Name: Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a quantificar neurônios dopaminérgicos na substância negra de roedores usando análise automatizada de imagem. Este método validado oferece uma alternativa eficiente à estereologia tradicional para pesquisa da doença de Parkinson.

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Os autores agradecem a todos os funcionários do Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) da University Health Network pelo tempo e assistência no desenvolvimento desse protocolo.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Rede de Saúde universitária e realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.
1. Injeção estereotática
<ol><li>Ratos adultos de casa par-house Sprague-Dawley (250-280 g) em gaiolas com roupa de cama de madeira e acesso a anúncios lib a alimentos e água. Mantenha a colônia animal em um ciclo regular de 12h de luz/escuridão (luzes em 06:30) com temperatura e umidade constantes.</li>
	<li>Realize a injeção estereotática unilateral de AAV diretamente ao SNpc no lado direito do cérebro (lado direito ou esquerdo, de acordo com as preferências de cada laboratório) como descrito anteriormente8,10. Injete 2 μL de AAV1/2 em um título final de 3,4 x 1012 partículas genômicas/mL.</li>
</ol>2. Secção cerebral e imunohistoquímica (IHC)
<ol><li>Anestesiar o rato com 5% de isoflurane colocando em uma câmara de anestesia por 3 minutos. Outros métodos aprovados podem ser utilizados para esta etapa após a revisão institucional adequada.</li>
	<li>Uma vez que o rato tenha alcançado um plano cirúrgico de anestesia profunda, transfira-o para um cone de nariz firmemente afixado para uma tabela de necropsia. Fixar as patas dianteiras do rato usando fita adesiva e use o método de resposta ao dedo do dedo do dedo do dedo para determinar a profundidade da anestesia. O animal deve não responder antes de continuar.</li>
	<li>Faça uma incisão lateral abaixo do esterno e corte através do diafragma ao longo de toda a extensão da caixa torácica para expor a cavidade pleural. Levante e aperte o esterno com um hemosta e coloque acima da cabeça.</li>
	<li>Aperte o coração usando fórceps e insira uma agulha de borboleta conectada a uma bomba de perfusão na extremidade posterior do ventrículo esquerdo. Perfuse rato transcardialmente com 150 mL de soro fisiológico heparinizado, ou até que os olhos e a pele estejam claros. A perfusão com 4% de paraformaldeído (PFA), em vez de soro fisiológico, pode ser preferida para facilitar a imunossão com certos anticorpos ou seção cerebral mais fina.</li>
	<li>Uma vez que a perfusão esteja completa, decapite com uma guilhotina e extraia o cérebro para uma matriz cerebral, superfície ventral voltada para cima.</li>
	<li>Usando uma lâmina de barbear fresca, faça um corte no plano coronal 2 mm rostral para o quiasmo óptico. Deslize a lâmina de um lado para o outro para evitar deformar o cérebro durante o corte.</li>
	<li>Mergulhe a porção posterior do cérebro em um frasco pré-rotulado contendo aproximadamente 20 mL de 4% de PFA para 48h de pós-fixação à temperatura ambiente. A porção anterior do cérebro pode ser congelada em 2-metilbutano refrigerado a -42 °C antes de armazenamento a -80 °C.</li>
	<li>Após 48 h, transfira os cérebros fixos para um frasco rotulado contendo 30% de sacarose em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) e armazene a 4 °C até afundar (48-72 h).</li>
	<li>Prepare um microtoma colocando gelo seco no cocho da etapa da amostra, seguido de 100% de etanol. Uma vez que o estágio tenha esfriado, esprema o composto de temperatura de corte ideal (OCT) no palco até formar um círculo de 2 cm de diâmetro e 0,5 cm de espessura. Uma vez parcialmente congelado, abaixe cuidadosamente o cérebro sobre o monte de OCT, garantindo que a superfície de corte estriatal permaneça paralela com o estágio.</li>
	<li>Adicione mais gelo seco ao palco para ajudar o cérebro a congelar. Uma vez que o cérebro tenha virado uma cor creme, limpe o estágio de gelo seco.</li>
	<li>Faça um buraco no lado direito do cérebro com uma agulha 25G para distinguir os hemisférios direito e esquerdo. Tome cuidado para não passar a agulha através de estruturas anatômicas de interesse.</li>
	<li>Corte em série seções de 40 μm no plano coronal começando em bregma -3.8 e terminando em bregma -6.8.</li>
	<li>Armazene seis séries em tubos rotulados com solução anticongelante (40% PBS, 30% 2-ethoxyetanol, 30% glicerol). Cada série deve conter 12 seções cerebrais.</li>
	<li>Selecione um conjunto de seções para coloração imunohistoquímica e lave a solução anticongelante com lavagens de 3 x 10 min em 0,2% PBS-T.</li>
	<li>Bloqueie por 1 h em RT com porca suave na solução de bloqueio (soro de cabra 10% normal (NGS), 2% de albumina de soro bovino (BSA) em 0,2% PBS-T). Siga isso com incubação com anticorpo anti-tyrosina de coelho (TH) (1:500) e anticorpo anti-α-syn do rato (1:500) em 2% de NGS em 0,2% PBS-T durante a noite à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave o anticorpo primário com lavagens secundárias de 3 x 5 minutos em 0,2% PBS-T, seguido de incubação de 1 h com anticorpo secundário Alexa Fluor 488 (1:500) e anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 555 em 2% de NGS em 0,2% PBS-T. Certifique-se de que as seções estão protegidas da luz e da porca suavemente.</li>
