Name: Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a modelar o câncer de mama em tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico. Este método mantém o tecido vivo ex vivo, permitindo estudar interações entre tecido e câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer ao Núcleo de Citometria de Fluxo de Tulane e ao Núcleo de Triagem celular, bem como ao Núcleo de Histologia de Tulane pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Sudeste de Cirurgiões Plásticos & Reconstrutivos 2019 Research Grant e pela National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Todos os tecidos humanos foram coletados de acordo com o protocolo #9189 aprovados pelo Gabinete do Conselho de Revisão Institucional do LSUHSC.
1. Semeadura de Células-Tronco Derivadas de Adipose (ASCs) para folhas de células
<ol><li>Comprar ASCs de fontes comerciais ou isolar do tecido mamário humano primário seguindo os protocolos estabelecidos8,9. ASCs de mama humana com 70% de densidade (~80.000 células/cm2 superfície) em placas de cultura de tecido padrão de 6 poços no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de soro bovino fetal, e 1% Penicillin/Streptomicina (BC-MPS Media). Certifique-se de que os ASCs a serem utilizados para formar as folhas de células devem ser inferiores à passagem 10.<ol>
<li>Para cada poço do sistema microfisiológico do câncer de mama (BC-MPS) que será gerado, células de sementes em 1 cultura de tecido padrão bem e 1 poço de tamanho semelhante em poli (N-isopropylacrylamida) (pNIPAAm)-coated tissue culture plastic plate. Uma placa de 6 poços de BC-MPS exigirá uma cultura de tecido padrão 6 placas de poço (inferior) e uma placa revestida pNIPAAm (superior). As placas pNIPAAm podem ser adquiridas de fontes comerciais ou podem ser revestidas em laboratório10,11,12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AsCs de cultura em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO2. Mude a mídia a cada 2-3 dias em um armário de biossegurança.</li>
	<li>Cultuem os ASCs até se tornarem 100% confluentes e formam um padrão estriado. Dependendo da confluência em que foram semeados, isso levará de 7 a 10 dias. As folhas de células confluentes são necessárias para ancorar o tecido mamário adiposo flutuante.</li>
</ol>2. Preparação dos suprimentos necessários para o BC-MPS
<ol><li>Para preparar a gelatina para placas de 6 poços faça uma solução de gelatina de 12% em H2O. Misture 19 g de gelatina tipo B (resistência ao gel de ~225 Bloom) e 125 mL de H2O em uma garrafa de mídia de vidro de 250 mL. Adicione 1,6 mL de 1 M NaOH à solução para neutralizar o pH.</li>
	<li>Autoclave a solução sob um ciclo líquido por 25 minutos para esterilizar a solução.</li>
	<li>Deixe a solução esfriar a 37 °C. Em um gabinete de biossegurança estéril adicione 16 mL de solução de sal balanceada Hanks (HBSS) para a solução para obter um volume final de 160 mL. NOTA: A solução de gelatina pode ser usada imediatamente ou armazenada à temperatura ambiente para uso posterior. A gelatina preparada é estável à temperatura ambiente por 1 mês. Se apenas alguns êmbolos forem necessários, então uma solução de 10 mL pode ser feita e filtrada estéril no mesmo dia que a fabricação de BC-MPS como descrito anteriormente7.<ol>
<li>Para preparar a solução de gelatina por esterilização de filtro, diluir 1 mL de HBSS 10x com 9 mL de H2O para fazer uma solução 1x HBSS em um tubo cônico de 15 mL. Adicione 100 μL de 1 M NaOH a cada tubo de 10 mL e, em seguida, adicione 0,7 g de gelatina à solução. Misture a solução vigorosamente para dissolver a gelatina.</li>
		<li>Incubar o tubo em um banho de água de 75 °C por 20 minutos tremendo a cada 5 minutos. Use uma seringa de 10 mL e um filtro de seringa de 0,22 μm para filtrar a solução de gelatina. Filtre a solução de gelatina diretamente nos êmbolos em um armário de biossegurança.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impressão 3D ou use acrílico simples para fazer os êmbolos usados para transferir as folhas de celular. Certifique-se de que os êmbolos se encaixam livremente no tamanho desejado do poço. Um êmbolo impresso 3D padrão é mostrado na Figura 1. Os desêntos podem ser projetados usando software de design auxiliado por computador padrão, como o TinkerCad e impressos usando impressoras 3D de filamento compatíveis com ácido polilático (PLA)13,14.</li>
	<li>Para preparar um rack para segurar os êmbolos coloque um rack de tubo de 15 mL em um armário de biossegurança. Coloque os êmbolos de cabeça para baixo no rack, de modo que a parte inferior dos êmbolos esteja voltada para cima. Coloque uma caixa de plástico com tampa para transportar BC-MPS no armário de biossegurança. Recomenda-se que a caixa tenha pelo menos 35,5 cm de comprimento x 28 cm de largura x 8,25 cm de altura para caber 4 placas de BC-MPS. Retire a tampa da caixa e pulverize o rack, os êmbolos e a caixa com 70% de EtOH.</li>
	<li>Prepare lâminas de barbear estéreis e fórceps autoclavando ou colocando-as em um armário de biossegurança e lavando com 70% de EtOH.</li>
	<li>Pulverize os êmbolos e a caixa com 70% de EtOH e ligue a luz UV no armário de biossegurança por pelo menos 30 minutos para esterilizar os suprimentos.</li>
</ol>3. Prepare os despensos de gelatina e aplique nas folhas de células superiores
<ol><li>Se a solução de gelatina foi previamente preparada, aqueça-a em um banho de água de 37 ° C para derretê-la.</li>
	<li>Pipeta a solução de gelatina sobre os êmbolos no armário de biossegurança usando uma pipeta sorológica de 5 ou 10 mL. Um êmbolo para 1 poço de uma placa de 6 poços exigirá ~2,5 mL de gelatina.</li>
	<li>Uma vez que a gelatina tenha solidificado nos êmbolos (~30-45 min) mova as placas ASC revestidas de pNIPAAm para o armário de biossegurança. Coloque suavemente os êmbolos nos poços das placas ASC revestidas de pNIPAAm para que a gelatina entre em contato com os ASCs. Coloque uma arruela metálica (~7,5 g) no êmbolo para pesar o êmbolo para que a gelatina esteja em contato direto com a folha de células ASC. Deixe os êmbolos nas folhas de células ASC em temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
	<li>Mova suavemente a placa com os êmbolos para dentro da caixa estéril no armário de biossegurança e coloque a tampa sobre ela. Mova a caixa para uma geladeira de 4 °C por 30 minutos. Se não estiver disponível uma geladeira de 4 °C, coloque a placa no gelo em um balde de gelo no armário de biossegurança por 30 minutos.</li>
</ol>4. Preparação de linhas celulares cancerosas
<ol><li>Semente as linhas de células cancerígenas em um prato padrão de cultura de tecido T75 e mantê-los na cultura para que eles sejam ~80% confluentes no dia em que BC-MPS será processado. (~200.000 células cancerígenas serão necessárias por BC-MPS). Cresça as células cancerígenas na mídia normal. NOTA: Para identificar e isolar as células cancerígenas recomenda-se que as células sejam transfeinadas com uma proteína fluorescente para distingui-las das ASCs e do tecido mamário. O número de células cancerígenas necessárias por BC-MPS foi otimizado para células MCF7 e MDA-MB-231. Outras linhas celulares podem exigir maior otimização.</li>
