Name: Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda a isolar e transfectar células epiteliais de pigmento de cinco mamíferos para terapia gênica ocular não viral usando o sistema SB100X. Este método oferece alta viabilidade celular e flexibilidade para pesquisas translacionais.

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Um agradecimento merece a Gregg Sealy e Alain Conti por sua excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Comissão Europeia no contexto do Sétimo Programa-Quadro, da Fundação Nacional de Ciências Suíça e da Fundação Schmieder-Bohrisch. Z.I. recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] e B.M.W. de uma Bolsa de Pesquisa Fulbright e bolsa de excelência do governo suíço.

Os protocolos em que os animais estavam envolvidos foram realizados por pessoal certificado e após autorização do Cantonal Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale de Genebra, Suíça, e de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmica e Visão (aprovação sem aprovação). GE/94/17). Ratos adultos e saudáveis da Noruega, camundongos C57BL/6 e coelhos brancos neozelandeses foram eutanizados por uma overdose de pentobarbital (150 mg/kg) diluídos em 0,9% NaCl injetado intraperitoneal e os olhos foram enucleados imediatamente após o sacrifício. Olhos suínos e bovinos foram obtidos de um matadouro local dentro de 6 horas após o sacrifício e foram transportados para o laboratório no gelo.
1. Antes da preparação
<ol><li>Prepare o meio completo (DMEM/Ham's F12 complementado com soro bovino fetal de 10% (FBS), penicilina U/mL / 80 μg/mL estreptomicina e 2,5 μg/mL de anfotericina B). Aqueça o médio, 1x PBS e 0,25% de trippsina (se necessário) em um banho de água de 37 °C.</li>
	<li>Coloque uma cortina estéril no capô para preparar um local de trabalho asséptico. Introduza todos os instrumentos e materiais estéreis necessários dentro do capô. NOTA: Apenas a enucleação dos olhos e a limpeza do tecido muscular e da pele restantes são os procedimentos realizados fora do capô, o restante das etapas deve ser realizada dentro do capô.</li>
</ol>2. Isolamento de células pe de rato/rato
<ol><li>Use tesouras curvas e fórceps colibri para enuclear os olhos após eutanásia do animal. Limpe o tecido muscular e a pele restantes dos olhos usando tesouras e fórceps (não estéreis). NOTA: O tamanho da tesoura e fórceps utilizados para a enucleação e limpeza dos olhos depende da espécie (por exemplo, para ratos e camundongos os instrumentos serão menores do que os utilizados para suínos e bovinos) (ver Figura S1).<ol>
<li>Colete os olhos em um tubo de 50 mL cheio de PBS não estérei e transfira o tubo para o capô de fluxo laminar. Desinfete os olhos submergindo por 2 min em solução à base de iodo, em seguida, transfira-os para uma placa de Petri cheia de PBS estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abertura da lâmpada<ol>
<li>Depois de transferir os olhos para uma placa de Petri estéril, segure um firmemente perto do nervo óptico com colibri ou fórceps pontiagudos. Faça um buraco perto do limite da íris (entre pars plana e ora serrata) com uma agulha de 18 G. Insira uma tesoura pequena no orifício e corte ao redor da íris. Retire o segmento anterior (córnea, lente e íris) e coloque-o em uma placa de Petri. Deixe a lâmpada com o vítreo até que as células RPE estejam isoladas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento das células IPE<ol>
<li>Remova a lente e com fórceps finos puxe delicadamente a íris contendo as células IPE. Coloque a íris em uma placa de Petri, lave com PBS estéril e deixe-a na PBS até que mais íris estejam preparadas.</li>
		<li>Repita os passos 2.2.1 a 2.3.1 para que todos os olhos estejam preparados naquele dia.</li>
		<li>Adicione 50 μL de 0,25% de trippsina por íris e incubar por 10 min a 37 °C. Remova a trippsina, adicione 150 μL de meio completo por íris e raspe o IPE delicadamente com uma pipeta Pasteur polida em fogo plano; usar fórceps finos para imobilizar o tecido. Pegue a suspensão do celular e coloque em um tubo de 1,5 mL. Use 10 μL da suspensão celular diluída 1:3 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer34,35.</li>
		<li>Se não for transfeinado imediatamente, semente 200.000 células/poço em uma placa de 24 poços (100.000 células/cm2) em 1 mL de meio completo (10% FBS) (para semeadura ver Tabela 1). Coloque a placa em uma incubadora e culta a 37 °C, 5% DE CO2. NOTA: Pode ser necessário reunir vários olhos para ter células suficientes para semeadura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento de células RPE<ol>
<li>Remova o humor vítreo e a retina do segmento posterior com fórceps finos. Evite danificar o pigmento da retina epitélio.</li>