	<li>Lave o anticorpo secundário com lavagens de 3 x 5 minutos em PBS-T de 0,2% e monte o conjunto completo de seções em lâminas protegidas de luz e poeira usando um pincel estreito. Tampar com fluorescência montagem média e vedação com verniz de unha claro.</li>
</ol>3. Microscopia confocal e aquisição de imagens
<ol><li>Capture imagens IHC usando software acoplado a um microscópio confocal a 10x de ampliação. Abra o orifício para 1,5 UA para capturar um plano largo totalizando ~1,5 μm e definir o foco no lado injetado do cérebro.</li>
	<li>Na guia Aquisição, verifique a opção de imagem Tile Scan e defina as dimensões para 10 x 4.</li>
	<li>No painel Modo aquisição, defina o Zoom para 1.1. Isso ajuda a evitar marcas óbvias de costura entre as imagens de varredura de ladrilhos.</li>
	<li>Defina o Tamanho do Quadro para 1024 x 1024 pixels e a Média para 2 para garantir a aquisição de imagem de alta qualidade.</li>
	<li>No painel Canais, defina a faixa 1 para alexa488 e faixa 2 até Alexa555.</li>
	<li>Carregue o slide no palco e escolha uma seção com forte coloração th. Clique em Live no painel Aquisição.</li>
	<li>No painel Canais, defina a força e o ganho do laser em níveis que maximizam o sinal e limitam o ruído a partir do plano de fundo. Use o indicador de intervalo para garantir que os sinais não sejam superexpostos (como indicado por uma sobreposição vermelha escura).</li>
	<li>Repita o passo acima com vários slides para garantir que a coloração seja consistente entre slides, pois a força/ganho do laser não pode ser ajustada entre slides.</li>
	<li>Na guia Aquisição, verifique a caixa Posições. </li>
	<li>Neste momento, você está pronto para começar a imagem. Usando a ocular, escolha a primeira seção mostrando coloração TH positiva, defina o foco no ponto de interesse (ou seja, SNpc) e, em seguida, mova o palco para a linha média da seção. Isso salva a posição nos eixos x, y e z e irá visualizar uma varredura de ladrilho capturando toda a seção.</li>
	<li>Repita o passo acima para todas as seções ao longo do SNpc dando um conjunto completo de imagens do SNpc. Se for necessária uma análise detalhada do lado não injetado, as etapas 3.10 a 3.11 devem ser repetidas definindo o foco no lado não injetado.</li>
</ol>4. Análise e quantitação de imagens
<ol><li>Arquivos de imagem separados usando software apropriado e importar arquivos de imagem para software automatizado de análise de imagem.</li>
	<li>Defina uma região de interesse selecionando a ferramenta de anotação caneta para desenhar uma anotação em torno do SNpc. NOTA: Em seções que têm uma grande quantidade de perda de neurônio dopaminérgico, aumentar temporariamente a emiteção/absorção pode ajudar a definir claramente o SNpc (Figura 2).</li>
	<li>Mova-se para a guia Análise e a partir do menu 'Analisar' suspenso, selecione Sintonia em Tempo Real. Isso abre uma janela separada na imagem da seção permitindo a modificação em tempo real dos parâmetros de análise(Figura 3).</li>
	<li>Na seção Desnificação de análise, selecione o zoom de imagem apropriado.</li>
	<li>Na seção Detecção celular, selecione o corante nuclear como o corante usado para coloração TH (Alexa Fluor 488).</li>
	<li>Ajuste o limiar de contraste nuclear, intensidade nuclear mínima, agressividade da segmentação nucleare as configurações de tamanho nuclear enquanto observa cuidadosamente a janela de sintonia em tempo real. NOTA: A representação precisa de cada célula individual como uma única célula na janela de sintonia em tempo real é vital para a precisão. Essas configurações estão em escala arbitrária dependendo do software utilizado, mas o ajuste correto é necessário para permitir que o software diferencie com precisão entre células individuais e entre células e o fundo(Figura 3).</li>
	<li>Repita este processo com um mínimo de 10 amostras separadas para garantir uma concordância uniforme do que constitui uma célula em diferentes seções. NOTA: Marcadores celulares adicionais (como α-syn ou NeuN) podem ser identificados dentro da mesma plataforma de análise usando as seções Marcador 1 ou Marcador 2 na guia de análise.</li>
	<li>Uma vez que um número apropriado de imagens tenha sido amostrado e o ajuste em tempo real tenha sido ajustado de acordo, salve as configurações de análise no menu suspenso Configurações Actions.</li>
	<li>Selecione todas as imagens a serem analisadas e clique em Analisar.</li>
	<li>Escolha a configuração de análise que acabou de salvar e na janela Região de Análise, verifique a caixa (s) camada de anotação. Em seguida, verifique a Camada 1 e clique em Analisar. NOTA: Para um único cérebro, a análise normalmente leva cerca de 5 minutos. O resultado completo mostrará claramente cada item que foi contado como uma célula (Figura 4).</li>
	<li>Uma vez concluída, exporte os dados de análise de resumo para todas as seções. Há uma opção para exportar dados de análise de objetos,que darão dados detalhados, incluindo o tamanho celular de cada célula individual detectada. Este conjunto de dados poderia ser usado para examinar alterações no tamanho da célula em resposta a uma toxina/terapêutica.</li>
	<li>Adicione as Células Totais de cada seção analisada por animal e a Área Total Analisada (mm2). Divida o número total de células pela área total analisada para calcular o número de células/mm2 no SNpc para cada rato</li>
</ol>