	<li>No dia em que o BC-MPS está sendo preparado mova o frasco contendo as células cancerígenas para o armário de biossegurança. Aspire a mídia do frasco. Lave o frasco com 5 mL de PBS.</li>
	<li>Adicione 1 mL de solução de descolamento celular ao frasco contendo as células cancerosas e, em seguida, incubar o frasco em uma incubadora de 37 °C até que as células se despeçam (~2-5 min).</li>
	<li>No gabinete de biossegurança adicione 9 mL de PBS ao frasco, transfira as células em PBS para um tubo cônico de 15 mL e conte o número da célula usando um hemótmetro.</li>
	<li>Centrifugar as células cancerígenas a 500 x g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Resuspende as células em mídia BC-MPS para que haja 2 x 106 células/mL.</li>
	<li>Coloque as células cancerígenas em um banho de água de 37 °C até que estejam prontas para serem adicionadas ao tecido humano.</li>
</ol>5. Processamento do tecido mamário humano
<ol><li>Em um armário de biossegurança lave o tecido mamário humano (HBT) 3x com 10 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Use fórceps estéreis e uma lâmina de barbear para cortar grosseiramente o BC-MPS e tentar remover o máximo de fáscia e tecido conjuntivo possível. A não remoção do tecido conjuntivo pode resultar na camada superior ASC para não ancorar adequadamente o HBT. NOTA: A fáscia e o tecido conjuntivo podem ser identificados por sua aparência branca ou clara em comparação com a cor amarela do tecido adiposo.</li>
	<li>Uma vez que o tecido conjuntivo tenha sido removido use uma lâmina de barbear estéril para picar finamente o tecido até que tenha uma consistência líquida homogênea. O tecido é finamente picado quando pode ser facilmente pipetado usando uma ponta sorológica de 25 mL.</li>
	<li>Use uma lâmina de barbear estéril para cortar a ponta de uma ponta de pipeta p1000 para ajudar na pipetação do HBT picado.</li>
	<li>Em um tubo de 1,5 mL misture o HBT picado, as linhas celulares cancerosas e a mídia BC-MPS (para 1 poço de uma placa de 6 poços isso requer 200 μL de HBT picado, 100 μL de mídia BC-MPS e 100 μL de células cancerosas).</li>
	<li>Mova a placa ASC que será usada para a folha de célula inferior da incubadora para o armário de biossegurança. Aspire a mídia da placa ASC inferior. Pipeta a mistura no centro do poço da placa ASC inferior usando uma ponta de pipeta p1000 que teve a extremidade distal cortada da etapa 5.4</li>
	<li>Mova a caixa contendo a placa ASC superior com os êmbolos sobre ele para o armário de biossegurança. Retire delicadamente os êmbolos de gelatina da placa revestida pNIPAAm e coloque em cima da mistura HBT. Adicione mídia BC-MPS ao poço (para 1 poço de uma placa de 6 poços adicione 2 mL de mídia). Mova cuidadosamente as placas ASC inferiores com a mistura BC-MPS e os desentupidores para a caixa de plástico estéril e coloque a tampa da caixa para transporte. NOTA: A tampa da placa de 6 poços não caberá de volta na placa ASC enquanto os êmbolos estiverem ligados. Deve-se tomar cuidado para evitar contaminar a cultura.</li>
	<li>Incubar a placa inferior da caixa em uma incubadora a 37 ° C até que a gelatina tenha derretido, e a camada superior asc tenha começado a aderir à camada inferior (~30 min).</li>
	<li>Mova a caixa com as placas para o armário de biossegurança. Remova suavemente os êmbolos das placas inferiores. O tecido com as células cancerosas será ancorado no fundo do poço.</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de 6 poços de volta na placa inferior e incubar a 37 °C para derreter completamente a gelatina e permitir que a camada superior ancorue completamente para a camada inferior (~30-60 min).</li>
	<li>Mova suavemente as placas para um armário de biossegurança e aspire a mídia com uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 2 mL de mídia fresca a cada poço. Aspire da borda do poço e pipeta para a borda do poço para evitar desalojar o tecido.</li>
	<li>Mantenha o BC-MPS a 37 °C e 5% de CO2 pelo tempo desejado e mude a mídia a cada 2-3 dias.</li>
</ol>6. Digestão do BC-MPS para análise
<ol><li>Quando o BC-MPS estiver pronto para ser analisado, mova a placa para o gabinete de biossegurança. Remova a mídia com uma pipeta sorológica para evitar a desalojadeira acidental de qualquer tecido.</li>
	<li>Adicione 1 volume de PBS a cada poço.</li>
	<li>Remova o PBS com uma pipeta sorológica.</li>
	<li>Adicione 1 mL de solução de dissociação celular a cada poço. Mova a placa de volta para a incubadora e incubar a 37 °C por 5 minutos para permitir que as células se desprendem. Em um armário de biossegurança, use um raspador de células para desprender completamente as células e o tecido da placa de cultura.</li>
	<li>Transfira a solução com o tecido para um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta sorológica. Adicione 2 mL de PBS a cada poço para coletar quaisquer células restantes e transfira esta solução para o tubo cônico. Se as células forem fluorescentes, enrole o tubo em papel alumínio para protegê-lo da luz.</li>
	<li>Incubar o tubo a 37 °C sob agitação constante em um agitador orbital a 1 x g por 10-20 min para dissociar completamente as células do tecido.</li>
	<li>Em um armário de biossegurança use uma pipeta sorológica para interromper quaisquer aglomerados restantes de células no tubo e filtrar a amostra através de um coador de tecido de 250 μm em um novo tubo de 15 mL. Pipeta a solução lentamente através do coador para que não transborde.</li>
	<li>Enxágüe o coador com 1 mL PBS para coletar todas as células ainda no coador.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 500 x g em temperatura ambiente por 5 minutos. Após a centrifugação, os adipócitos estarão flutuando na camada superior da solução, enquanto as células cancerosas e ASCs serão misturadas em uma pelota na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Para isolar os adipócitos despeje suavemente a camada superior em um novo tubo ou, alternativamente, corte a ponta de uma ponta de pipeta p1000 e transfira a camada superior para um novo tubo. Centrifugar a amostra a 500 x g por 5 minutos novamente e usar uma seringa e agulha para remover a solução de baixo dos adipócitos para que apenas os adipócitos permaneçam. Os adipócitos estão prontos para análise</li>
	<li>Após remover os adipócitos da solução, separe as ASCs e as células cancerosas umas das outras para análise se as células cancerígenas foram previamente transfeinadas com uma proteína fluorescente. Aspire a solução restante do tubo contendo as ASCs e células cancerosas sem interromper a pelota celular. Resuspenque a pelota na mídia PBS ou BC-MPS e use citometria de fluxo para classificar as células com base na fluorescência.</li>
</ol>

