Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem
2 de fevereiro de 2021
Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.
A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é uma medida de resultado fundamental na pesquisa da doença de Parkinson. Este protocolo encurta significativamente a carga de trabalho necessária para estimar o número do neurônio. Este método fornece um processo eficiente e preciso para detectar alterações no número de neurônios dopaminérgicos e é adequado para determinar o efeito das intervenções na sobrevivência celular.
Este método poderia ser facilmente adaptado para fornecer contagem precisa de neurônios em diferentes regiões cerebrais, mantendo vantagens de custo e tempo sobre os métodos eseológicos tradicionais. Para capturar imagens IHC use o software acoplado a um microscópio confocal na ampliação de 10X. Abra o orifício de pinos para 1,5 unidades de área para capturar um plano largo totalizando 1,5 micro metros e definir o foco no lado injetado do cérebro.
Na guia de aquisição verifique a opção de imagem de varredura de ladrilhos e defina as dimensões para 10 por quatro. Sob o painel do modo de aquisição, ajuste o zoom para 1.1 para evitar qualquer marca de costura entre as imagens de varredura de ladrilhos. Defina o tamanho do quadro para 1024 por 1024 pixels e a média de dois para garantir a aquisição de imagem de alta qualidade.
No painel de canais definir faixa um para Alexa 488 e faixa dois para Alexa 555. Carregue o slide no palco e escolha uma seção com uma mancha th forte. Clique ao vivo no painel de aquisição.
No painel de canais, defina a força do laser e ganhe níveis que maximizem o sinal e limitem o ruído de fundo. Use o indicador de intervalo para garantir que os sinais não sejam superexpostos. Repita isso com vários slides.
Na guia de aquisição verifique a caixa de posições. Para começar a imagem, use a peça ocular e escolha a primeira seção mostrando manchas th positivas. Em seguida, coloque o foco no ponto de interesse e mova o palco para a linha central da seção.
Isso salva a posição nos eixos X, Y e Z e irá visualizar uma varredura de ladrilhos capturando toda a seção. Repita isso para todos os outros slides, incluindo um site não injetado. Separar arquivos de imagem usando software apropriado e importá-los para software automatizado de análise de imagens.
Defina uma região de interesse selecionando a ferramenta de anotação da caneta para desenhar uma anotação em torno da substantia nigra pars compacta. Mova-se para a guia de análise e selecione a sintonia em tempo real no menu de análise suspensa. Isso abre uma janela separada na imagem da seção permitindo a modificação em tempo real dos parâmetros de análise.
Na seção de ampliação da análise selecione o zoom de imagem apropriado. Sob a seção de detecção de células selecione corante nuclear como o corante usado para coloração th. Ajuste o limiar de contraste nuclear, intensidade nuclear mínima, agressividade da segmentação nuclear e configurações de tamanho nuclear enquanto observe cuidadosamente a janela de ajuste do tempo.
Repita este processo com várias amostras. Uma vez que um número apropriado de imagens tenha sido amostrado e a sintonia em tempo real tenha sido ajustada de acordo, salve as configurações de análise no menu suspenso das ações de configurações. Selecione todas as imagens a serem analisadas e clique em analisar.
Escolha a configuração de análise que acabou de ser salva e na janela de análise verifique a caixa de camadas de anotação e, em seguida, marque a camada um e clique em analisar. Uma vez completa a exportação dos dados de análise de resumo para todas as seções, selecionando a opção de exportar dados de análise de objetos. Este conjunto de dados poderia ser usado para examinar alterações no tamanho da célula em resposta a uma toxina ou terapêutica.
Seis semanas após as injeções de adeno associadas ao vírus ou AAV, a injeção estereotática de AAV expressando synucleína alfa mutante A53T na substantia nigra no cérebro de rato resultou em uma redução significativa na densidade de neurônios dopaminérgicos. O número médio de neurônios th positivos por milímetro ao quadrado na substantia nigra de ratos injetados com AAV-A35T foi significativamente diminuído em comparação com o de ratos injetados com o vetor vazio AAV. Observações semelhantes foram feitas usando estereologia imparcial.
Ao tentar este protocolo tenha em mente que o software é tão útil quanto é treinado para ser. Portanto, o tempo e o cuidado devem ser tomados para garantir que uma única célula seja identificada como uma única célula. O software pode ser adaptado para medir uma intensidade de fluorescência de outras proteínas de interesses como a alfa-sinucleína para determinar se os tratamentos podem modular os níveis de proteína.
Esta técnica permitiu maior eficiência ao testar o efeito de múltiplas terapêuticas potenciais na densidade dopaminérgica do neurônio.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta de ratos. O protocolo reduz significativamente a carga de trabalho e melhora a precisão ao estimar a contagem de neurônios, o que é crucial na pesquisa da doença de Parkinson.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Psiquiatria
- Biologia Celular
Fundamentos
- A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos é vital para a pesquisa da doença de Parkinson.
- Métodos tradicionais podem ser demorados e menos precisos.
- Métodos automatizados podem proporcionar eficiência de tempo e vantagens de custo.
- Mudanças quantitativas no número de neurônios podem avaliar efeitos terapêuticos.
Propósito do Estudo
- Apresentar um método para detecção eficiente e precisa do número de neurônios dopaminérgicos.
- Permitir que pesquisadores analisem mudanças na contagem de neurônios devido a várias intervenções.
- Simplificar o processo de imagem e análise de dados para neurônios dopaminérgicos.
Métodos Utilizados
- Método de imagem automatizado usando microscopia confocal.
- Foco na substantia nigra pars compacta em um modelo de rato.
- O protocolo envolve a captura de imagens IHC em ampliação de 10X com configurações de imagem específicas.
- Ajuste e análise em tempo real de imagens neuronais via software automatizado.
- Análise de dados incluída para mudanças na densidade de neurônios pós-intervenção.
Principais Resultados
- Este método mostrou reduções significativas na densidade de neurônios TH positivos após injeções de AAV expressando alfa-sinucleína mutante A53T.
- Os resultados indicaram uma diminuição na contagem de neurônios dopaminérgicos em comparação com os grupos de controle.
- Utilizou estereologia não tendenciosa para validar os resultados.
- Permite a detecção de mudanças morfológicas em resposta a intervenções terapêuticas.
Conclusões
- O estudo valida um método eficiente para quantificar neurônios dopaminérgicos.
- Esta técnica melhora a compreensão da perda neuronal em modelos de doença de Parkinson.
- Os métodos apresentados podem facilitar a exploração de impactos terapêuticos na densidade neuronal.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