		<li>Corte o segmento ao meio com um bisturi #10 para ter o globo completamente aberto e lavar com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 50 μL de 0,25% de trippsina por olho e incubar por 10 min a 37 °C. Remova a trippsina e adicione 150 μL de meio completo por globo e raspe delicadamente as células RPE com um bisturi redondo; usar fórceps finos para imobilizar o tecido. Pegue a suspensão da célula e coloque-a em um tubo de 1,5 mL. Tome 10 μL da suspensão da célula; diluir 1:4 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.</li>
		<li>Veja o passo 2.3.4. NOTA: Pode ser necessário reunir vários olhos para ter células suficientes para semeadura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolamento de células pe coelho
<ol><li>Realizar limpeza e desinfecção conforme descrito nas etapas 2.1 a 2.1.1.</li>
	<li>Coloque um olho em uma compressa de gaze estéril e segure-a firmemente perto do nervo óptico. Abra o olho com o bisturi #11 e a tesoura cerca de 2 mm sob o limbus. Retire o segmento anterior (córnea, lente e íris) e coloque-o em uma placa de Petri. Deixe a lâmpada com o vítreo até que as células RPE estejam isoladas.</li>
	<li>Isolamento das células IPE<ol>
<li>Realizar a etapa 2.3.1. Remova o corpo ciliar da íris cortando com um bisturi #10.</li>
		<li>Após a preparação de 2 íris, incubar com 1 mL de 0,25 % trypsin a 37 °C por 10 min; durante este tempo, as células RPE podem ser isoladas (ver passo 3.4). Remova a trippsina e adicione 1 mL de meio completo à íris e isole as células coçando cuidadosamente com uma pipeta Pasteur polida em fogo plano. Resuspente as células cuidadosamente por pipetação e transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL. Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua 1:3 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.</li>
		<li>Veja o passo 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento de células RPE<ol>
<li>Faça a etapa 2.4.1.</li>
		<li>Coloque uma gaze estéril em uma placa de 12 poços e coloque a lâmpada sobre a gaze.</li>
		<li>Lave com PBS e realize a etapa 2.4.3. NOTA: Use uma pipeta Pasteur polida com fogo curva.</li>
		<li>Centrifugar as células 10 min a 120 x g.</li>
		<li>Veja o passo 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Isolamento de células de PE suínas
<ol><li>Realizar a limpeza conforme descrito na etapa 2.1. Lave com PBS e desinfete os olhos submergindo por 2 min em solução à base de iodo, enxágue com PBS. Continue com o passo 3.2.</li>
	<li>Isolamento das células IPE<ol>
<li>Realizar a etapa 3.3.1. Após a preparação de 2 íris, adicione 1 mL de meio completo e isole as células coçando cuidadosamente com uma pipeta Pasteur polida em fogo plano. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL. Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua 1:4 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.</li>
		<li>Veja o passo 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento de células RPE<ol>
<li>Faça a etapa 2.4.1. Coloque a lâmpada em uma placa de Petri e lave com PBS. Encha a lâmpada com meio completo de 1 mL.</li>
		<li>Usando uma pipeta Pasteur polida com fogo curva, remova cuidadosamente as células RPE. Certifique-se de raspar de baixo para cima para evitar escorregar para baixo do complexo de membrana do choroid-Bruch. Colete a suspensão da célula dentro da lâmpada usando uma pipeta de 1.000 μL e transfira para um tubo de 1,5 mL para ressuspensão. Tome 10 μL da suspensão celular e diluir 1:8 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.</li>
		<li>Veja o passo 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Isolamento de células pe bovinas
<ol><li>Realizar a limpeza conforme descrito na etapa 2.1. Lave com PBS e desinfete os olhos submergindo por 2 min em solução à base de iodo, enxágue com PBS. Continue com o passo 3.2.</li>
	<li>Isolamento das células IPE<ol>
<li>Realizar a etapa 3.3.1. Após a preparação de duas íris, incubar com 2 mL de 0,25% de trippsina a 37 °C por 10 min. Durante esse tempo, as células RPE podem ser isoladas (ver passo 5.3).</li>
		<li>Remova a trippsina e adicione 2 mL de meio completo à íris e isole as células coçando cuidadosamente com uma pipeta Pasteur polida em fogo plano. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL. Centrifugar as células 10 min a 120 x g. Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua 1:4 com azul trypan para contar as células na câmara de Neubauer.</li>
		<li>Se não for transfeinado imediatamente, semente 320.000 células/bem em uma placa de 6 poços em 3 mL de meio completo (10% FBS) (para semeadura ver Tabela 1). Coloque a placa em uma incubadora e culta a 37 °C, 5% DE CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento de células RPE<ol>
<li>Siga o passo 2.4.1. Coloque a lâmpada em uma placa de Petri e lave com PBS. Após a preparação de 2 olhos encha a lâmpada cerca de 3/4 com trippsina e incubar por 25 min a 37 °C com a tampa da placa de Petri em cima do bulbi.</li>
