Name: Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a identificar elementos reguladores da tradução de mRNA durante a maturação de oócitos in vitro usando ensaio de repórter e microscopia de lapso de tempo. Este método permite caracterizar mecanismos moleculares essenciais para a biologia reprodutiva.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM097165, GM116926 e Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 para Marco Conti. Enrico M. Daldello foi apoiado por uma bolsa da Fundação Lalor e Natasja G. J. Costermans foi apoiada por uma bolsa Rubicon da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO).

Os procedimentos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em São Francisco (protocolo AN182026).
1. Preparação de mídia
<ol><li>Adicione todos os componentes, conforme descrito na Tabela 1,para tornar a média de maturação básica da coleta de oócitos e oócitos. Para o meio de coleta básica, defina o pH para 7,4. Para o meio de coleta e maturação, adicione 3 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e 1 μM cilostamida no dia do uso.</li>
</ol>2. Preparação de codificação mRNA para UTR Ypet-3' e mCherry
<ol><li>Obtenha as sequências UTR de 3′ dos mRNAs de interesse. NOTA: Para este estudo, as sequências foram obtidas anteriormente a partir de cDNA oocito de rato.</li>
	<li>Projete primers para amplificar os UTRs de 3' alvo do oócito cDNA e partes do vetor pcDNA 3.1 contendo uma sequência de codificação Ypet, tag V5-epitope e um promotor T7.</li>
	<li>Amplifique usando um kit de polimerase de DNA de alta fidelidade. Execute os produtos de reação em cadeia de polimerase (PCR) em um gel para verificar se os fragmentos têm o tamanho correto, cortar as bandas e extrair o DNA do gel usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Fundir os fragmentos do PCR em um vetor usando um kit de clonagem PCR. NOTA: Fragmentos de PCR foram incubados no gelo por 4h para facilitar um processo de recombinação mais eficiente. Isso é contrário às instruções do fabricante, que recomendam um tempo de incubação de apenas 45 min.</li>
	<li>Fragmentos transfect PCR em bactérias competentes de 5 α Escherichia coli.<ol>
<li>Adicione a mistura e plasmid às bactérias, e incubar no gelo por 30 minutos.</li>
		<li>Aqueça a mistura e o plasmídeo colocando a mistura em um banho de água a 42 °C por 45 s, e esfrie imediatamente no gelo por 3 minutos.</li>
		<li>Adicione 500 μL de caldo Super Ótimo com médio de repressão catabólica (SOC) e incubar por 1h a 37 °C.</li>
		<li>Gire a 7000 × g por 2 min, e remova a maior parte do supernante. Resuspend e placa em uma placa de ágar Luria Broth (LB) com o antibiótico de seleção apropriado. NOTA: A carbenicilina foi utilizada neste estudo.</li>
		<li>Incubar durante a noite a 37 °C. Isole as colônias pressionando levemente uma ponta de pipeta em uma das colônias e colocando-a em 3 mL de meio LB com 100 μg/mL de carbenicilina. Incubar por 12-24 h a 37 °C.</li>
		<li>Extrair o DNA dos plasmídeos usando o kit de isolamento de DNA plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante e confirmar as sequências através de sequenciamento de DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para Ypet/3' UTR:<ol>
<li>Produzir um modelo PCR linear para transcrição in vitro. Use uma primer para a frente a montante da sequência Ypet e um primer reverso com 20 resíduos adicionais de timina. Consulte a Tabela 2 para a sequência de Ypet/IL-7 3' UTR e as sequências dos primers dianteiros e invertidos. NOTA: Esses resíduos adicionais de timina adicionarão oligo(A) ao mRNA linear após transcrição in vitro .
</li>
		<li>
In vitro transcreva o produto PCR usando um kit de transcrição T7 de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Purifique o RNA complementar resultante (cRNA) usando um kit de limpeza de transcrição de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Elute o cRNA purificado na água livre de RNAse, mede a concentração e avalia a integridade por eletroforese agarose. Armazenar a −80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para mCherry:<ol>
<li>Produzir um modelo PCR linear para transcrição in vitro usando uma enzima de restrição de alta fidelidade; use a enzima de restrição mfEI-HF se replicar este exemplo. Digerir em um tampão de digestão durante a noite a 37 °C.</li>
		<li>Execute um gel para purificar a amostra e extraia o DNA linear usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>
In vitro transcreva o produto PCR usando um kit de transcrição T7 de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Poliadenilate o cRNA (150-200 nucleotídeos) utilizando um kit de rejeito poli(A) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Purifique o cRNA resultante usando um kit de limpeza de transcrição de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Elute o cRNA purificado em água livre de RNAse, mede as concentrações de mRNA e avalia a integridade da mensagem por eletroforese de gel. Armazenar a −80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedimento experimental
NOTA: Uma visão geral esquemática da microinjeção de oócito e da microscopia de lapso de tempo subsequente é dada na Figura 1.