<ol><li>DeSantis, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Breast cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).</li>
<li>NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx">https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx</a> (2020).</li>
<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Biostatistics%22%5BJournal%5D)">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).</li>
<li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institutes+of+Health+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1(2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+tumors+educate+the+proteome+of+stromal+tissue+in+an+individualized+but+coordinated+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner.</a> Science Signaling. 10 (491), (2017).</li>
<li>Lau, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwiched+white+adipose+tissue%3A+A+microphysiological+system+of+primary+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).</li>
<li>Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microphysiologic+platform+for+human+fat%3A+sandwiched+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909(2018).</li>
<li>Yu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adipose-Derived+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells.</a> Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).</li>
<li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+Isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+%27smart%27+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Physics+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).</li>
<li>Lin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+onto+microtextured+poly%28dimethylsiloxane%29+for+aligned+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li>
<li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+Construction+of+a+multicellular+3D+scaffold+for+the+delivery+of+layered+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).</li>
<li>Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tinkercad%22">Tinkercad</a>. , (2020).</li>
<li>Halfter, K., Mayer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+3D+tumor+models+to+the+clinic+-+predictive+value+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine.</a> Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+adipocytes+stimulate+breast+cancer+invasion+through+metabolic+remodeling+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+insight%22%5BJournal%5D)">Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells.</a> JCI insight. 2 (4), 87489(2017).</li>
<li>Qiu, B., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY+493%2F503+staining+of+neutral+lipid+droplets+for+microscopy+and+quantification+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry.</a> Bio-Protocols. 6 (17), 1912(2016).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy%2C+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration.</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion%2Fdetachment+control%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li>
<li>Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Belgodere, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+breast+cancer+microenvironments+and+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+and+lipid+metabolism+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).</li>
<li>Dirat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+exhibit+an+activated+phenotype+and+contribute+to+breast+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion.</a> Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).</li>
<li>Druso, J. E., Fischbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+of+extracellular+matrix%3A+Linking+obesity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).</li>
<li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts%3A+A+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li>
<li>Chandler, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+adipose+progenitor+cells+as+physicochemical+regulators+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).</li>
<li>Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+components+in+breast+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis.</a> The Breast. 22, 66-72 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+1A1+%28COL1A1%29+promotes+metastasis+of+breast+cancer+and+is+a+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target.</a> Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).</li>
<li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li>
<li>Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+use+of+differentiated+adipose-derived+stem+cells+and+mature+adipocytes+to+model+adipose+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).</li>
<li>Zimta, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+links+between+central+obesity+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular links between central obesity and breast cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364(2019).</li>
<li>Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+promotes+the+expansion+of+metastasis-initiating+cells+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 104(2018).</li>
<li>Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-adipose+tissue+crosstalk%3A+fuelling+tumour+metastasis+by+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485(2018).</li>
<li>Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).</li>
<li>Sabol, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+produced+by+obesity-altered+adipose+stem+cells+promotes+metastasis+but+not+tumorigenesis+of+triple-negative+breast+cancer+in+orthotopic+xenograft+and+patient-derived+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models.</a> Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67(2019).</li>
<li>Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human adipose tissues.</a> Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).</li>
<li>Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-on-a-chip+and+body-on-a-chip+systems+for+drug+screening+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling.</a> Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).</li>
<li>Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+microphysiological+tissue+systems+of+cancer+metastasis+to+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2020).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Novos sistemas de modelagem do câncer de mama humano são necessários para desenvolver uma melhor compreensão da doença. O desenvolvimento de sistemas microfisiológicos humanos para modelar ambientes de doenças que incluem ECM nativo e células estromais aumentará o poder preditivo dos estudos pré-clínicos. O modelo BC-MPS aqui apresentado é um sistema recém-desenvolvido que supera as limitações dos modelos anteriores permite a avaliação do BC em seu ambiente HBT nativo. Este sistema pode ser usado com linhas de células ca...

