Name: Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a avaliar o encurtamento de sarcômeros em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes usando proteínas marcadas por fluorescência. Este método permite visualizar a função sarcomérica in vitro e desenvolver terapias para cardiomiopatias.

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Gostaríamos de reconhecer todos os membros do laboratório da Divisão de Medicina Regenerativa da Universidade Médica de Jichi pela discussão e assistência técnica úteis. Este estudo foi apoiado pelas bolsas da Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED; JP18bm0704012 e JP20bm0804018), a Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS; JP19KK0219), e a Sociedade de Circulação Japonesa (a Bolsa para Pesquisa Básica) para a H.U.

<ol><li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li>
<li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li>
<li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%3A+Progress%2C+Promises+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30(2020).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense-mediated+exon+skipping%3A+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li>
<li>Cho, G. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li>
<li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li>
<li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li>
<li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li>
<li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511%2F521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).</li>
<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
<li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+%28ES%29+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).</li>
<li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).</li>
<li>Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV%3A+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).</li>
<li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).</li>
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<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization%2C+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).</li>
<li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li>
</ol>

A H.U. registrou uma patente relacionada a este manuscrito.

Os PSC-CMs têm grande potencial para serem utilizados como uma plataforma in vitro para modelar doenças cardíacas e testar os efeitos das drogas. No entanto, um método preciso e unificado para avaliar as funções do PSC-CMs deve ser primeiro estabelecido. A maioria dos testes funcionais funciona com PSC-CMs, por exemplo, eletrofisiologia, transitório de cálcio e metabolismo26, e um dos primeiros estudos de PSC-CM derivados do paciente foi sobre a síndrome de QT longo27</s...

As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade em todo o mundo1 e a cardiomiopatia representa a terceira causa de mortes cardíacas2. Cardiomiopatia é um grupo coletivo de doenças que afetam os músculos cardíacos. Os recentes desenvolvimentos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) e a diferenciação direcionada das células iPS em direção aos cardiomiócitos (PSC-CMs) abriram a porta para o estudo de cardiomiócitos com genoma do paciente como modelo in vitro de cardiomiopatia. Essas células podem ser utilizadas para entender a fisiopatologia de doenças cardíacas, para elucidar seus mecanismos moleculares e testar diferentes candidatos terapêuticos3. Há uma enorme quantidade de interesse, assim, células iPS derivadas do paciente têm sido geradas (por exemplo, cardiomiopatia hipertrófica [HCM]4,5, cardiomiopatia ventricular direita arrhythmogênica [ARVC]6, cardiomiopatia dilatada [DCM]7, e cardiomiopatias relacionadas à mitocondrial8,9). Como uma das características da cardiomiopatia é a disfunção e a interrupção dos sarcomeres, é necessária uma ferramenta válida que mede uniformemente a função sarcomere.
O encurtamento de Sarcomere é a técnica mais utilizada para avaliar a função de sarcomere e a contratilidade de cardiomiócitos adultos derivados de modelos animais e humanos. Para realizar o encurtamento de sarcomere, são necessários sarcomeres bem desenvolvidos que sejam visíveis sob contraste de fase. No entanto, os PSC-CMs cultivados in vitro exibem sarcomeres subdesenvolvidos e desorganizados e, portanto, não podem ser usados para medir adequadamente o encurtamento de sarcomere10. Essa dificuldade de avaliar adequadamente a contrateriedade dos PSC-CMs dificulta seu uso como plataforma para avaliar funções cardíacas in vitro. Para avaliar a contratilidade do PSC-CMs indiretamente, microscopia de força atômica, micro-matrizes pós-postes, microscopia de força de tração e medidas de impedância têm sido utilizadas para medir os efeitos do movimento exercido por essas células em seus arredores11,12,13. Gravações de vídeo-microscopia mais sofisticadas e menos invasivas do movimento celular real (por exemplo, SI8000 da SONY) podem ser usadas para avaliar alternativamente sua contratilidade, no entanto, este método não mede diretamente o movimento sarcomere ou força a geração cinética14.
Para medir diretamente o movimento do sarcomere em PSC-CMs, novas abordagens, como a marcação fluorescente à proteína sarcomere, estão surgindo. Por exemplo, lifeact é usado para rotular fisomotos actin (F-actin) para medir o movimento sarcomere15,16. Células iPS geneticamente modificadas são outra opção para a marcação de proteínas sarcomere (por exemplo, α-actinin [ACTN2] e Myomesin-2 [MYOM2]) por proteína fluorescente17,18,19.
Neste artigo, descrevemos como realizar imagens de lapso de tempo para medir o encurtamento de sarcomere usando myom2-TagRFP (células embrionárias de tronco de camundongo [ES] e ACTN2-mCherry (células iPS humanas). Também mostramos que uma cultura padronizada facilita o alinhamento do sarcomere. Além disso, descrevemos um método alternativo de rotulagem de sarcomere, usando vírus associados ao adeno (AAVs), que pode ser amplamente aplicado às células iPS derivadas do paciente.