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Nair-Roberts, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+estimates+of+dopaminergic%2C+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+ventral+tegmental+area%2C+substantia+nigra+and+retrorubral+field+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat.</a> Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).</li>
<li>Golub, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurostereology+protocol+for+unbiased+quantification+of+neuronal+injury+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196(2015).</li>
<li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereology+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li>
<li>Penttinen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+deep+neural+networks+to+count+dopamine+neurons+in+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra.</a> European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).</li>
<li>Yousef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron+loss+and+degeneration+in+the+progression+of+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68(2017).</li>
<li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+A53T+alpha-synuclein+in+the+rat+substantia+nigra+using+a+novel+AAV1%2F2+vector+produces+a+rapidly+evolving+pathology+with+protein+aggregation%2C+dystrophic+neurite+architecture+and+nigrostriatal+degeneration+with+potential+to+model+the+pathology+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 5, 43(2010).</li>
<li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+neurodegeneration+or+endogenous+compensation+in+an+animal+model+of+Parkinson%27s+disease+produced+by+decreasing+doses+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein.</a> PLoS One. 6 (3), 17698(2011).</li>
<li>McKinnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-onset+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+dopaminergic+neurons+caused+by+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17(2020).</li>
<li>Henderson, M. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+alpha-synuclein+pathology+through+the+brain+connectome+is+modulated+by+selective+vulnerability+and+predicted+by+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).</li>
<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV1%2F2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment%3A+a+new+mouse+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11(2017).</li>
<li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis%3A+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li>
</ol>

Os autores não relatam interesses concorrentes.

A avaliação confiável da integridade do sistema dopaminérgico em modelos pré-clínicos de DP é fundamental para determinar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Por isso, é importante controlar e minimizar potenciais confusões que possam reduzir a confiabilidade e a reprodutibilidade dos dados histopatológicos. Resultados quantitativos cuidadosos podem fornecer mais informações do que descrições qualitativas ou semi-quantitativas. Ao mesmo tempo, devemos reconhecer que as restrições no tempo e no...