<ol><li>Dia 1º<ol>
<li>Injetar intraperitoneally camundongos de 21 dias de idade com 5 UI de gonadotropina soro da égua grávida para promover o crescimento do folículo para o estágio antral11.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 3.<ol><li>Coleção Oocyte<ol>
<li>Sacrifique ratos 44-48 h depois de preparar para coletar os ovários, e colocá-los em uma placa de Petri de plástico com meio básico de coleta de oócito.</li>
			<li>Abra cuidadosamente os folículos antrais fazendo um pequeno corte na parede do folículo com uma agulha de 26 G. Isole os oócitos intactos cumulus-enclosed (COCs) com várias camadas de células cumulus usando uma pipeta de vidro operada pela boca.</li>
			<li>Use uma pipeta menor (ligeiramente maior que o diâmetro do oócito), e desnuda mecanicamente os COCs por tubulação repetida. NOTA: Alternativamente, realize a micro-injeção em COCs intactos.</li>
			<li>Utilizando uma pipeta maior, aspire os oócitos desnudados e coloque-os em uma placa de Petri com meio de maturação suplementado com 1 μM do inibidor de fosfodiesterase, cilostamida, para evitar a retomada da maturação meiotic12. Coloque o prato na incubadora por 2h para que os oócitos se recuperem do estresse induzido pelo isolamento dos oócitos dos folículos.</li>
		</ol></li>
		<li>Micro-injeção de oócito<ol>
<li>Prepare as agulhas de injeção colocando um tubo capilar de vidro borossilicato de 10 cm de comprimento em um puxador mecânico. Para uma injeção ideal, dobre a ponta da agulha em um ângulo de 45° usando um filamento aquecido.</li>
			<li>Prepare pratos de poliestireno com gotículas de 20 μL de meio básico de coleta de oócitos e cubra as gotículas com óleo mineral leve.</li>
			<li>Prepare uma mistura de repórter adicionando 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR e 12,5 μg/μL mCherry. Prepare um volume maior e faça alíquotas para experimentos futuros para garantir concentrações semelhantes de repórteres. Armazene essas alíquotas a -80 °C. Após o descongelamento, primeiro centrifugar a alíquota por 2 min a 20.000 x g, e transferir para um novo tubo de microcentrifuge. NOTA: Esta centrifugação evitará que a agulha de injeção fique entupida por potenciais agregados na mistura de repórteres.</li>
			<li>Carregue a agulha de injeção por capilaridade com aproximadamente 0,5 μL de mistura de repórter.</li>
			<li>Coloque a pipeta de retenção e a agulha de injeção carregada nos suportes, e posicione-se na gota do meio de coleta de oócito. Aspire um pouco do meio na pipeta de retenção.</li>
			<li>Abra a agulha de injeção batendo suavemente contra a pipeta de retenção.</li>
			<li>Coloque oócitos em uma gota de meio básico de coleta, e injete 5-10 pL da mistura de repórteres.</li>
			<li>Incubar os oócitos no meio de maturação com cilostamida de 1 μM por 16 h para permitir que o sinal mCherry planar.</li>
			<li>Prepare uma placa de Petri que será usada para microscopia de lapso de tempo com pelo menos duas gotículas de 20 μL de meio de maturação para cada repórter injetado: uma gota com cilostamida de 1 μM para oócitos de prophase de controle I-arrested e uma gotícula sem cilostamida para oócitos maduros. Cubra as gotículas com óleo mineral leve e coloque na incubadora.</li>
		</ol></li>
		<li>Microscopia de lapso de tempo<ol>
<li>Após a pré-incubação, remova os oócitos injetados da incubadora e lave-os quatro vezes em meio de maturação sem cilostamida. Mantenha alguns oócitos em meio de maturação com cilostamida de 1 μM como um grupo de controle de oócitos preso por prophase.</li>
			<li>Transfira os oócitos injetados para suas respectivas gotículas no prato de microscópio de lapso de tempo previamente preparado. Aglomerado os oócitos usando uma pipeta de vidro fechada (uma pipeta fechada pode ser preparada segurando a ponta em chamas por alguns segundos). NOTA: O agrupamento dos oócitos ajuda a evitar seu movimento durante a gravação.</li>
			<li>Coloque o prato sob o microscópio equipado com um sistema de iluminação de diodo emissor de luz e um estágio motorizado equipado com uma câmara ambiental mantida a 37 °C e 5% de CO2. Para replicar este estudo, utilize os seguintes parâmetros: conjunto de filtro: espelho dicrómico YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canal YFP (Excitação (Ex): S500/20 × 49057; Emissão (EM): D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).</li>
			<li>Digite as configurações apropriadas para o experimento time-lapse (ver Tabela de Materiais para o software utilizado neste estudo): Clique em Aplicativos | Aquisição Multidimensional. Selecione a primeira guia Principal e selecione timelapse, várias posições de palcoe vários comprimentos de onda.</li>
			<li>Selecione a guia Salvar para inserir o local onde o experimento deve ser salvo.</li>
			<li>Selecione a guia Timelapse para inserir o número de pontos de tempo, duração e intervalo de tempo. NOTA: A duração do experimento de lapso de tempo depende das espécies animais estudadas, pois o tempo de maturação meiotic oócito difere entre as espécies. Neste experimento com oócitos de camundongos, os oócitos foram registrados a cada 15 minutos por 16 h.</li>