Todos os anos, mais de 40.000 mulheres norte-americanas morrem de câncer de mama (BC)1. Apesar de mais de US$ 700 milhões investidos em pesquisa do BC anualmente, 97% dos medicamentos candidatos do BC reprovam os ensaios clínicos2,3. Novos modelos são necessários para melhorar o pipeline de desenvolvimento de medicamentos e nosso entendimento do BC. O Programa De Microfisiológico (MPS) do NIH delineou os recursos necessários para modelos inovadores para melhorar a tradução da ciência básica para o sucesso clínico4. Estes incluíram o uso de células ou tecidos humanos primários, estáveis na cultura por 4 semanas, e inclusão da arquitetura de tecido nativo e resposta fisiológica.
Os modelos atuais in vitro BC, como a cultura bidimensional das linhas celulares BC, a cocultura de inserção de membrana e esferoides tridimensionais e organoides, não atendem aos critérios de MPS do NIH porque nenhum desses recapitulam a arquitetura do tecido mamário nativo. Quando a matriz extracelular (ECM) é adicionada a esses sistemas, o ECM mamário não é utilizado; em vez disso, géis de colágeno e matrizes de membrana de porão são usados.
Os sistemas in vivo atuais, como os xenoenxertos derivados da paciente (PDX), da mesma forma não atendem aos critérios de MPS do NIH, pois os tecidos mamários murinas diferem muito das mamas humanas. Além disso, as interações do sistema imunológico-BC são cada vez mais reconhecidas como chave no desenvolvimento do tumor, mas os modelos de murina imunocomprometidos usados para gerar tumores PDX carecem de células T maduras, células B e células assassinas naturais. Além disso, enquanto o PDX permite que os tumores primários de mama sejam mantidos e expandidos, os tumores PDX resultantes são infiltrados com células estromais murinas primárias e ECM5.
Para superar esses desafios, desenvolvemos um mps de mama humano novo, ex vivo, tridimensional que atende aos critérios do NIH MPS. A base do mps da mama é feita por sanduíche de tecido mamário humano primário (HBT) entre duas folhas de células-tronco derivadas de adipose (ASCs), também isoladas do HBT(Figura 1). Os êmbolos para transferir as folhas de celular para sanduíche o HBT podem ser impressos em 3D ou feitos de simples plásticos acrílicos(Figura 1H,I). Esta técnica adapta nossa abordagem previamente descrita para a cultura do tecido adipócito branco humano primário6,7. A MPS mamária pode então ser semeada por um modelo de escolha BC, que vai desde linhas celulares padrão BC até tumores primários de mama humana. Aqui, mostramos que esses BC-MPS estão estáveis na cultura por várias semanas(Figura 2); incluem elementos nativos do HBT, tais como adipócitos mamários, ECM, endotélio, células imunes(Figura 3); e recapitular as interações fisiológicas entre BC e HBT, como crosstalk metabólico(Figura 4). Por fim, mostramos que o BC-MPS permite o estudo do movimento ameboide das células BC ao longo do HBT (Figura 5).

