Name: Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a observar clivagem de DNA mediada por endonucleases de restrição em nível de molécula única usando microscopia de fluorescência. Este método multiplexado permite analisar centenas de REases simultaneamente para estudar mecanismos catalíticos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio Número K12GM074869 para CME do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais ou dos Institutos Nacionais de Saúde.

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<li>Winkler, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal-structure+of+Ecorv+endonuclease+and+of+Its+complexes+with+cognate+and+non-cognate+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).</li>
<li>Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated%2C+Au%2FAg+striped+nanowires+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis.</a> Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).</li>
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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse

O substrato de DNA para este ensaio é marcado com um ponto quântico usando um esquema de reação em duas etapas usando sulfo-SMCC. Este reticulador bifuncional consiste em uma porção éster NHS que pode reagir com uma amina primária e uma porção maleimida que pode reagir com um grupo sulfidrila20. Os oligonucleotídeos tiolados usados para preparar o substrato são enviados em sua forma oxidada. É importante reduzi-los e purificá-los, conforme descrito, antes de prosseguir com o procedimento de acopla...

As endonucleases de restrição (REases) são enzimas que afetam quebras de fita dupla específicas da sequência no DNA. A descoberta das REases na década de 1970 levou ao desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante, e essas enzimas são agora ferramentas laboratoriais indispensáveis para modificação e manipulação genética1. As REases do tipo II são as enzimas mais utilizadas nesta classe, pois clivam o DNA em um local fixo dentro ou perto de sua sequência de reconhecimento. No entanto, há uma grande variação entre as REases do Tipo II, e elas são divididas em vários subtipos com base em propriedades enzimáticas particulares, em vez de serem classificadas de acordo com suas relações evolutivas. Entre cada subtipo, há exceções frequentes ao esquema de classificação, e muitas enzimas pertencem a vários subtipos2. Milhares de REases do Tipo II foram identificadas, e centenas delas estão disponíveis comercialmente.
No entanto, apesar da diversidade entre as REases do tipo II, muito poucas REases foram estudadas em detalhes. De acordo com o REBASE, o banco de dados de enzimas de restrição estabelecido por Sir Richard Roberts em 19753, os dados cinéticos publicados estão disponíveis para menos de 20 dessas enzimas. Além disso, embora algumas REases tenham sido observadas diretamente no nível de molécula única enquanto se difundiam ao longo do DNA antes de encontrar e se ligar à sua sequência de reconhecimento 4,5,6,7, existem muito poucos estudos de molécula única de sua cinética de reação de clivagem. Os estudos existentes não relatam estatísticas adequadas para realizar uma análise detalhada da variação nos tempos em que ocorrem eventos de clivagem única 8,9,10 ou não são capazes de capturar a distribuição completa dos tempos de clivagem11. Esse tipo de análise pode revelar a presença de intermediários cinéticos de vida relativamente longa e pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos de clivagem do DNA mediada por REase.
No nível de uma única molécula, os processos bioquímicos são estocásticos - o tempo de espera para que uma única instância do processo ocorra, τ, é variável. No entanto, pode-se esperar que muitas medições de τ obedeçam a uma distribuição de probabilidade, p(τ), que é indicativa do tipo de processo que está ocorrendo. Por exemplo, um processo de etapa única, como a liberação de uma molécula de produto de uma enzima, obedecerá à estatística de Poisson, e p(τ) assumirá a forma de uma distribuição exponencial negativa:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png">
onde β é o tempo médio de espera. Observe que a taxa do processo, k, será igual a 1/β, o inverso do tempo médio de espera. Para processos que requerem mais de uma etapa, p(τ) será a convolução das distribuições exponenciais únicas para cada uma das etapas individuais. Uma solução geral para a convolução de N funções de decaimento exponencial único com tempos de espera médios idênticos, β, é a distribuição de probabilidade gama:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png">
onde Γ(N) é a função gama, que descreve a interpolação do fatorial de N-1 para valores não inteiros de N. Embora esta solução geral possa ser usada como uma aproximação quando os tempos médios de espera de etapas individuais são semelhantes, deve-se entender que a presença de etapas relativamente rápidas será mascarada por etapas com tempos de espera significativamente mais longos. Em outras palavras, o valor de N representa um limite inferior no número de etapas12. Com um número adequado de medições de tempo de espera, os parâmetros β e N podem ser estimados agrupando os eventos e ajustando a distribuição gama ao histograma resultante ou usando uma abordagem de estimativa de máxima verossimilhança. Esse tipo de análise pode, portanto, revelar a presença de etapas cinéticas que não podem ser facilmente resolvidas em ensaios de conjunto e requer um grande número de observações para estimar os parâmetros com precisão12,13.