			<li>Selecione a guia Estágio. Ligue o campo brilhante e localize a posição dos oócitos abrindo uma nova janela selecionando a Acquire | Adquirir | Show Ao Vivo. Uma vez localizados os oócitos, volte para a janela Aquisição Multidimensional e pressione + para definir a localização dos oócitos.</li>
			<li>Selecione a guia Comprimentos de ondae defina 3 comprimentos de onda diferentes para brightfield (exposição de 15 ms), YFP (exposição de 150 ms para UTR Ypet/IL7 3') e mCherry (exposição de 75 ms para Ypet/IL7 3' UTR). NOTA: Ajuste a exposição para cada repórter Ypet/3' UTR com base no nível de acúmulo de repórteres e no volume injetado. Certifique-se de que o sinal YFP caia no centro da faixa de detecção no início do experimento para evitar subestimação ou saturação em caso de ativação da tradução. Para mCherry, ajuste a exposição para cada lote de mCherry, pois o sinal depende do número de nucleotídeos de adenina que foram adicionados durante o procedimento de poliadenylation. Devido à variação da eficiência da poliadenilação, use o mesmo lote de mCherry em diferentes experimentos para uma melhor comparação entre experimentos.</li>
			<li>Inicie o experimento de lapso de tempo clicando em Acquire. Consulte a Figura 2 e o Arquivo Suplementar para obter um exemplo de uma gravação de lapso de tempo em um único oócito.</li>
		</ol></li>
		<li>Análise da tradução UTR Ypet-3'<ol>
<li>Para esta análise (ver Tabela de Materiais para o software utilizado neste estudo), realize duas medidas de região para cada oócito: o próprio oócito clique na região de elipse e cerque a região oócito-e uma pequena região próxima ao oócito a ser usada para subtração de fundo-clique na região retangular. NOTA: Certifique-se de que os oócitos não saiam da região selecionada durante a gravação do lapso de tempo. Preste especial atenção à colocação da medição da região em torno da extrusão do corpo polar, pois isso causa movimento no oócito e pode distorcer a gravação.</li>
			<li>Exporte os dados de medição da região para uma planilha clicando primeiro no Open Log e depois no Log Data para exportar o software de análise de dados.</li>
			<li>Para cada oócito individual e para todos os pontos de tempo medidos, subtraia a medição da região de fundo da medição da região do oócito. Faça isso para comprimentos de onda YFP e mCherry separadamente.</li>
			<li>Regisso tempo de quebra de vesícula germinal (GVBD) e extrusão do corpo polar (PBE) para referência posterior. NOTA: Exclua oócitos do mouse amadurecido quando o GVBD exceder 2 h.</li>
			<li>Plot YFP e mCherry expressão ao longo do tempo para cada oócito para verificar outliers. NOTA: Esta deve ser uma curva suave, se não for isso pode indicar que o oócito se moveu durante a gravação.</li>
			<li>Para cada oócito individual, calcule a expressão mCherry média para os últimos dez pontos de tempo da gravação. Para cada ponto de tempo, divida a expressão YFP pela expressão mCherry média para corrigir o volume injetado para obter uma razão YFP/mCherry em cada ponto de tempo para cada oócito individual.</li>
			<li>Calcule as taxas de tradução para um intervalo de tempo específico, encaixando a inclinação da curva por regressão linear. Avalie as diferenças nas taxas de tradução usando inferência estatística.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li>
<li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portrait+of+an+oocyte%3A+our+obscure+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li>
<li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConti%2C+M+%22Posttranscriptional+Mechanisms+in+Endocrine+Regulation%22">Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation</a>. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).</li>
<li>Dai, X. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinational+code+for+mRNA+3%27UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li>
<li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li>
<li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399(2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+%28Dazl%29+at+the+oocyte-to-zygote+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li>
<li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li>
<li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li>
<li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li>
<li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+growth%3A+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li>
<li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li>
<li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333(2018).</li>
<li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development%3A+A+model+for+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li>
<li>Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).</li>
<li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+mRNAs+with+distinct+3%27+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive%2C+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+3%27+uridylation+and+poly%28A%29+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li>
<li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