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio de movimento neurodegenerativa prevalente caracterizado pela presença de agregados proteicos contendo α-sinucleína (α-syn) e a perda preferencial de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNpc)1. A quantificação do número de neurônios dopaminérgicos é uma parte vital da pesquisa da DP, pois permite a avaliação da integridade do sistema nigrostriatal, proporcionando assim um importante ponto final para avaliar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Atualmente, o padrão de quantificação do número de células é a contagem estológica imparcial, que utiliza seções transversais bidimensionais (2D) do tecido para estimar características volutivas nas estruturas tridimensionais (3D)2,3,4. Os métodos eserológicos modernos baseados em design empregam procedimentos abrangentes de amostragem aleatória e aplicam protocolos de contagem (conhecidos como sondas) para evitar artefatos potenciais e erros sistemáticos, permitindo uma detecção confiável de diferenças apenas um pouco maior do que a variação inter-animal5. Embora a estereologia forneça uma poderosa ferramenta analítica para estudos histológicos in vivo, é tempo intensivo, assume a preparação uniforme de espécimes, e requer validação em várias etapas, o que pode impactar a eficiência cada vez mais necessária para a investigação translacional pré-clínica.
Os recentes avanços tecnológicos na ciência digital possibilitam a adoção de novas aplicações para avaliações mais eficientes da patologia sem um estereótipo, enquanto preenchem uma necessidade como substituto da estereologia imparcial. Esses métodos aumentam a velocidade, reduzem o erro humano e melhoram a reprodutibilidade das técnicas esteológicas6,7. HALO é uma dessas plataformas de análise de imagem para análise quantitativa de tecidos em patologia digital. Ele compreende uma variedade de diferentes módulos e relata dados de expressão morfológica e multiplexado em uma base celular por célula em seções inteiras de tecido usando algoritmos de reconhecimento de padrões. O módulo FL citonuclear mede a positividade imunofluorescente de marcadores fluorescentes no núcleo ou citoplasma. Isso permite relatar o número de células positivas para cada marcador, e o escore de intensidade para cada célula. O módulo pode ser adaptado para fornecer tamanhos celulares individuais e medidas de intensidade, embora este recurso não seja necessário para quantificação de neurônios dopaminérgicos.
O objetivo deste estudo é verificar este método com um modelo de rato α-syn baseado em vetor viral previamente validado de neurodegeneraçãonigral 8,9,10. Neste modelo, o mutante humano A53T α-syn é expresso no SNpc por injeção estereotática do sorotipo híbrido de vírus associado ao adeno 1/2 (AAV1/2), resultando em neurodegeneração significativa durante um período de 6 semanas. O SNpc não injetado contralateral pode, em alguns estudos, servir como um controle interno para o lado injetado. Mais comumente, a injeção de Vetor AAV-Empty (AAV-EV) em uma coorte de controle de animais é usada como um controle negativo. Apresentamos um guia passo-a-passo para estimar a densidade de neurônios dopaminérgicos remanescentes no SNpc injetado após 6 semanas usando um software automatizado de análise de imagem(Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Anticorpo A-Syn</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32-8100</td><td></td></tr><tr><td>ABC Elite</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6102</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo secundário</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anticorpo secundário</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-28180</td><td></td></tr><tr><td>Alcalina fosfatase conjugada anti-coelho igG</td><td>Jackson Immuno</td><td>111-055-144</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated anti-mouse IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de</td> soro bovino <td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem fluorescente DAKO</td><td>Agilent</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>HALO&trade;</td>Substrato de peroxidase <td>Indica Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Diamed</td><td>HS202</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Vector</td><td>Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>LSM880 Microscópio Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuN Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr>Laboratório <td>de Vetor</td> de<td>Soro de Cabra Normal</td><td>S-1000-20</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tecla-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>BioShop</td><td>PAR070.1</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo deslizante</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC700</td><td></td></tr><tr><td>TH Anticorpo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P21962</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount meio de montagem</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Substrato de fosfatase alcalina azul</td><td>Vector Labs</td><td>SK-5300</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na substantia nigra dos modelos de roedores usando análise automatizada de imagem