Este artigo descreve um método para usar DNA marcado com pontos quânticos e microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para observar centenas de eventos individuais de clivagem de DNA mediados por REase em paralelo. O design do ensaio torna possível agrupar os resultados de vários experimentos e pode criar distribuições de tempo de permanência contendo milhares de eventos. A alta fotoestabilidade e brilho dos pontos quânticos permitem uma resolução de tempo de 10 Hz sem sacrificar a capacidade de observar eventos de clivagem que ocorrem mesmo muitos minutos após o início do experimento. Boa resolução temporal e uma ampla faixa dinâmica, combinadas com a capacidade de coletar um grande conjunto de dados, permitem uma caracterização precisa das distribuições de tempo de permanência para descobrir a presença de múltiplas etapas cinéticas nas vias de clivagem das REases, que têm taxas de rotatividade na faixa de 1 min-1 . No caso do EcoRV, três etapas cinéticas podem ser resolvidas, todas identificadas por outros meios, confirmando que o ensaio é sensível à presença de tais etapas.
Os substratos de DNA duplex contendo a sequência de reconhecimento de interesse são produzidos pelo recozimento de um oligonucleotídeo biotinilado em uma fita complementar marcada com um único ponto quântico de nanocristal semicondutor covalentemente anexado. Esses substratos são introduzidos em um canal de fluxo construído sobre uma lamínula de vidro com um gramado de moléculas de polietilenoglicol (PEG) de alto peso molecular covalentemente ligadas à sua superfície. Os substratos de DNA são capturados por meio de uma ligação biotina-estreptavidina-biotina por uma fração das moléculas de PEG que possuem uma biotina em sua extremidade livre. Na microscopia TIRF, uma onda evanescente que decai exponencialmente com a distância da interface vidro-líquido fornece iluminação; A profundidade de penetração é da ordem do comprimento de onda da luz usada. Nessas condições, apenas os pontos quânticos que estão presos à superfície por uma molécula de DNA que foi capturada na superfície do vidro funcionalizado serão excitados. Os pontos quânticos que estão livres em solução não serão restringidos dentro da região iluminada e, portanto, não serão luminescentes. Se o DNA que amarra um ponto quântico à superfície for clivado, esse ponto quântico estará livre para se difundir para longe da superfície e desaparecerá da imagem de fluorescência.
Embora muitas REases Tipo II sejam conhecidas por se ligarem ao DNA na ausência de magnésio14, todas requerem magnésio para mediar a clivagem do DNA15. Essas REases podem se ligar ao DNA imobilizado na superfície na ausência de magnésio. Quando o tampão contendo magnésio flui através de um canal com REase pré-ligada ao DNA, a clivagem começa imediatamente, conforme indicado pelo desaparecimento dos pontos quânticos. A sincronização alcançada pela pré-ligação das moléculas de REase e, em seguida, iniciando a clivagem do DNA pela introdução de magnésio, facilita a medição do tempo de atraso até a conclusão da clivagem do DNA independentemente para cada molécula na população de enzimas observadas em um experimento. A fluoresceína é incluída como um corante marcador no tampão contendo magnésio para indicar a chegada do magnésio ao campo de visão. Como nenhuma enzima está incluída no tampão contendo magnésio, o tempo de atraso desde a chegada do tampão contendo magnésio até o desaparecimento de cada ponto quântico indica o tempo que leva para uma REase que já está ligada ao DNA clivar o DNA e liberar o ponto quântico da superfície do vidro. O desaparecimento do ponto quântico acontece rapidamente e resulta em uma diminuição acentuada na trajetória de intensidade, fornecendo uma indicação clara do tempo em que uma determinada molécula de DNA é clivada. A determinação dos tempos dos eventos é realizada pela análise matemática das trajetórias de intensidade, e um experimento típico resulta em centenas de eventos de clivagem identificáveis. Os resultados de vários experimentos podem ser agrupados para fornecer estatísticas adequadas para permitir a estimativa dos parâmetros, N e β, por análise de mínimos quadrados não lineares ou de máxima verossimilhança.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropiltrietoxissilano (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td>Armazenar em caixa de dessecador</td></tr><tr><td>5 Minutos Epoxy</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td>use para selar o dispositivo microfluídico</td></tr><tr><td>acetona</td><td>Pharmco</td><td>329000ACS</td><td>use para limpeza de lamínulas</td></tr><tr><td>sonicador de banho</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPXH Modelo 2800</td><td>número de catálogo 15-337-410</td></tr><tr><td>Copo, vidro, centrífuga de bancada de 100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valerato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de biotina-PEG-succinimidil (MW 5.000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-SVA-5K</td><td>O valerato de succinimidil tem uma meia-vida mais longa do que o carbonato de succinimidil</td></tr><tr><td>oligonucleotídeo biotinilado</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>personalizadas - consulte o protocolo para considerações de design</td><td>Solicite 5' Modificação de biotina e Purificação por HPLC</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>0903-5G</td><td>preparar uma solução de 10 mg/ml (aq) e aquecer a 95 &graus; C antes de usar</td></tr><tr><td>Centri-Spin-10 Colunas de Spin de Exclusão de Tamanho</td><td>Separações de Princeton</td><td>CS-100 ou CS-101</td><td>usadas para purificar oligonucleotídeos tiolados após reduzir a ligação dissulfeto</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 1,5. mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas, suportes</td> de lamínula de vidro <td></td><td></td><td></td>quadrados de 1 polegada</tr><tr><td></td> roda de ponta de diamante Dremel <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>7134</td><td>uso para fazer furos no topper de célula de fluxo de quartzo</td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td>Formato sem pesagem, 7,7 mg/frasco</td></tr><tr><td>de furadeira rotativa para estação de trabalho</td><td>Dremel</td><td>220-01</td><td>facilita a perfuração de quartzo</td></tr><tr><td>EcoRV (REase usado para gerar dados de