O método apresentado descreve uma estratégia para estudar a ativação e a repressão da tradução do mRNA alvo em diferentes transições durante a maturação meiotic in vitro oocito. IL-7, uma citocina liberada pelo oócito que pode estar envolvida na comunicação celular oócito-cumulus8,13, foi escolhida com o propósito de descrever este método. O IL-7 é conhecido por ser cada vez mais traduzido durante a maturação do oócito8 e permite ...

Um oócito mamífero totalmente cultivado sofre mudanças rápidas na preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Essas mudanças são essenciais para sustentar o desenvolvimento embrionário após a fertilização. Embora os eventos associados à maturação nuclear sejam relativamente bem descritos, muito menos se sabe sobre os processos moleculares e caminhos no citoplasma oócito. Durante os estágios finais da maturação do oócito, os oócitos são transcricionalmente silenciosos, e a expressão genética é inteiramente dependente da tradução e degradação do mRNA1,2. A síntese de proteínas críticas para a competência do desenvolvimento, portanto, conta com um programa de tradução cronometrada de mRNAs de longa duração que foram sintetizadas anteriormente durante o crescimento do oócito1,3. Como parte de um foco na definição deste programa de tradução materna mRNA executado durante a maturação meiotic e na transição oólito-zigoto, este artigo apresenta uma estratégia para estudar a ativação e repressão da tradução de mRNAs maternas-alvo em oócitos únicos durante a maturação in vitro.
Neste método, o quadro de leitura aberto YPet é clonado a montante da UTR de 3' da transcrição de interesse. Em seguida, mRNAs codificando este repórter são micro-injetados em oócitos juntamente com mRNAs poliadenilated codificando mCherry para controlar o volume injetado. O acúmulo de repórteres é medido durante a maturação meiotic in vitro oocíte usando microscopia de lapso de tempo. O acúmulo de proteína fluorescente amarela (YFP) e mCherry é registrado em oócitos individuais, e os sinais de YFP são corrigidos pelo nível nivelado do mCherry co-injetado. Após a aquisição dos dados, as taxas de tradução são calculadas para diferentes intervalos de tempo durante a maturação meiotic in vitro oocito calculando a inclinação da curva obtida pelo encaixe da curva.
Esta abordagem fornece uma ferramenta para confirmar experimentalmente mudanças na tradução de mRNAs endógenos selecionados. Além disso, este método facilita a caracterização de elementos regulatórios que controlam a tradução durante o amadurecimento meiotico oocíte, manipulando elementos cis-regulatórios da UTR de 3' dasmRNAs-alvo 4,5,6. A manipulação do comprimento da cauda poli(A) também permite a percepção da atividade adenylase/deadenylase em oócitos5. Mutagênese de elementos cis-ação ou imunoprecipitação de RNA pode ser usado para estudar interações com proteínas de ligação RNA cogina6,7. Além disso, este método pode ser usado para identificar componentes essenciais do programa de tradução que são críticos para a competência de desenvolvimento oócito, medindo a tradução UTR alvo 3' em modelos associados à diminuição da qualidade do oócito 8,9,10. Este artigo de método apresenta um experimento representativo onde oócitos desnudados de camundongos C57/BL6 de 21 dias de idade foram micro-injetados com um repórter Ypet fundido ao UTR de 3' de IL-7. A configuração e o protocolo para injeção de oócito, gravação de lapso de tempo e análise de dados foram descritos.