		<li>Retire o trypsin e adicione 1 mL de meio completo. Realizar a etapa 4.3.2. Centrifugar as células 10 min a 120 x g.</li>
		<li>Veja o passo 5.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cultivo - mudança média
<ol><li>Cultura as células no F12 do DMEM/Ham, complementadas com 10% FBS, penicilina U/mL / 80 μg/mL estreptomicina, e 2,5 μg/mL de anfotericina B, a 37°C e 5% CO2 em uma incubadora umidificada. Depois de 3-4 dias pipeta para cima e para baixo para coletar células não aderentes e colocar metade do volume em outro poço. Encha até 1 mL com meio completo. NOTA: Isso permite ter uma superfície grande o suficiente para todas as células isoladas para anexar e maximizar a saída.</li>
	<li>Após mais 3-4 dias, repita a coleção celular, mas desta vez unindo as células não aderentes de dois poços em um poço (por exemplo, A1+B1 em C1). Adicione meio a todos os poços. Observe as células e troque o meio 2 vezes por semana (para placas de 6 e 24 poços, use 3 e 1 mL/poço, respectivamente). Quando as células atingirem a confluência, mude para meio completo com 1% de FBS ou use as células para experimentos (por exemplo, transfecção). NOTA: As células RPE e IPE são confluentes após 3-4 e 4-5 semanas após o isolamento, respectivamente. A pureza da cultura celular foi corroborada verificando a morfologia celular (células pigmentadas) e marcadores específicos como descrito por Johnen e colegas36.</li>
</ol>7. Eletroporação de células pe primárias
<ol><li>Realize eletroporação conforme descrito antesde 1,37.</li>
	<li>Dependendo do número de células transfeinadas usar placas de 6, 24 ou 48 poços (ver Tabela 2) para semear as células em médio sem antibióticos ou antimicópticos. Para as 2 semanas seguintes adicione gotas com penicilina média (80 U/mL), estreptomicina (80 μg/mL) e anfotericina B (2,5 μg/mL) duas vezes por semana. Troque o meio completamente 2 semanas após a transfecção.</li>
	<li>Para determinar o crescimento celular, a eficiência da transfecção e a secreção de proteínas, monitore as células semanalmente por microscopia e analise a cultura celular supernacida pela mancha ocidental. Antes do término da cultura, pegue um supernacante de cultura celular de 24 horas para quantificar a secreção de proteínas pela ELISA, conte as células, meça fluorescência por citometria baseada em imagem (no caso de células transfectadas de Vênus)seguindo as instruções dos fabricantes (ver Tabela de Materiais),e colete a pelota celular para análise de expressão genética baseada em RT-qPCR. NOTA: Esses métodos não estão incluídos no presente artigo, pois não se trata de explicar detalhadamente a análise das células, mas sim seu isolamento. A densidade de semeadura celular é a mesma para todas as espécies (100.000 células/cm2), mas como o número de células isoladas varia, foram utilizadas diferentes placas. Além disso, para ratos, ratos e coelho pode ser necessário juntar 2-3 olhos para ter células suficientes para semeadura.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Espécie</td>
			<td>Tratamento de tripca</td>
			<td>Células N° IPE</td>
			<td>Células N° RPE</td>
			<td>Placa para semeadura (100.000 células/cm2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rato/rato</td>
			<td>Sim</td>
			<td>~50.000</td>
			<td>~150.000</td>
			<td>Placas de 24 poços</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coelho</td>
			<td>Sim</td>
			<td>~350.000</td>
			<td>~2.500.000</td>
			<td>Placas de 24 poços</td>
		</tr>
<tr>
<td>Porco</td>
			<td>Não</td>
			<td>~1.000.000</td>
			<td>~3.000.000</td>
			<td>Placas de 24 poços</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bovina</td>
			<td>Sim</td>
			<td>~1.700.000</td>
			<td>~5.000.000</td>
			<td>Placas de 6 poços</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Número de células pe primárias isoladas de olhos de diferentes espécies.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Área</td>
			<td>Meio de volume</td>
			<td>Tripsina</td>
			<td>Meio de volume para parar a ação de trypsin</td>
			<td>Densidade de semeadura</td>
		</tr>
<tr>
<td>Placa de 6 poços</td>
			<td>9,6 cm²</td>
			<td>3,0 mL</td>
			<td>0,5 mL</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>3x105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Placa de 24 poços</td>
			<td>2,0 cm²</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>0,2 mL</td>
			<td>0,8 mL</td>
			<td>5x104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Placa de 48 poços</td>
			<td>1,1 cm²</td>
			<td>0,5 mL</td>
			<td>0,1 mL</td>
			<td>0,4 mL</td>
			<td>0.5-1x104
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Volumes de cultura celular e densidades de semeadura.