exemplo)</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195T ou R0195M</td><td>Use estoque de 100.000 unidades/mL para evitar a adição de excesso de glicerol Verifique REBASE para fornecedores de outros REases</td></tr><tr><td>etanol</td><td>vários</td><td>CAS 64-17-5</td><td>desnaturado ou 95% são aceitáveis, use para limpeza de lamínulas</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>BioUltra, anidro, armazenar em caixa dessecadora</td></tr><tr><td>Flea Micro Spinbar</td><td>Fisherbrand</td><td>14-513-65</td><td>Tamanho de 3 mm x 10 mm para caber sob a fluoresceína do rack de lamínula</td></tr><tr><td></td><td>Acros Organics</td><td>17324</td><td>use para fazer buffers experimentais</td></tr><tr><td>forno de convecção por gravidade</td><td>Fichário</td><td>9010-0131</td><td></td></tr><tr><td>multiferramenta rotativa portátil</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>use para fazer furos no topo da célula de fluxo de quartzo</td></tr><tr><td>Câmera EM-CCD ImagEM X2</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-23B</td><td>o resfriamento a ar é adequado para este experimento, use o software HCImage ou similar para controlar o</td></tr><tr><td>espaçador de imagem, frasco adesivo</td><td></td><td></td><td></td>de dupla face</tr><tr><td>, vidro com tampa de rosca, (aproximadamente 50 mm de diâmetro por 50 mm de altura)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP214-500</td><td>use para fazer tampão experimental com software</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td></td> <td>de magnésio</td><td>Análise de dados</td></tr><tr><td>pinças de metal</td><td>Fisher Brand</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)</td><td>Laysan Bio</td><td>M-SVA-5K</td><td>Ambos os PEGs devem ter o mesmo éster NHS para que a taxa de reação seja consistente</td></tr><tr><td>microcentrífuga</td><td>magnética multiposições Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>12621-022</td><td></td></tr><tr><td>Ácido N-ciclohexil-2-aminoetanossulfônico (CHES)</td> <td>Acros Organics</td><td>AC20818</td><td>CAS 103-47-9, use para fazer agitador orbital de buffer CHES</td></tr><tr><td>e aquecedor para tubos de microcentrífuga</td><td>Q Instruments</td><td>1808-0506</td><td>com adaptador 1808-1061 para tubos de 24 x 2,0 mL ou 15 x 0,5 mL Tubo</td></tr> de polietileno <tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE60 (diâmetro interno 0,76 mm, diâmetro externo 1,22 mm)</td> <td>6258917 intramédico</td><td></td><td>As agulhas rombas de 22 G são uma boa opção para este tamanho de tubulação</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7059</td><td>Use a 1x força</td></tr> de <tr><td>hidróxido de potássio</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9262</td><td>use uma solução de 1 M para limpar lamínulas</td></tr><tr><td>Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Quartz Slide, 1 polegada quadrada, 1 mm de espessura</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>72250-10</td><td>devem ser perfurados furos nos cantos para inserção de tubos de entrada e saída</td></tr><tr><td>pinças de plástico reforçado</td><td>Rubis</td><td>K35a</td><td>uso para manuseio de lamínulas e construção de dispositivos microfluídicos</td></tr><tr><td>Folhas adesivas SecureSeal Grace</td><td>Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td>cortado para formar espaçador para dispositivo microfluídico</td></tr><tr><td>Bomba de seringa de canal único para microfluídica</td><td>Sistemas</td> <td>de Bomba New EraNE-1002X-US</td><td>equipado com uma seringa de 50 mL e uma agulha romba de 22 G</td></tr><tr><td>Dispositivos de diálise Slide-a-Lyzer MINI, 10 kDa MWCO, 0,1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570 ou 69572</td><td>usado para troca de tampão durante o acoplamento de pontos quânticos ao</td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio</td><td>de DNA EMD Millipore</td><td>SX0320</td><td>use para fazer tampão para funcionalização de superfície; 100 mM, cloreto</td></tr><tr><td>de sódio</td> pH 8 <td>Macron</td><td>7581-12</td><td>use para fazer tampões experimentais</td></tr><tr><td>Solução dibásica de fosfato de sódio (BioUltra, 0,5 M em água)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94046</td><td>use para fazer tampão de fosfato de sódio 100 mM</td></tr><tr><td>Solução monobásica de fosfato de sódio (BioUltra, 5M em água)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74092</td><td>use para ajustar o pH do tampão fosfato de sódio 100 mM</td></tr><tr><td>Estreptavidina de Streptomyces avidinii</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4762</td><td>dissolver a 1 mg/mL e armazenar 25 mL de bebidas a -20 ?</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39268</td><td>Formato sem pesagem, 2 mg/frasco</td></tr><tr><td>Seringa equipada com agulha romba</td><td></td><td></td><td></td>de 21 G</tr><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td><td></td>de seringa</tr><tr><td>oligonucleotídeo tiolado</td><td>Tecnologias de DNA integradas</td><td>personalizadas - consulte o protocolo para considerações</td> <td>de designSolicite 5 'Thiol Modifier C6 SS e sistema de imagem TIRF de purificação de HPLC</td></tr><tr><td>com iluminação a laser de 488 nm</td><td>vários</td><td></td><td>produtos de pesquisa personalizados</td></tr><tr><td>Tris -HCl</td><td></td> International <td>T60050</td><td>use para fazer buffers experimentais Tris</td></tr><tr><td>base</td><td>JT Baker</td><td>4101</td><td>use para fazer buffers experimentais</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>use para fazer bloqueio misturador de</td></tr><tr><td>vórtice</td><td></td> de água <td></td> ultrapura de buffer VWR 10153-842 <td></td></tr><tr><td>Wash-N-Dry Coverslip Rack</td><td>Microscopy Sciences</td><td>70366-16</td><td>usado para funcionalização de superfície de lamínulas</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de dna mediada por endonuclease de restrição