<table><tbody><tr><td>1-Tioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (55mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Polímero de 2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC),</td> <td>NOF Corp.</td><td>LIPIDURE-CM5206</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>prato de imagem de 35 mm com uma lamínula de polímero (&micro;-Dish 35 mm, alto)</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>AAVproR Helper Free System (AAV6) (vetores; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td><td>Takara</td><td>6651</td><td></td></tr><tr><td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td><td>N.A.</td><td></td><td>Inserimos resistente a IRES-puromicina em 3' UTR de locus TNNT2 e mCherry ao redor do códon de parada de ACTN2 na linha 610B1 hiPSC, seguindo um método descrito em outro lugar (Anzai, Methods Mol Biol, no prelo)</td></tr> <tr><td>Suplemento B-27 (50X), suplemento Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 sem soro, menos insulina</td><td>Suplemento Thermo Fisher Scientific</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50X), menos vitamina A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase (25 U/&micro; L)</td> <td>Merck Millipore</td><td>70746</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Blasticidina S</td><td>Fujifilm wako</td><td>029-18701</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4, Humano, Recombinante,</td> <td>R & D Sistemas, Inc.</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-100g</td><td></td></tr><tr><td>C59, antagonista Wnt (WntC59)</td> <td>abcam</td><td>ab142216</td><td></td></tr><tr><td>software de desenho CAD,</td> <td>Robert McNeel and Associates, WA, EUA</td> Unidade de ultrafiltração centrífuga <td>Rhinoceros 6.0</td><td></td></tr><tr><td>(100k MWCO), Vivaspin-20</td><td>Sartorius</td><td>VS2042</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Corrosão de cromo</td><td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japão</td><td>N14B</td><td></td></tr><tr><td>Máscara de cromo revestida com AZP1350</td><td>Clean Surface Technology Co., Japão</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Transportador de precipitação (20mg/mL de glicogênio, acetato de sódio 3 M (pH 5,2)))</td><td>Takara</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio (DMEM) - glicose alta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio (DMEM) - glicose alta, sem piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,5)</td><td>Fujifilm wako</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Moregate</td><td>59301104</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10, Humano, Recombinante,</td> <td>R& D Sistemas, Inc.</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos (básico), humano, recombinante</td><td>Fujifilm wako</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pó de pele suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100g</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td><td>Placas de cultura Sigma-Aldrich</td><td>G5154-500</td><td></td></tr><tr><td>FUNDO DE VIDRO</td><td>MatTek</td><td>P24G-1.5-13-F/H</td><td></td></tr><tr><td>Ham& rsquo; s F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-062</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-061</td><td></td></tr><tr><td>L-alanina-L-glutamina (Suplemento GlutaMAX, 200mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Ácido Ascórbico Sal de Sódio</td><td>Fujifilm wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>Laminina-511 Fragmento E8 ( LN511-E8, iMatrix-511)</td><td>Nippi</td><td>892012</td><td></td></tr><tr><td>Máscara alinhador</td><td>Union Optical Co., Ltd., Japão</td><td>PEM-800</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de litografia sem máscara</td><td>NanoSystem Solutions, Inc., Japão</td><td>D-Light DL-1000</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Unidade de Filtro de Seringa, 0.45 &micro; m, PVDF (0,45-&micro; filtro m)</td> <td>Merck Millipore</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Myom2-RFP (SMM18)</td> <td>N.A.</td><td></td><td>Desenvolvido em nosso artigo anterior (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 câmera digital CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sansei medical co. Ltd</td><td>01-004</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1)</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) elastômero</td><td>Dow Corning Corp., MI, EUA</td><td>SILPOT 184</td><td></td></tr><tr><td>polietilenimina MAX (MW. 40.000)</td><td>Policiência</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>Revelador de fotorresistência positivo</td><td>Tokyo Ohka Kogyo Co. , Ltd., Japão</td><td>NMD-3</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9034</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Puromicina</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-23153</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Humano / Rato / Rato Ativina A Proteína R</td><td>& D Sistemas, Inc.</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>Protease recombinante semelhante à tripsina (rTripsina; TrypLE express)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Médio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Bolacha de silício</td><td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japão</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Mikasa Co., Ltd., Japão</td><td>MS-A100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia confocal giratória</td><td>Oxford Instruments</td><td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td><td></td></tr><tr><td>StemSure LIF, Mouse, recombinante, Solução (10^6U)</td><td>Fujifilm wako</td><td>195-16053</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3010</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, EUA</td><td>SU-8 3010</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 desenvolvedor</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, EUA</td> Desenvolvedor <td></td><td>SU-8</td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Endotelial Vascular-A165 (VEGF), Humano, recombinante</td><td>Fujifilm wako</td><td>226-01781</td><td></td></tr></tbody></table>

