidades/mL] e estreptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (10 &micro; L)</td><td>Starlab, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta (1000 &micro; L)</td><td>Starlab, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (200 &micro; L)</td> <td>Starlab, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação Básica PowerPac</td><td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transcrição Reversa</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto DNase livre de RNase</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Shaker</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, Reino Unido</td> Tubos de Microcentrífuga <td>SSM3</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock (1.5 mL)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock (2.0 mL)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de Canal Único (0.1-10 &micro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de canal único (100-1000 &micro; L)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de canal único (10-200 &micro; L)</td> <td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transferência Turbo Trans-Blot</td><td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemanha</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Solução Azul de Tripano</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

modificação genética baseada em eletroporação de células epiteliais de pigmento humano primário usando o sistema transposon da bela adormecida

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Nossa sociedade cada vez mais envelhecida leva a uma incidência crescente de doenças neurodegenerativas. Até o momento, os mecanismos patológicos são inadequadamente compreendidos, impedindo assim o estabelecimento de tratamentos definidos. Terapias genéticas aditivas baseadas em células para o aumento da expressão de um fator protetor são consideradas uma opção promissora para medicar doenças neurodegenerativas, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Desenvolvemos um método para a expressão estável do gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF), que é caracterizado como uma proteína neuroprotetora e antiangiogênica no sistema nervoso, no genoma das células epiteliais primárias do pigmento humano (PE) usando o sistema transposon da Bela Adormecida (SB). As células primárias de EP foram isoladas dos olhos do doador humano e mantidas em cultura. Após atingir a confluência, 1 x 104 células foram suspensas em 11 μL de tampão de ressuspensão e combinadas com 2 μL de uma solução purificada contendo 30 ng de plasmídeo de transposase SB hiperativo (SB100X) e 470 ng de plasmídeo transposon PEDF . A modificação genética foi realizada com um sistema de eletroporação capilar utilizando os seguintes parâmetros: dois pulsos com tensão de 1.100 V e largura de 20 ms. As células transfectadas foram transferidas para placas de cultura contendo meio suplementado com soro fetal bovino; antibióticos e antimicóticos foram adicionados com a primeira troca média. A transfecção bem-sucedida foi demonstrada em experimentos realizados de forma independente. A reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR) mostrou o aumento da expressão do transgene PEDF . A secreção de PEDF foi significativamente elevada e permaneceu estável, avaliada por imunoblotting, e quantificada por ensaio imunoenzimático (ELISA). A transferência mediada por SB100X permitiu uma integração estável do gene PEDF no genoma das células PE e garantiu a secreção contínua de PEDF, o que é crítico para o desenvolvimento de uma terapia de adição genética baseada em células para tratar a DMRI ou outras doenças degenerativas da retina. Além disso, a análise do perfil de integração do transposon do PEDF em células de EP humanas indicou uma distribuição genômica quase aleatória.

Cultivo e eletroporação de células primárias de EPR humanas Mostramos que a semeadura de um número suficiente de células primárias de EPR de origem animal permite o cultivo e o crescimento para uma monocamada integrada de células pigmentadas de forma hexagonal36,37,48. Sua capacidade de formar junções apertadas, exibir atividade fagocítica e expressar genes marcadores específi...

Desenvolvemos um protocolo para transfectar células epiteliais primárias de pigmento humano por eletroporação com o gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) usando o sistema de transposon da Bela Adormecida (SB). A transfecção bem-sucedida foi demonstrada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), immunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA).

Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Este método demonstra a transfecção baseada em eletroporação de células epiteliais primárias de pigmento humano usando o Sistema de Transposon da Bela Adormecida, uma evidência para a expressão transgênica e secreção de proteínas. A combinação do Sistema de Transposon da Bela Adormecida e da eletroporação permite a transfecção eficiente de células epiteliais primárias de pigmento humano, bem como a expressão transgênica estável e persistente e a secreção de proteínas. O objetivo geral é estabelecer uma terapia de adição genética baseada em células para o tratamento de doenças degenerativas da retina, que requer secreção estável e persistente da proteína terapeuticamente ativa.Demonstrando o procedimento estarão Anne Freialdenhoven e Antje Schiefer, assistentes médicos técnicos do laboratório. Para preparar o DNA plasmídico para a eletroporação primária de células RPE humanas, use um espectrofotômetro de microvolume para quantificar o conteúdo de DNA plasmídico e ajuste a concentração para 250 nanogramas por microlitro em Tris-HCL 10 milimolares. Misture um volume de 250 nanogramas por microlitro de DNA plasmídico da transposase SB100X com 16 volumes de 250 nanogramas por microlitro de fator derivado do epitélio pigmentar transposon DNA plasmídico.Adicione dois microlitros da mistura de plasma resultante em um tubo de microcentrífuga de bloqueio seguro estéril de 1,5 mililitros no gelo e encha um tubo tampão com três mililitros de buffer E.Em seguida, insira o tubo na estação de pipeta até que um clique seja ouvido e defina o dispositivo de transfecção para 1, 100 volts, uma largura de pulso de 20 milissegundos e dois pulsos. Para preparar as células para eletroporação. Primeiro, verifique a morfologia das culturas primárias de células de PSE via microscopia de contraste de fase para avaliar seu crescimento e confluência.Trate as células com 500 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA por poço por sete a 15 minutos na incubadora de cultura celular. Quando as células tiverem se desprendido, coletem as células por centrifugação, ressuspenda as células em um mililitro de PBS e centrifugar de uma a 10 vezes 10 para as quatro alíquotas celulares por reação de transfecção. Ressuscite os pellets em 11 microlitros de tampão R por tubo e adicione dois microlitros da mistura plasmídica preparada a cada tubo.Insira a cabeça de uma pipeta de transfecção em uma ponta de transfecção de 10 microlitros até que a braçadeira pegue totalmente a haste de montagem do pistão e carregue a célula e a solução plasmídica na ponta de transfecção. Insira a pipeta de transfecção no tubo tampão colocado dentro da estação de pipeta até que um clique seja ouvido e pressione start para iniciar o processo de eletroporação. Após a transfecção, remova cuidadosamente a pipeta de transfecção da estação de pipeta e imediatamente pipete a célula e a solução plasmídica para os poços preparados da placa de cultura celular.Para purificar suas proteínas de fusão de fator derivado do epitélio pigmentar de sobrenadantes de cultura de células RPE. Primeiro, use uma ponta de corte chanfrado para coletar uma alíquota de 30 microlitros de pasta NTA de níquel por amostra e pellet a resina NTA de níquel por centrifugação. Ressuscite cuidadosamente a resina NTA de níquel com 200 microlitros de tampão de incubação One X e retire a solução com uma centrifugação adicional duas vezes.Após a segunda centrifugação, ressuscite cuidadosamente os pellets de resina NTA de níquel com 40 microlitros de tampão de incubação Four X por amostra. Em seguida, misture 55 microlitros de uma alíquota de pasta de níquel NTA pré-tratada com 260 microlitros de tampão de incubação Four X e 900 microlitros de cada sobrenadante de cultura de células RPE transefcted. Incubar a mistura num agitador de balanço à temperatura ambiente durante 60 minutos e repeltar as misturas de resina NTA de níquel.Ressuscite cuidadosamente os pellets em 175 microlitros de tampão de incubação One X e centrifugar as misturas mais duas vezes. Após a segunda centrifugação, ressuspenda cuidadosamente os pellets de resina NTA de níquel em 30 microlitros de tampão de eluição por uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente com agitação e centrifugação das amostras novamente. Em seguida, colete cuidadosamente os sobrenadantes e misture-os com o tampão de amostra Two X SDS para análise do sangue ocidental das proteínas purificadas.Células primárias de PSE cultivadas isoladas de olhos de doadores humanos demonstram uma morfologia típica de paralelepípedos, independentemente da idade do doador, tempo post-mortem de isolamento ou tempo de cultivo. A aplicação de pulsos elétricos de curto prazo a células primárias de EPR humanas. O uso do sistema de transfecção capilar não afeta negativamente a morfologia epitelial.A análise sanguínea ocidental de sobrenadantes primários transfectados de cultura de células de PSE humana demonstram secreção de fator derivado do epitélio pigmentar em níveis consistentes sem silenciamento transgênico por mais de 500 dias. Como observado nesta análise sanguínea ocidental representativa do meio de cultura celular de transfecções realizadas em série, uma taxa de secreção de fator derivado do epitélio pigmentar universalmente maior é observada em 21 dias após a transfecção. Em uma cultura seguida, a secreção elevada de PEDF a longo prazo dura pelo menos 165 dias.Além disso, a quantificação baseada em ELISA revela um aumento de 20 vezes da secreção do fator derivado do epitélio pigmentar total em células RPE humanas primárias transfectadas em comparação com as respectivas células de controle não transfectadas. Esse incremento também foi afirmado no nível de expressão gênica em que a expressão total do PEDF foi aumentada mais de 30 vezes. Ao tentar este protocolo, é importante usar células epiteliais pigmentares cuja morfologia corresponda ao status In Vivo.Além disso, lembre-se de extrair a solução celular na ponta de transfecção sem bolhas de ar. As células transfectadas de forma estável podem ser usadas em diferentes modelos Ex Vivo ou In vivo para verificar a funcionalidade desta terapia de adição de genes baseada em células.

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A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

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Um método eficiente em Vitro transposição por um sistema de beleza dormindo Transcriptionally regulado empacotado em um vetor de Lentivirus defeituoso de integração

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

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Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida (Vídeo) | JoVE Journal

Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

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