<table><tbody><tr><td><forte>Preparação de meios</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino em Pó Bioxtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL-A3311</td><td></td></tr><tr><td>Cilostamida</td><td>EMD Millipore</td><td>231085</td><td></td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Mínimo Essencial Médio Águia&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2645</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 100x Solução, Filtrada Estéril</td><td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio&nbsp;</td><td>JT-Baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Preparação de mRNA que codifica YFP/3' UTR e mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Biomedical&nbsp;</td><td>20-102QD</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico de carbenicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonagem Choo-Choo</td><td>McLab</td><td>CCK-20</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer (10x)</td>Corante de carregamento de DNA New <td>England Biolabs</td><td>B7204</td><td></td></tr><tr><td>(6x)</td>Solução dNTP <td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>New</td><td>England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td> Placas de Ágar <td>Thermo Fisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>LB com 100 &micro; g/mL de carbenicilina, Teknova&nbsp;</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>LB Médio (Cápsulas)</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-021</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit de Limpeza de Transcrição Life</td><td>Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MfeI-HF enzima de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>R3589</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit de Transcrição</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA de Alta Fidelidade polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Kit de rejeitos</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td>Kit de Extração de Gel <td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>tampão TAE&nbsp;</td><td>Apex Biomedical&nbsp;</td><td>20-193</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Brometo de Etídio Ultrapuro</td><td>Life Technologies</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Coleta de oócitos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de aspiração para micro-pipetas calibradas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Micro-pipetas calibradas</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSG- 5000</td><td>Mybiosource</td><td>MBS142665</td><td></td></tr><tr><td>Agulha PrecisionGlide 26 G x 1/2</td><td>BD</td><td></td> Seringa 305111 <td></td></tr><tr><td>1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Microinjeção de oócitos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Prato | Nº 0 Lamínula | Diâmetro do vidro de 20 mm | MatTek</td><td></td><td>P35G-0-20-C</td> não revestido <td>Para microscopia de lapso de tempo</td></tr><tr><td>Vidro de borossilicato com filamento</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Óleo para Cultura de Embriões</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td>de Petri</td><td>Falcon 351006</td><td>para microinjeção</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Para incubação de oócitos</td></tr><tr><td>VacuTip Holding Capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5195000036</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Preparação do Figure 1S</td></tr><tr><td>MetaMorph, versão 7.8.13.0&nbsp;</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td></td><td>&nbsp; Para microscopia de lapso de tempo, análise de translação UTR de 3'&nbsp;</td></tr></tbody></table>