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

Este novo ensaio baseado em microscopia de fluorescência de reflexão interna total facilita a medição simultânea da duração do ciclo catalítico para centenas de moléculas individuais de endonuclease de restrição (REase) em um experimento. Este ensaio não requer marcação de proteínas e pode ser realizado com um único canal de imagem. Além disso, os resultados de vários experimentos individuais podem ser agrupados para gerar distribuições de tempo de permanência bem preenchidas. A análise das distribuições de tempo de permanência resultantes pode ajudar a elucidar o mecanismo de clivagem do DNA, revelando a presença de etapas cinéticas que não podem ser observadas diretamente. Exemplos de dados coletados usando este ensaio com a bem estudada REase, EcoRV - uma endonuclease de restrição dimérica do Tipo IIP que cliva a sequência palindrômica GAT↓ATC (onde ↓ é o local do corte) - estão de acordo com estudos anteriores. Esses resultados sugerem que existem pelo menos três etapas no caminho para a clivagem do DNA que é iniciada pela introdução de magnésio após o EcoRV se ligar ao DNA em sua ausência, com uma taxa média de 0,17 s-1 para cada etapa.

A célula de fluxo é acoplada diretamente a uma objetiva de ampliação de 60x de imersão em óleo de alta abertura numérica em um microscópio invertido equipado com iluminação a laser para imagens TIRF através da objetiva (Figura 5A). Depois de introduzir o substrato de DNA e lavar o excesso de DNA e pontos quânticos, normalmente existem milhares de pontos quânticos individuais em um campo de visão (Figura 5B). Esses pontos quânticos são fixados de forma estável à ...