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>1333</td><td>Solução de desacoplamento celular para separação de BC-MPS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>Solução de descolamento celular para passagem de células</td></tr><tr><td>Recipiente BioStor 16oz</td><td>National Scientific Supply Co</td><td>MPCE-T016</td><td>Para transporte de tecido estéril Cultura de</td></tr> células <tr><td>75 cm frascos</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Para a cultura de</td></tr><tr><td>ASCs Tubos Cônicos 15mL&nbsp;</td><td>Pinça Curva ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoScientific</td><td>1631T5</td><td>Para manobrar tecido enquanto pica&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM baixa glicose, com Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td>Para cultura de ASCs e BC-MPS</td></tr><tr><td>FBS Qualificado</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Nunc UpCell 6 placas de poços</td><td>ThermoScientific</td><td>174901</td><td>Top Folha de células ASC</td></tr><tr><td></td><td>PBS Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep 5,000U</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 150 cm</td><td>FisherBrand</td><td>FB0875714</td><td>Para segurar o tecido enquanto pica&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâminas de Barbear</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>Borda Única para Filtro de Tecido</td></tr><tr><td>250um&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>87791</td><td>Para separação de placas de 6 poços para cultura de tecidos BC-MPS</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3506</td> Pesos/arruelas <td>de folha de célula ASC inferior</td></tr><tr><td></td><td>Fixadores</td><td>BCP BCP672</td><td>Para pesar êmbolos de 1/2" de diâmetro interno</td></tr></tbody></table>

modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

O câncer de mama (BC) continua sendo a principal causa de morte das mulheres. Apesar dos mais de US$ 700 milhões investidos em pesquisas do BC anualmente, 97% dos medicamentos candidatos do BC falham em testes clínicos. Portanto, novos modelos são necessários para melhorar nossa compreensão da doença. O programa NIH Microphysiological Systems (MPS) foi desenvolvido para melhorar a tradução clínica de descobertas científicas básicas e prometendo novas estratégias terapêuticas. Aqui apresentamos um método de geração de MPS para câncer de mama (BC-MPS). Este modelo adapta uma abordagem previamente descrita de tecido adiposo branco humano primário (WAT) por sanduíche wat entre folhas de células-tronco derivadas de adipose (ASC)s. Novos aspectos do nosso BC-MPS incluem a semeadura de células BC em tecido mamário humano não doente (HBT) contendo matriz extracelular nativa, adipócitos maduros, fibroblastos residentes e células imunes; e sanduíches a mistura BC-HBT entre folhas ASC derivadas do HBT. O BC-MPS resultante é estável na cultura ex vivo por pelo menos 14 dias. Este sistema de modelo contém múltiplos elementos do microambiente que influenciam o BC, incluindo adipócitos, células estromais, células imunes e a matriz extracelular. Assim, o BC-MPS pode ser usado para estudar as interações entre o BC e seu microambiente. 
Demonstramos as vantagens do nosso BC-MPS ao estudar dois comportamentos bc conhecidos por influenciar a progressão do câncer e a metástase: 1) motilidade bc e 2) conversa cruzada metabólica BC-HBT. Embora a motilidade bc tenha sido anteriormente demonstrada usando imagens intravitais, o BC-MPS permite imagens de lapso de tempo de alta resolução usando microscopia de fluorescência ao longo de vários dias. Além disso, enquanto o crosstalk metabólico foi previamente demonstrado usando células BC e pré-adipócitos murinas diferenciadas em adipócitos imaturos, nosso modelo BC-MPS é o primeiro sistema a demonstrar esse crosstalk entre adipócitos mamários primários e células BC in vitro.

Estabilidade na cultura BC-MPS é um sistema microfisiológico estável que pode ser cultivado in vitro por pelo menos 14 dias. Uma imagem de campo brilhante das folhas de células ASC foi tirada em ampliação de 100x para exibir o padrão estriado da folha de confluentes(Figura 2A). As folhas de células ASC estão estáveis na cultura por pelo menos 4 semanas. BC-MPS aos 14 dias de cultura em um poço de uma placa de 6 poços foi imagens com uma câ...

Este protocolo descreve a construção de um sistema microfisiológico in vitro para o estudo do câncer de mama usando tecido mamário humano primário com materiais fora da prateleira.

Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Este é o primeiro protocolo que permite que o tecido mamário humano seja mantido vivo ex vivo por períodos prolongados de tempo permitindo diretamente o estudo das interações entre tecido mamário humano e câncer de mama humano. A principal vantagem dessa técnica é que permite que pedaços macroscópicos do tecido mamário humano, incluindo adipócitos mamários, células imunes, estruturas vasculares, estruturas ductais e matriz extracelular sejam mantidos vivos ex vivo. Essa técnica tem grandes implicações para diversas áreas da pesquisa sobre câncer de mama, incluindo medicina personalizada, desenvolvimento farmacêutico e fisiopatologia de iniciação tumoral e processos mais lentos de câncer de mama, como fibrose e remodelação da matriz extracelular.Demonstrando este procedimento estão Katherine Hebert, uma estudante de pós-graduação de Tulane e Rakesh Gurrala uma estudante de medicina tulane do meu laboratório. Para começar, derreta a solução de gelatina preparada em um banho de água de 37 graus Celsius. Use uma pipeta sorológica de cinco ou 10 mililitros para distribuir 2,5 mililitros desta solução em cada êmbolo para poços de uma placa de seis poços.Uma vez que a gelatina tenha se solidificado, mova as placas ASC codificadas pNIPAAm para o armário de biosegurança. Coloque delicadamente os êmbolos nos poços dessas placas para que a gelatina entre em contato com as ASCs. Coloque uma arruela metálica no êmbolo para pesá-la para que a gelatina esteja em contato direto com a folha ASC por 30 minutos em temperatura ambiente.Mova suavemente a placa com os êmbolos para dentro da caixa estéril no armário de biosegurança e coloque a tampa sobre ela. Mova a caixa para uma geladeira de quatro graus ou coloque a placa no gelo e um balde de gelo no armário de biosegurança por 30 minutos. Em um armário de biosegurança, lave o tecido mamário humano três vezes com 10 mililitros de PBS estéreis.Use fórceps estéreis e uma lâmina de barbear para cortar grosseiramente o BC-MPS e tentar remover o máximo de fáscia e tecido conjuntivo possível. Uma vez que o tecido conjuntivo tenha sido removido use uma lâmina de barbear estéril para finalmente picar o tecido até que tenha uma consistência líquida homogênea. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P1000 para ajudar na pipetação do tecido picado.Em um tubo de 1,5 mililitro, combine o tecido mince, as linhas celulares cancerígenas e a mídia BC-MPS, conforme descrito no manuscrito do texto. Mova a placa ACS que será usada para a folha de célula inferior da incubadora para o gabinete de biosegurança e aspire a mídia da placa. Pipeta a mistura de tecido mamário preparada no centro do poço da placa ACS inferior usando a ponta de pipeta cortada, mova a caixa contendo a placa ACS superior com êmbolos para o armário de biosegurança.Remova suavemente os êmbolos de gelatina da placa revestida pNIPAAm e coloque-os em cima da mistura de tecido. Adicione a mídia BC-MPS ao poço e mova cuidadosamente as placas ACS inferiores com a mistura BC-MPS e os desentupidores para a caixa de plástico estéril. Coloque a tampa da caixa para o transporte, tomando cuidado para evitar a contaminação da cultura.Incubar a placa inferior na caixa e na incubadora de 37 graus Celsius até que a gelatina seja derretida e a camada acs superior tenha começado a aderir à camada inferior. Em seguida, mova a caixa com as placas para o armário de biosegurança, remova suavemente os êmbolos das placas inferiores para observar o tecido com as células cancerígenas ancoradas na parte inferior do poço. Coloque a tampa da placa de seis poços de volta na placa inferior e incubar a 37 graus para derreter completamente a gelatina e permitir que a camada superior ancore até a camada inferior.Mova suavemente as placas para um armário de biosegurança e aspire a mídia da borda do poço com uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Adicione dois mililitros de mídia fresca na borda de cada poço para evitar desalojar o tecido. Mantenha o BC-MPS a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono pelo tempo desejado.Mudando a mídia a cada dois ou três dias. Mova a placa para o gabinete de biosegurança quando o BC-MPS estiver pronto para ser analisado. Remova a mídia com uma pipeta sorológica para evitar a desalojadeira acidental de qualquer tecido.Adicione um volume de PBS a cada poço. Em seguida, remova o PBS com uma pipeta sorológica. Adicione um mililitro da solução de dissociação celular a cada poço e mova a placa de volta para a incubadora por cinco minutos para permitir que essas células se desprendem.Após a incubação, use um raspador de células para desprender completamente as células e o tecido da placa de cultura em um armário de biosegurança. Transfira a solução com o tecido para um tubo cônico de 15 mililitros e colete todas as células restantes adicionando dois mililitros de PBS. Enrole o tubo com papel alumínio se as células estiverem fluorescentes.Incubar o tubo a 37 graus sob agitação constante em um agitador orbital a uma hora G por 10 a 20 minutos para dissociar completamente as células do tecido. Em um armário de biosegurança, use uma pipeta sorológica para interromper qualquer aglomerado restante de células no tubo. E filtrar a amostra através de um coador de tecido de 250 mímetros em um novo tubo de 15 mililitros.Enxágüe o coador com um mililitro de PBS para coletar quaisquer células restantes. Centrifugar as amostras a 500 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos para separar os adipócitos que estarão flutuando na camada superior das células cancerosas e ASCs misturados em uma pelota. Transfira a camada de adipócito para um novo tubo usando uma ponta de pipeta de corte sem corte.Centrifugar a amostra novamente e usar uma seringa e uma agulha para remover a solução restante de baixo dos adipócitos. Aspire a solução restante do tubo contendo as ASCs e células cancerosas sem interromper a pelota celular. Suspenda a pelota na mídia PBS ou BC-MPS e use citometria de fluxo para classificar as células com base na fluorescência.O padrão stri-aided da folha ASC confluente é mostrado aqui. O tecido mamário humano flutuante ainda estava estável ancorado pelas folhas celulares ASC até o fundo do poço após 14 dias de cultura. Imagens de microscopia fluorescente demonstram a estabilidade do BC-MPS com mda-MB-231 expressando linhas celulares RFP após 14 dias e com o triplo tumor negativo explantar PDX por pelo menos seis dias.BC-MPS contendo tecido mamário foi cultivado in vitro por 14 dias, manchado e imagem para demonstrar os elementos nativos do tecido em 100X e 20X de ampliação. A coloração dos marcadores macrófagos foi utilizada para mostrar a preservação dos macrófagos primários após três e sete dias na cultura. A análise da citometria de fluxo das células MDA-MB-231 manchadas de Bodipy após 14 dias indicam acúmulo mínimo de lipídios na cultura 2D e acúmulo labíduo extenso e BC-MPS.A proporção de células MDA-MB-231 lipídicas positivas foi 26,2 vezes maior em BC-MPS do que a cultura 2D. Células cultivadas em BC-MPS apresentaram aumento de gotículas lipídicas em comparação com células cultivadas na cultura 2D padrão. Imagens de lapso de tempo de RFP rotuladas bc-mps com células MDA-MB-231 mostraram movimento amoeboid de 231 células com pseudo pods e alta motilidade.O tecido mamário deve ser picado o suficiente e separado o suficiente para ser distribuído na parte inferior do poço. O tecido mamário é muito flutuante e se as peças forem muito grandes ou agrupadas muito próximas, as folhas celulares ASC não serão capazes de ancorar o tecido mamário na parte inferior do poço. Os construtos resultantes do câncer de tecido mamário podem sofrer digestão enzimática para isolar determinados tipos de interesse celular.Isso permitirá que perguntas-chave sejam respondidas, como como as células cancerígenas no tecido mamário respondem de forma diferente à quimioterapia em comparação com a cultura 2D tradicional ou organoides.