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é um método-chave na pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson. Atualmente, a contagem esqueológica imparcial é o padrão para quantificação dessas células, mas continua sendo um processo trabalhoso e demorado, que pode não ser viável para todos os projetos. Aqui, descrevemos o uso de uma plataforma de análise de imagens, que pode estimar com precisão a quantidade de células rotuladas em uma região de interesse pré-definida. Descrevemos um protocolo passo-a-passo para este método de análise no cérebro de rato e demonstramos que ele pode identificar uma redução significativa nos neurônios positivos da hidroxilase de tyrosina devido à expressão de α-sinucleína mutante na substantia nigra. Validamos essa metodologia comparando-se com os resultados obtidos pela estereologia imparcial. Em conjunto, este método fornece um processo eficiente e preciso para detectar alterações no número de neurônios dopaminérgicos e, portanto, é adequado para uma determinação eficiente do efeito das intervenções na sobrevivência celular.

Aplicando os métodos acima ao tecido cerebral coletados 6 semanas após as injeções de AAV, demonstramos que a injeção estereotática de AAV expressando o mutante A53T α-syn (AAV-A53T) no SNpc do cérebro de rato resulta em uma redução significativa na densidade de neurônios dopaminérgicos em comparação com a injeção de AAV (AAV-EV) vetorial vazio como controle (Figura 5A,B). O número médio de neurônios TH-positivo/mm2 no SNpc de ratos injetados com AAV-EV foi de 276...

Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.

Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é uma medida de resultado fundamental na pesquisa da doença de Parkinson. Este protocolo encurta significativamente a carga de trabalho necessária para estimar o número do neurônio. Este método fornece um processo eficiente e preciso para detectar alterações no número de neurônios dopaminérgicos e é adequado para determinar o efeito das intervenções na sobrevivência celular.Este método poderia ser facilmente adaptado para fornecer contagem precisa de neurônios em diferentes regiões cerebrais, mantendo vantagens de custo e tempo sobre os métodos eseológicos tradicionais. Para capturar imagens IHC use o software acoplado a um microscópio confocal na ampliação de 10X. Abra o orifício de pinos para 1,5 unidades de área para capturar um plano largo totalizando 1,5 micro metros e definir o foco no lado injetado do cérebro.Na guia de aquisição verifique a opção de imagem de varredura de ladrilhos e defina as dimensões para 10 por quatro. Sob o painel do modo de aquisição, ajuste o zoom para 1.1 para evitar qualquer marca de costura entre as imagens de varredura de ladrilhos. Defina o tamanho do quadro para 1024 por 1024 pixels e a média de dois para garantir a aquisição de imagem de alta qualidade.No painel de canais definir faixa um para Alexa 488 e faixa dois para Alexa 555. Carregue o slide no palco e escolha uma seção com uma mancha th forte. Clique ao vivo no painel de aquisição.No painel de canais, defina a força do laser e ganhe níveis que maximizem o sinal e limitem o ruído de fundo. Use o indicador de intervalo para garantir que os sinais não sejam superexpostos. Repita isso com vários slides.Na guia de aquisição verifique a caixa de posições. Para começar a imagem, use a peça ocular e escolha a primeira seção mostrando manchas th positivas. Em seguida, coloque o foco no ponto de interesse e mova o palco para a linha central da seção.Isso salva a posição nos eixos X, Y e Z e irá visualizar uma varredura de ladrilhos capturando toda a seção. Repita isso para todos os outros slides, incluindo um site não injetado. Separar arquivos de imagem usando software apropriado e importá-los para software automatizado de análise de imagens.Defina uma região de interesse selecionando a ferramenta de anotação da caneta para desenhar uma anotação em torno da substantia nigra pars compacta. Mova-se para a guia de análise e selecione a sintonia em tempo real no menu de análise suspensa. Isso abre uma janela separada na imagem da seção permitindo a modificação em tempo real dos parâmetros de análise.Na seção de ampliação da análise selecione o zoom de imagem apropriado. Sob a seção de detecção de células selecione corante nuclear como o corante usado para coloração th. Ajuste o limiar de contraste nuclear, intensidade nuclear mínima, agressividade da segmentação nuclear e configurações de tamanho nuclear enquanto observe cuidadosamente a janela de ajuste do tempo.Repita este processo com várias amostras. Uma vez que um número apropriado de imagens tenha sido amostrado e a sintonia em tempo real tenha sido ajustada de acordo, salve as configurações de análise no menu suspenso das ações de configurações. Selecione todas as imagens a serem analisadas e clique em analisar.Escolha a configuração de análise que acabou de ser salva e na janela de análise verifique a caixa de camadas de anotação e, em seguida, marque a camada um e clique em analisar. Uma vez completa a exportação dos dados de análise de resumo para todas as seções, selecionando a opção de exportar dados de análise de objetos. Este conjunto de dados poderia ser usado para examinar alterações no tamanho da célula em resposta a uma toxina ou terapêutica.Seis semanas após as injeções de adeno associadas ao vírus ou AAV, a injeção estereotática de AAV expressando synucleína alfa mutante A53T na substantia nigra no cérebro de rato resultou em uma redução significativa na densidade de neurônios dopaminérgicos. O número médio de neurônios th positivos por milímetro ao quadrado na substantia nigra de ratos injetados com AAV-A35T foi significativamente diminuído em comparação com o de ratos injetados com o vetor vazio AAV. Observações semelhantes foram feitas usando estereologia imparcial.Ao tentar este protocolo tenha em mente que o software é tão útil quanto é treinado para ser. Portanto, o tempo e o cuidado devem ser tomados para garantir que uma única célula seja identificada como uma única célula. O software pode ser adaptado para medir uma intensidade de fluorescência de outras proteínas de interesses como a alfa-sinucleína para determinar se os tratamentos podem modular os níveis de proteína.Esta técnica permitiu maior eficiência ao testar o efeito de múltiplas terapêuticas potenciais na densidade dopaminérgica do neurônio.