definindo o programa de tradução materna mrna durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Eventos associados à maturação nuclear oócito foram bem descritos. No entanto, muito menos se sabe sobre as vias moleculares e processos que ocorrem no citoplasma em preparação para fertilização e aquisição de totipotency. Durante a maturação do oócito, as mudanças na expressão genética dependem exclusivamente da tradução e degradação das RNAs (mRNAs) do mensageiro materno, em vez da transcrição. A execução do programa translacional, portanto, desempenha um papel fundamental no estabelecimento da competência de desenvolvimento oócito para sustentar o desenvolvimento de embriões. Este artigo faz parte de um foco na definição do programa de tradução materna de mRNA que ocorre durante a maturação meiotica e na transição oócito-zigoto. Neste artigo de método, é apresentada uma estratégia para estudar a regulação da tradução de mRNAs-alvo durante a maturação in vitro oócito. Aqui, um repórter Ypet é fundido à região não traduzida (UTR) de 3' do gene de interesse e, em seguida, micro-injetado em oócitos juntamente com codificação mRNA poliadenilada para mCherry para controlar o volume injetado. Usando microscopia de lapso de tempo para medir o acúmulo de repórteres, as taxas de tradução são calculadas em diferentes transições durante o maturação meiotic oócito. Aqui, os protocolos de isolamento e injeção de oócitos, gravação de lapso de tempo e análise de dados foram descritos, usando o repórter Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR como exemplo.

Os oócitos desnudados prophase I-arrested de ratos C57/BL6 de 21 dias de idade foram injetados com uma mistura de repórter contendo mRNA codificando o repórter Ypet fundido ao UTR de 3' de IL-7 e mRNA codificação mCherry. YFP e mCherry expressão foi registrado em 39 oócitos, dos quais 30 foram amadurecidos, e 9 foram presos em prophase I como um controle negativo. Três oócitos maduros foram excluídos para análise por terem um GVBD atrasado (N=2) ou movidos no prato durante a gravação (N=1). A Figura ...

Este protocolo descreve um ensaio repórter para estudar a regulação da tradução de mRNA em oócitos únicos durante a maturação in vitro.

Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Este método pode ser usado para identificar e caracterizar elementos regulatórios que controlam a tradução durante a maturação do oócito. Aplicamos microscopia de lapso de tempo para avaliar o acúmulo de repórteres durante a maturação in vitro oócito. Isso identifica com precisão o momento em que a ativação ou repressão translacional ocorre durante a maturação do oócito.Para começar, abra cuidadosamente os folículos antrais fazendo um pequeno corte na parede do folículo com uma agulha calibre 26. Isole COCs intactos com várias camadas de células cumulus usando uma pipeta de vidro operada pela boca. Use uma pipeta menor e desnuda mecanicamente os COCs por pipetação repetida.Aspire os oócitos desnudos e coloque-os em uma placa de petri com meio de maturação suplementado com um micromolar de cilostamida. Coloque o prato em uma incubadora por duas horas para deixar os oócitos se recuperarem do estresse induzido pelo isolamento dos folículos. Coloque um tubo capilar de vidro borossilicato de 10 centímetros de comprimento em um puxador mecânico para preparar agulhas de injeção.Dobre a ponta da agulha em um ângulo de 45 graus usando um filamento aquecido para uma injeção ideal. Coloque 20 gotículas de microliter de meio básico de coleta de oócito em um prato de poliestireno, e cubra as gotículas com óleo mineral leve. Prepare um volume maior de mistura de repórter adicionando 12,5 microgramas por microliter de Ypet UTR e mCherry cada.Armazene alíquotas destes a menos 80 graus Celsius. Após descongelar, centrifugar a alíquota por dois minutos a 20.000 vezes G, em seguida, transfira-a para um novo tubo de microcentrifuagem. Carregue a agulha de injeção com aproximadamente 0,5 microliters de mistura de repórter.Coloque a pipeta de retenção e a agulha de injeção nos suportes e posicione-as na gota do meio de coleta de oócito. Abra a agulha de injeção batendo suavemente contra a pipeta de retenção. Coloque oócitos em uma gota de meio de coleta básica e injete de cinco a dez picoliters da mistura de repórteres.Incubar os oócitos e o meio de maturação com uma cilostamida micromolar por 16 horas para permitir que o sinal mCherry planar. Para microscopia de lapso de tempo, prepare uma placa de Petri com duas gotículas de 20 microliter de meio de maturação para cada repórter injetado, uma gota com uma cilostamida micromolar para oócitos de prophase de controle I-preso, e uma gota sem cilostamida para oócitos maduros. Cubra as gotículas com óleo mineral leve e coloque-as na incubadora.Após a pré-incubação, remova os oócitos injetados da incubadora e lave-os quatro vezes em meio de maturação sem cilostamida. Mantenha alguns oócitos em meio de maturação com uma cilostamida micromolar como um grupo de controle de oócitos prophase I. Transfira os oócitos injetados para suas respectivas gotículas no prato de microscópio de lapso de tempo previamente preparado.Aglomerado os oócitos com uma pipeta de vidro fechada para evitar seu movimento durante a gravação. Coloque o prato sob o microscópio equipado com um sistema de eliminação de diodo emissor de luz e um estágio motorizado equipado com uma câmara ambiental mantida a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, utilizando os parâmetros mencionados no manuscrito do texto. Digite as configurações apropriadas para o experimento de lapso de tempo clicando em Aplicativos e, em seguida, Aquisição Multidimensional.Selecione a primeira guia Principal e selecione time-lapse, várias posições de estágio e vários comprimentos de onda. Selecione a guia Salvar para inserir o local onde o experimento deve ser salvo. Em seguida, selecione a guia Time-Lapse para inserir o número de pontos de tempo, duração e intervalo de tempo.Selecione a guia Estágio, ligue em brightfield e localize a posição dos oócitos abrindo uma nova janela e selecionando Acquire, Acquire e Show Live. Uma vez localizados os oócitos, volte para a janela de aquisição multidimensional e pressione mais para definir a localização dos oócitos. Selecione os comprimentos de onda da guia e defina três comprimentos de onda diferentes para brightfield, YFP e mCherry.Ajuste a exposição para Ypet e mCherry e inicie o experimento de lapso de tempo clicando em Acquire. Para análise da tradução UTR Ypet três prime, realize duas medidas de região para cada oócito, o oócito em si clicando na região da elipse e uma pequena região ao redor do oócito para ser usada para subtração de fundo clicando na região retangular. Exporte os dados de medição da região para uma planilha clicando em Abrir log e, em seguida, Log Data.Para cada oócito individual e para todos os pontos de tempo medidos, subtraia a medição da região de fundo da medição da região do oócito separadamente para comprimentos de onda YFP e mCherry. A expressão de mCherry e YFP em prophase I e oócitos maduros foi registrada em 39 oócitos, dos quais 30 foram amadurecidos, e nove foram presos em prophase I como um controle negativo. As razões individuais de YFP para mCherry para sinais de oócitos prophase I-arrested e maturação foram corrigidas para volume injetado dividindo o sinal YFP pelo sinal mCherry médio dos últimos 10 pontos de tempo para prophase I-arrested e oócitos maduros.As taxas de tradução do repórter YFP foram medidas pela curva que encaixa as relações YFP para mCherry em prophase I e em oócitos maduros durante as primeiras zero a duas horas, ou oito a 10 horas após a liberação de cilostamida usando regressão linear. O acúmulo do repórter não segue um padrão linear, como indicado por uma diferença significativa nas taxas de tradução entre zero a duas horas e oito a 10 horas após a liberação da cilostamida, indicando ativação da tradução interleucina 7 durante a maturação miótica oócicl. Ao tentar este protocolo, certifique-se de que o tempo de exposição seja adequado no início da gravação.Tenha em mente que o sinal pode saturar durante o curso de tempo se a tradução for ativada durante a retomada meiotica oócito. A estabilidade do MRMA pode ser confirmada pelo PCR, utilizando primers para YFP. Para confirmar mudanças na tradução, você pode usar manchas ocidentais com um anticorpo contra uma tecnologia V5.