Usando DNA marcado com ponto quântico e microscopia de fluorescência de reflexão interna total, podemos investigar o mecanismo de reação das endonucleases de restrição ao usar proteína não marcada. Essa técnica de molécula única permite a observação massivamente multiplexada de interações proteína-DNA individuais, e os dados podem ser agrupados para gerar distribuições de tempo de permanência bem povoadas.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Com este protocolo, podemos observar diretamente a clivagem do DNA específico do local por endonucleases de restrição no nível de uma única molécula. Nossa abordagem multiplexada nos permite medir o tempo que leva para centenas de REases individuais completarem o ciclo catalítico. A multiplexação nos permite gerar um tempo de permanência bem povoado para distribuições de clivagem que podemos ajustar com a distribuição de probabilidade gama para obter insights sobre o mecanismo de clivagem do DNA.Comece preparando um novo tubo para cada oligonucleotídeo ressuspenso a 50 microlitros do oligonucleotídeo e 50 microlitros de solução de TDT recém-preparada para cada tubo, pipete para cima e para baixo para misturar e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Pipete todo o volume de cada sample mistura suavemente em uma coluna preparada e centrifugue a 750G por dois minutos. Após a centrifugação, armazene todas as amostras que não serão usadas imediatamente a 20 graus Celsius para evitar a oxidação dos grupos tióis e a formação de ligações dissulfeto.Pipete uma alíquota de 50 microlitros do estoque de pontos quânticos em um dispositivo de diálise para cada construção a ser feita, tomando cuidado para não tocar na membrana com a ponta da pipeta. Dialisar contra um volume de tampão CHES que seja pelo menos 1.000 vezes o volume da amostra com agitação a 100 RPM por 15 minutos. Usando um pipetador, recupere cuidadosamente os pontos quânticos suspensos do dispositivo de diálise e transfira-os para um novo tubo contendo um volume igual de solução Sulfo-SMCC recém-preparada, pipetando para cima e para baixo para misturar.Incubar por 1 hora em temperatura ambiente com agitação a 1.000 RPM para permitir que o Sulfo-SMCC reaja com as aminas primárias nos pontos quânticos. Em seguida, use um pipetador para transferir cuidadosamente cada amostra para um novo dispositivo de diálise. Para remover o excesso de Sulfo-SMCC, dialise contra um volume de tampão CHES que seja pelo menos 1.000 vezes o volume contido no dispositivo de diálise com agitação por 15 minutos.Troque o tampão duas vezes e realize a diálise com tampão CHES novo três vezes no total, permitindo que a diálise prossiga por 15 minutos após cada troca de tampão. Em seguida, repita a diálise com PBS. Usando um pipetador, recupere cuidadosamente a solução contendo os pontos quânticos do dispositivo de diálise e transfira cada amostra para um novo tubo contendo uma quantidade equimolar de oligonucleotídeo dilatado diluído em PBS.Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação a 1 000 RPM. Adicione BSA a cada amostra para uma concentração final de 0,5 miligramas por mililitro. Em seguida, use um pipetador para transferir cuidadosamente cada amostra para um novo dispositivo de diálise e dialisar contra o tampão de armazenamento.Após a diálise, recupere cuidadosamente cada amostra e coloque-a em um novo tubo. Armazene as amostras a 4 graus Celsius. Combine uma amostra de oligonucleotídeos marcados com pontos quânticos com um excesso molar dez vezes maior de oligonucleotídeo biotinilado.Aqueça a mistura em um bloco de calor a 75 graus Celsius e mantenha-a nessa temperatura por 5 minutos. Em seguida, desligue o bloco de calor e deixe a mistura esfriar lentamente. Armazene a construção concluída a 4 graus Celsius Usando uma multiferramenta rotativa portátil equipada com uma broca de roda de ponta de diamante cônica, faça dois furos em cantos opostos da corrediça de quartzo para servir como entrada e saída.Certifique-se de prender a corrediça no lugar, lubrifique a broca e deslize constantemente com água durante a perfuração. Após cada experimento, recupere a lâmina de quartzo preparada embebendo o dispositivo usado em acetona para dissolver o adesivo e o epóxi. Descarte os componentes restantes.Combine 25 microlitros de solução de estreptavidina com 80 microlitros de PBS e 20 microlitros de tampão de bloqueio. Cubra uma lamínula tratada com PEG com esta mistura e incube em um ambiente úmido por 30 minutos. Durante a incubação da lamínula, prepare o espaçador de imagem para criar um canal de fluxo.Corte um pedaço quadrado de 1 polegada de material espaçador de imagem e, em seguida, marque um canal de 2 milímetros de largura alinhado às extremidades dos orifícios perfurados na lâmina de