modeling-breast-cancer-human-breast-tissue-using-microphysiological

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção

Nos métodos padrão de cultura de células são retiradas do seu ambiente fisiológico e cultivadas na superfície de plástico de um prato. Para estudar o comportamento de células de medula óssea humana primária foi criado um sistema de cultura de 3-D, onde as células são cultivadas sob condições sintetizando o microambiente nativa do tecido.

A Cultura de Tecidos modelo tridimensional para estudar primária da medula óssea humana e suas Malignancies

O cancro é uma doença complexa que é influenciada pelo tecido circundante do tumor, bem como pro- local e anti-inflamatórias mediadores. Portanto, os modelos de injeção ortotrópicas, ao invés de modelos subcutâneos pode ser útil para estudar a progressão do câncer de uma forma que melhor mimetiza patologia humana.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Desenvolvemos um novo modelo ex vivo para estudar a acção da hormona no peito humano. Baseia-se em microestruturas dos tecidos isolados de amostras de tecidos mamários cirúrgicos que preservam a arquitetura do tecido, as interações intercelulares, e sinalização parácrina.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

Protocolos são descritos para estudar a migração de células do cancro da mama, a proliferação e a colonização em um sistema modelo de tecido ósseo humano explante.

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

Para estudar a progressão do tumor do ovário num modelo fisiologicamente relevante, esferóides multicelulares foram cultivadas num microdispositivo sob fluxo de fluido simulado. Este modelo 3D dinâmica emula o ambiente intraperitoneal com os componentes celulares e mecânicas onde ocorre a metástase do cancro do ovário.

Modelagem do comportamento do cancro do ovário multicelular Spheroid em um microdispositivos 3D Peritoneal Dinâmico

Aqui, apresentamos um protocolo para implante de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de forma simples, menos invasiva e fácil de manusear de maneira, e este modelo de câncer de mama ortotópico rato com um ambiente adequado do tecido mamário pode ser usado para investigar vários aspectos da câncer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

O objetivo deste protocolo é descrever uma nova abordagem de modelagem de câncer de mama baseada na injeção intraductal de adenovírus expressando CRE em glândulas mamárias de camundongo. Esta aproximação permite a manipulação Cell-Type-e órgão-específica de eventos oncogênico em uma maneira temporally controlada.

Modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de CRE-expressando Adenovirus na glândula mamária do mouse

O crosstalk entre células epiteliais mamárias e células endoteliais contribui importantemente para a progressão do câncer de mama, crescimento do tumor e metástase. Neste estudo, os esferoides foram feitos a partir de células cancerígenas de mama juntamente com células endoteliais vasculares e/ou linfáticas e demonstram sua aplicabilidade como um sistema in vitro para pesquisa de câncer de mama.

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Este protocolo apresenta um modelo tumor-on-a-chip fisiologicamente relevante para realizar pesquisa básica e translacional de câncer humano de alto rendimento, rastreamento avançado de drogas, modelagem de doenças e abordagens de medicina personalizada com uma descrição de procedimentos de carregamento, manutenção e avaliação.

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

Este protocolo descreve um método definido baseado em hidrogel para gerar organoides mamários humanos que recapitulam características-chave da morfogênese mamária em um sistema de cultura tridimensional controlado.

Um método definido à base de hidrogel para gerar organoides mamários humanos tridimensionais que recapitulam a morfogênese mamária

Aprenda a modelar o câncer de mama em tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico. Este método mantém o tecido vivo ex vivo, permitindo estudar interações entre tecido e câncer.

Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico

Explorar mais vídeos