defining-program-maternal-mrna-translation-during-vitro-maturation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, demonstramos que, na presença de um inibidor de fosfodiéster, o ciclo celular do oócito é interrompido na prófase-I, durante o qual os mRNAs transcritos são armazenados na ausência de tradução. Após a liberação do inibidor, a maturação do oócito é retomada e as células entram na metáfase. O sinal do mRNA repórter fundido com o gene alvo na metáfase-I indica a ativação da maquinaria translacional e da expressão proteica.

O ensaio repórter de oócito único in vitro: uma técnica para estudar a regulação da tradução do mRNA alvo durante a maturação do oócito in vitro

Descrevemos métodos de manipulação de oócitos imaturos de Xenopus laevis, maturação in vitro de oócitos em óvulos e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite a degradação de algumas proteínas maternas e a superexpressão de genes de interesse na fertilização e, portanto, é valioso para estudar papéis de fatores específicos no desenvolvimento embrionário inicial.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

O controle da síntese proteica ocorre principalmente na etapa de iniciação da tradução, cujas deficiências estão ligadas a diversos distúrbios. Para melhor entender sua etiologia, descrevemos aqui um protocolo usando oócitos de Xenopus laevis avaliando a tradução do transcrito mos na presença de um mutante do fator de iniciação da tradução eIF4G1.

Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Um protocolo optimizado para a maturação in vitro de oócitos de peixe-zebra utilizados para a manipulação dos produtos dos genes maternos é aqui apresentada.

Manipulação funcional do gene materno produtos Usando<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação do oócito em Zebrafish

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Para reproducibly contar os números dos mRNAs em oócitos individuais, fluorescência única molécula de RNA in situ hibridação (RNA-FISH) foi otimizada para células não-aderentes. Oócitos foram coletados, hibridizados com sondas específicas transcrição e quantificados usando um software de quantificação de imagem.

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Este protocolo descreve procedimentos para maturação in vitro de oócitos de camundongo, fertilização in vitro e subsequente cultura embrionária até o estágio de blastocisto.

Maturação in vitro, fertilização e cultura de embriões pré-implantacionais em ovocitos de camundongos

Aprenda a identificar elementos reguladores da tradução de mRNA durante a maturação de oócitos in vitro usando ensaio de repórter e microscopia de lapso de tempo. Este método permite caracterizar mecanismos moleculares essenciais para a biologia reprodutiva.

Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único

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