quartzo. Corte o canal do material espaçador com um bisturi. Limpe bem a lâmina de quartzo com acetona para remover quaisquer restos de adesivo de experimentos anteriores.Retire um lado do suporte do espaçador de imagem e coloque-o cuidadosamente na lâmina de quartzo, tomando cuidado para não cobrir os orifícios de entrada e saída. Lave a lamínula com água e seque com ar comprimido. Remova o outro lado do suporte do espaçador de imagem e coloque-o entre a lâmina de quartzo e a lamínula revestida com estreptavidina funcionalizada usando uma pinça de plástico para pressionar o conjunto e remover as bolhas de ar do adesivo.Corte a extremidade da tubulação em um ângulo para garantir o fluxo livre da solução. Em seguida, insira um tubo de polietileno de 30 centímetros de comprimento em cada orifício da lâmina de quartzo. Segure os tubos no lugar com um suporte para tubos e, em seguida, use epóxi para selar os tubos no lugar e as bordas do dispositivo montado.Uma vez que o epóxi tenha sido definido, insira a agulha romba em uma seringa vazia no tubo de saída do dispositivo e mergulhe a extremidade do tubo de entrada em um recipiente cheio com o tampão de bloqueio. Puxe o êmbolo da seringa para trás para encher o dispositivo com tampão de bloqueio. Em seguida, deixe o dispositivo incubar por pelo menos 30 minutos antes de usar.Prenda o dispositivo microfluídico à placa do microscópio com fita adesiva. Coloque a objetiva em contato com a parte inferior do dispositivo e posicione a objetiva de forma que o campo de view fique dentro do canal microfluídico. Depois de conectar o tubo de saída à bomba da seringa, lave o canal microfluídico com um novo tampão de bloqueio puxando o êmbolo da seringa para trás.Verifique se não há bolhas presas na tubulação ou no canal. Dilua 1 microlitro do substrato de DNA preparado em 1 mililitro de tampão de bloqueio. Coloque o tubo de entrada no substrato de DNA diluído e flua 800 microlitros da solução de substrato através do canal a uma taxa de 200 microlitros por minuto.Deixe a solução de DNA incubar no canal por 15 minutos após a interrupção do fluxo. Após a incubação, flua pelo menos 800 microlitros de tampão de bloqueio através do canal a uma taxa de 200 microlitros por minuto para enxaguar o DNA não ligado do canal. Ajuste o foco do microscópio para que os pontos quânticos conectados à superfície fiquem claramente visíveis.Lave o dispositivo microfluídico com 800 microlitros de tampão experimental sem magnésio a uma taxa de fluxo de 200 microlitros por minuto. Adicionar a REase a uma alíquota de tampão experimental sem magnésio e misturar delicadamente por pipetagem. Fluxo de 800 microlitros de 400 unidades por mililitro de EcoRV através do canal a uma taxa de fluxo de 200 microlitros por minuto.Inicie o experimento fluindo o tampão experimental contendo magnésio e fluoresceína a uma taxa de fluxo de 200 microlitros por minuto. Comece a capturar dados imediatamente após iniciar a bomba de seringa. Pare a aquisição de dados após fluir 800 microlitros de buffer.Depois de introduzir o substrato de DNA na célula de fluxo e lavar o excesso de DNA e pontos quânticos, normalmente existem milhares de pontos quânticos individuais em um campo de visão. Eles são fixados de forma estável à superfície do vidro e não sofrem escurecimento perceptível ou branqueamento significativo durante o experimento. Quando a REase fluiu através do canal na ausência de magnésio, pelo menos 95% dos pontos quânticos presentes no início do experimento ainda podem ser vistos no final do período de observação.No entanto, quando o tampão contendo magnésio flui imediatamente após o REase, até metade dos pontos quânticos desaparecem no final do período de observação, semelhante ao que é observado quando o REase e o magnésio fluem juntos pelo canal. O desaparecimento do ponto quântico acontece rapidamente e resulta em uma diminuição acentuada na trajetória de intensidade, fornecendo uma indicação clara do tempo em que uma determinada molécula de DNA é clivada. Este experimento foi realizado com o P REase EcoRV tipo II bem estudado.Tanto o ajuste da curva de mínimos quadrados não linear quanto a estimativa do parâmetro de máxima verossimilhança foram usados para extrair os valores de n e beta dos dados. Os dois métodos de estimação de parâmetros estavam de acordo. Usando o ajuste de mínimos quadrados não lineares, n foi de 3,52 e beta foi de 5,78 segundos.Usando a estimativa de máxima verossimilhança, n foi de 3,41 e beta foi de 6,06 segundos. Este ensaio pode fornecer evidências da presença de etapas intermediárias ao longo da via de clivagem. A realização deste ensaio sob condições de reação variáveis pode ajudar a estabelecer a natureza dos intermediários de reação que não podem ser observados diretamente.