encurtamento sarcomere de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes usando proteínas sarcomere marcadas por fluorescentes.

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes (PSC-CMs) podem ser produzidos a partir de células pluripotentes embrionárias e induzidas (ES/iPS). Essas células fornecem fontes promissoras para a modelagem de doenças cardíacas. Para cardiomiopatias, o encurtamento de sarcomere é uma das avaliações fisiológicas padrão que são usadas com cardiomiócitos adultos para examinar seus fenótipos da doença. No entanto, os métodos disponíveis não são apropriados para avaliar a contratude dos PSC-CMs, uma vez que essas células têm sarcomeres subdesenvolvidos que são invisíveis sob microscopia de contraste de fase. Para abordar essa questão e realizar o encurtamento de sarcomere com PSC-CMs, foram utilizadas proteínas de sarcomere com marca fluorescente e imagens vivas fluorescentes. Linhas Z finas e uma linha M residem em ambas as extremidades e no centro de um sarcomere, respectivamente. As proteínas de linha Z — α-Actinin (ACTN2), Teletonina (TCAP) e proteína LIM associada à actina (PDLIM3) — e uma proteína de linha M — Myomesin-2 (Myom2) — foram marcadas com proteínas fluorescentes. Essas proteínas marcadas podem ser expressas a partir de alelos endógenos como knock-ins ou de vírus associados ao Adeno (AAVs). Aqui, introduzimos os métodos para diferenciar células-tronco pluripotentes de camundongos e humanos aos cardiomiócitos, produzir AAVs e realizar e analisar imagens ao vivo. Descrevemos também os métodos de produção de selos de polidimtilsiloxano (PDMS) para uma cultura padronizada de PSC-CMs, o que facilita a análise do encurtamento de sarcomere com proteínas fluorescentes marcadas. Para avaliar o encurtamento do sarcomere, as imagens de lapso de tempo das células batidas foram registradas em uma taxa de quadros alta (50-100 quadros por segundo) sob estimulação elétrica (0,5-1 Hz). Para analisar o comprimento do sarcomere ao longo da contração celular, as imagens gravadas de lapso de tempo foram submetidas ao SarcOptiM, um plug-in para ImageJ/Fiji. Nossa estratégia fornece uma plataforma simples para investigar fenótipos de doenças cardíacas em PSC-CMs.

Medindo o encurtamento do sarcomere usando linhas de repórteres do PSC-CMs. Psc-CMs rotulados por Sarcomere foram usados para medir o encurtamento de sarcomere. As linhas expressam Myom2-RFP e ACTN2-mCherry de loci endógeno. TagRFP foi inserido no Myom2, codificando proteínas M que se localizam na linha M, enquanto mCherry foi derrubado no ACTN2, codificando α-Actinin, que se localiza para a linha Z18,...

Este método pode ser usado para examinar o encurtamento do sarcomere usando cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco com proteínas de sarcomere marcadas por fluorescentes.

Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

É difícil avaliar a função de sarcomere nos cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco devido ao seu sarcomere subdesenvolvido e desorganizado. Usando proteínas de sarcomere com marca fluorescente, agora podemos acessar o encurtamento de sarcomere. Podemos visualizar sarcomeres e avaliar sua função in vitro usando cardiomiócitos derivados de células-tronco e proteínas de sarcomere com marca fluorescente.Usando a transdução baseada em AAV, podemos expandir o método para qualquer célula-tronco pluripotente induzida pelo paciente. Este método pode ser expandido para o desenvolvimento da terapia de cardiomiopatia, pois pode ser usado para avaliar diretamente a disfunção sarcomere relacionada à doença in vitro. Esse método é útil na área de cardiologia, incluindo o estudo de cardiologia pediátrica.No entanto, também pode ser aplicado ao estudo da disfunção muscular esquelética, como a miopatia. No dia menos quatro de indução de diferenciação, cubra uma placa de seis poços com 0,5 microgramas por centímetro quadrado de laminina-511 E8 diluída em PBS para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Aproximando-se do fim da incubação, trate as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem com trippsina recombinante por três minutos a 37 graus Celsius.Quando as células se separarem, colhiu células para médio suplementadas com 10% de FBS para contagem, e resuspenque as células a uma 1,25 vezes 10 às quintas células por dois mililitros de AK02N médio suplementado com laminina-511 E8 e inibidor de ROCHA após centrifugação. Em seguida, aspire a solução de revestimento de cada poço da placa de seis poços, e semente dois mililitros de células em cada poço. Devolva a placa à incubadora de cultura celular.Após quatro dias, as células atingem 80% de confluência. Substitua o supernasce em cada poço por dois mililitros de RPMI mais B27 sem insulina média suplementada com inibidor GSK-3 por poço para induzir a diferenciação. Após dois dias de diferenciação, substitua suavemente o meio por dois mililitros de RPMI mais B27 sem insulina média suplementada com inibidor de porco-espinho por poço.As células deveriam ter atingido 100% de confluência. No quarto dia de diferenciação, substitua suavemente os supernantes por dois mililitros de RPMI mais B27 sem insulina por poço. As células devem permanecer em alta densidade, e algumas podem ter começado a flutuar.Nos dias sete e nove de diferenciação, substitua o supernaente em cada poço por dois mililitros de RPMI mais B27 por insulina suplementada com puramicina para cultura de cardiomiócito pluripotente seletivo derivado de células-tronco. Neste ponto, as células batidas devem ser observadas dentro das culturas. Para configurar uma cultura de cardiomiócito pluripotente padronizada, primeiro use fita de remendamento para remover qualquer poeira da superfície de um selo PDMS personalizado, e submergir brevemente o selo em 70% de etanol.Use um espanador de ar para remover o etanol da superfície do selo e trate a superfície com cinco a 10 microliters de polímero mpc e etanol de 0,5%. Quando o polímero estiver completamente seco, coloque o carimbo em uma tampa de polímero em uma folha de imagem de 35 milímetros e coloque um peso sobre o carimbo. Após 10 minutos, use um microscópio leve para confirmar que o padrão foi transferido para o deslizamento de cobertura, e lave o prato e cubra duas vezes com PBS.Após a segunda lavagem, cubra a tampa com 0,5 a um micrograma por centímetro quadrado de laminina-511 E8 diluída em gelatina de 0,1% para uma incubação de duas a quatro horas à temperatura ambiente. No dia 10 de diferenciação, lave as células duas vezes com PBS, seguida de tratamento com um mililitro de trippsina recombinante por poço por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a contagem, resuspenque as células em um 2,5 a cinco vezes 10 para as quintas células por mililitro de RPMI mais B27 com insulina suplementada com concentração de puromicina, e sementes um mililitro de células na placa para uma incubação durante a noite a 37 graus Celsius.Na manhã seguinte, substitua o supernaente por RPMI fresco mais B27 por insulina suplementada com puramicina, e devolva as células à incubadora de cultura celular, refrescando o meio de duas a três vezes por semana até os dias 21 a 28 para imagem. Para a imagem de lapso de tempo do encurtamento do sarcomere nas culturas DO PCCSM, aplique óleo à lente 100 vezes objetiva de um microscópio confocal fluorescente e selecione condições de imagem ao vivo no software associado. Para obter bons dados representativos, selecione a taxa de quadros mais alta, defina o obturador para abrir e aplique um binning de quatro por quatro em uma cultura da área de aquisição para obter os intervalos mais curtos entre as imagens durante a imagem de lapso de tempo.Se a taxa de batida das células for baixa, evoque as células por estimulação de campo elétrico e inicie a gravação de lapso de tempo, tomando cuidado para que o campo de imagem permaneça em foco durante a imagem. No final do período de imagem, salve as imagens de lapso de tempo em uma pasta apropriada. Para analisar as imagens de lapso de tempo, abra uma série de imagens de lapso de tempo no ImageJ e ajuste o brilho e o contraste das imagens até que o padrão sarcomere possa ser claramente observado.No menu Mais Ferramentas, selecione SarcOptiM e pressione o Controle Shift P e o botão um mícndo na barra de ferramentas para usar as instruções para calibrar o programa. Em seguida, desenhe uma linha através da região do sarcomere para ser usada para medir o encurtamento de sarcomere, e clique em Single Cell AVI para iniciar a análise de encurtamento de sarcomere. Imagens de lapso de tempo de cardiomiócitos pluripotentes com células-tronco padronizadas e padronizadas podem ser usadas para medir o encurtamento de sarcomere em diferentes pontos de tempo.Para superar a desorganização sarcomere tipicamente observada em culturas de cardiomiócitos pluripotentes padronizadas derivadas de células-tronco, selos específicos de PDMS podem ser usados para cultivar cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco padronizados em um padrão de listras, o que promove uma forma celular alongada e um padrão de sarcomere mais organizado em comparação com células cultivadas em uma área não padrão. Culturas padronizadas também promovem uma melhor contração celular e fornecem um perfil suave de comprimento de sarcomere em comparação com células cultivadas sem padrão. Cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco derivados de células-tronco aAV expressam sinais sarcomericos de GFP ao longo dos cardiomiócitos pluripotentes padronizados derivados de células-tronco já em três dias após a transdução e também podem ser usados para medir perfis de contração de sarcomere.Além disso, a adição de genes resistentes a blasticidinas durante a transdução também pode ser usada para facilitar a seleção de cardiomioces derivados de células-tronco pluripotentes padronizados a uma pureza de mais de 90% Para facilitar uma análise de imagem mais fácil e de maior qualidade, é essencial identificar uma área com sarcomeres que se movem linearmente e obter imagens na maior taxa de quadros. Usando este método, podemos avaliar o papel da maturação em proteínas de sarcoma para estudar a disfunção do sarcomere em cardiomiócitos de laboratório derivados de células iPS específicas da doença, derivadas do paciente.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Adulto miócitos cardíacos são células primárias que podem ser isoladas de corações de animais e cultivados por vários dias. Dentro deste período a cultura de transferência de gene adenoviral podem ser usadas para expressar biossensores geneticamente codificado (GEBS) ou proteínas de fusão fluorescente. Ambas as abordagens permitem investigações celular por meio de microscopia confocal.