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A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.

Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

Fonte: Olesen, M. V., et al. A técnica do fracionador óptico para estimar o número de células em um modelo de rato de terapia eletroconvulsiva. J. Vis. Exp. (2017).  O vídeo demonstra a técnica para quantificar neurônios recém-gerados no tecido cerebral. Fatias de tecido hipocampal contendo neurônios marcados com bromodeoxiuridina (BrdU) foram coradas usando imuno-histoquímica e posteriormente quantificadas em toda a espessura do tecido usando a técnica do fracionador óptico.

Quantificando neurônios recém-gerados no tecido cerebral de ratos usando a técnica do fracionador óptico

Este protocolo descreve duas manipulações ambientais diferentes e um protocolo de infusão cerebral concomitante para estudar as alterações cerebrais induzidas pelo ambiente subjacentes ao comportamento adaptativo e ao reparo cerebral em camundongos adultos.

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

Absorção de dopamina synaptosomal e ferramentas experimentais de cromatografia líquida de alto desempenho análise representam para investigar a homeostase de dopamina em camundongos avaliando-se a função do transportador de dopamina e níveis de dopamina no tecido striatal, respectivamente. Aqui nós apresentamos protocolos para medir o teor de tecido de dopamina e avaliar a funcionalidade do transportador de dopamina.

Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal

Este trabalho apresenta um protocolo passo a passo para a estimativa stereological imparcial de números de celular neuronal dopaminérgicos na substância negra do mouse usando o equipamento padrão de microscopia (i.e., um microscópio de luz, uma tabela de objetos motorizado (x, y, z avião) e software de domínio público para análise de imagem digital.

Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia

Identificação de receptor de dopamina D1-alfa no núcleo accumbens é fundamental para esclarecer a disfunção do receptor D1 durante uma doença do sistema nervoso central. Realizamos um novela RNA em situ da hibridação do ensaio para visualizar moléculas de RNA única em uma área específica do cérebro.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estudar o acúmulo neuronal de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina de camundongos. Os agregados fosforilados de α-sinucleína em neurônios são induzidos com fibrilas pré-formadas de α-sinucleína. Imagens automatizadas de células imunofluorescentamente rotuladas e análise de imagem imparcial tornam este protocolo robusto adequado para a triagem de rendimento médio a alto de drogas que inibem o acúmulo de α-sinucleína.

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Este protocolo mostra como adquirir dados de ressonância magnética sensíveis à neuromelanina da substância negra.

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Padronização de um novo software semiautomático para medição de crescimento de neuritos 

Aprenda a quantificar neurônios dopaminérgicos na substância negra de roedores usando análise automatizada de imagem. Este método validado oferece uma alternativa eficiente à estereologia tradicional para pesquisa da doença de Parkinson.

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