single-molecule-dwell-time-analysis-restriction-endonuclease-mediated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

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Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

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Métodos de transferência da energia da ressonância da único-molécula Förster para a investigação tempo real da definição da junção de Holliday por GEN1

Um método altamente paralelo para medir o decote específico do DNA no nível da molécula única é descrito. Este protocolo demonstra a técnica utilizando a restrição endonuclease NdeI. O método pode ser facilmente modificado para estudar qualquer processo que resulte em decote de DNA específico do local.

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Este artigo descreve um protocolo para estudar as interações DNA-proteína usando um sistema de interferometria de biocamada (BLI) baseado em estreptavidina. Ele descreve as etapas e considerações essenciais para a utilização da cinética de ligação básica ou avançada para determinar a afinidade de ligação de equilíbrio (KD) da interação.

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Este protocolo demonstra a realização de um ensaio de molécula única para visualização ao vivo do desenrolamento do DNA por CMG helicase. Ele descreve (1) a preparação de um substrato de DNA, (2) a purificação de Drosophila melanogaster CMG helicase marcada com fluorescência, (3) a preparação de uma célula de fluxo microfluídico para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) e (4) o ensaio de desenrolamento de DNA de molécula única.

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Aprenda a observar clivagem de DNA mediada por endonucleases de restrição em nível de molécula única usando microscopia de fluorescência. Este método multiplexado permite analisar centenas de REases simultaneamente para estudar mecanismos catalíticos.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

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