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Mutações que levam a defeitos cardíacos congênitos se beneficiam da investigação in vivo da estrutura cardíaca durante o desenvolvimento, mas estudos estruturais de alta resolução no coração embrionário de camundongos são tecnicamente desafiadores. Aqui apresentamos um método robusto de imunofluorescência e análise de imagem para avaliar estruturas específicas de cardiomiócitos no coração de camundongo em desenvolvimento.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca2 + reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.

Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado

Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

A formação de uma rede de sarcomere adequada é importante para o amadurecimento dos cardiomiócitos derivados do iPSC. Apresentamos uma abordagem baseada em super resolução que permite a avaliação quantitativa da maturação estrutural dos cardiomiócitos derivados de células-tronco, para melhorar as condições culturais que promovem o desenvolvimento cardíaco.

Analisando a rede de α-Actinin em Cardiomiócitos derivados do iPSC humano usando microscopia de localização de molécula única

Aqui descrevemos a aquisição óptica e a caracterização de potenciais de ação a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos usando um sistema de fotometria modular de alta velocidade.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Aqui, um método estabelecido é descrito para realizar medidas de contratilidade e cálcio em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos usando uma plataforma óptica. Esta plataforma permite aos investigadores estudar o efeito das mutações e a resposta a vários estímulos de forma rápida e reprodutível.

Medidas em Tempo Real de Parâmetros de Cálcio e Contratilidade em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos Humanos

Aprenda a avaliar o encurtamento de sarcômeros em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes usando proteínas marcadas por fluorescência. Este método permite visualizar a função sarcomérica in vitro e desenvolver terapias para cardiomiopatias.

Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes. (Vídeo) | JoVE Journal

Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes.

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