Os autores não têm nada a revelar.

Ter métodos padronizados para isolar e cultivar células de PE é fundamental no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para doenças degenerativas da retina. Com os protocolos aqui apresentados, as células pe podem ser isoladas com sucesso de diferentes espécies e cultivadas por longos períodos (até agora, a cultura mais longa foi mantida por 2 anos1,38); tipicamente células pe morfologia, pigmentação e função foi observada(Figura 1</...

Nosso grupo está focando no desenvolvimento de abordagens regenerativas para tratar a degeneração neuroretinal, ou seja, AMD, por terapia genética não viral baseada em RPE e IPE. O estabelecimento pré-clínico de tais terapias requer modelos in vitro transferíveis aos seres humanos. Assim, o objetivo do estudo aqui apresentado é entregar protocolos para o isolamento, cultura e engenharia genética das células RPE e IPE primárias. A lógica para estabelecer o isolamento das células de Pe de múltiplas espécies é confirmar robustamente a segurança e a eficiência da abordagem e aumentar sua reprodutibilidade e transferênciabilidade. A linha celular humana arpe-19 disponível difere das células primárias (por exemplo, elas são menos pigmentadas) e, portanto, é apenas de valor limitado para análises pré-clínicas1. Além disso, as células não-humanas dos mamíferos podem ser adquiridas por menor custo e em maiores quantidades; o tecido doador humano pode ser obtido de vários Bancos de Olhos, mas a disponibilidade é limitada e cara. Finalmente, novos Medicamentos de Terapia Avançada (ATMP, ou seja, células, tecidos ou Medicamentos de Terapia Genética) precisam ser aplicados em pelo menos duas espécies diferentes antes de serem testados em pacientes e esses estudos in vivo solicitam a preparação de transplantes de células alergênicas.
As doenças neurodegenerativas da retina são a principal causa de cegueira em países industrializados, compreendendo doenças comuns como a DAM, bem como doenças raras como a retinite pigmentosa, na qual a morte das células da retina eventualmente leva à cegueira. As células RPE, fotorreceptor e células gânglios da retina (RGC) podem, em alguns casos, ser, mas atualmente não há terapias curativas disponíveis. Os ATMPs oferecem o potencial de corrigir defeitos genéticos, integrar genes terapêuticos ou substituir células degeneradas, possibilitando assim o desenvolvimento de terapias regenerativas e curativas para doenças como a AMD; 13 terapias genéticas já receberam aprovação de marketing, incluindo uma terapia para tratar a degeneração da retina associada à mutação RPE652,3. Entre os idosos (>60 anos), ~30 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas por nevasculares (nvAMD) ou amd4(aAMD) avascular (aAMD). Ambas as formas são induzidas por gatilhos associados à idade, incluindo dano oxidativo, comprometimento da função e perda de células RPE seguidas de degradação fotorreceptora, entre outras (por exemplo, alelos de risco genético, tabagismo, hipertensão)5,6. No nvAMD, a patogênese é agravada por um desequilíbrio de fatores angiogênicos e anti-angiogênicos em favor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular Angiogênico (VEGF) que induz a neovascularização choroidal (CNV). Até o momento, apenas o nvAMD é tratável por injeções intravitreales mensais de inibidores da proteína VEGF para suprimir o CNV; ainda não há tratamento eficaz disponível para aAMD6,7.
Vários estudos avaliaram terapias baseadas em células para substituir a terapia anti-VEGF: estudos feitos por Binder et al., em que células de RPE recém-colhidas foram transplantadas em pacientes com nAMD8,9,10, mostraram melhora visual moderada, mas apenas um pequeno grupo de pacientes atingiu uma acuidade visual final alta o suficiente para permitir a leitura. Recentemente, um estudo clínico de fase I utilizou um patch RPE derivado de células-tronco embrionárias para tratar a AMD com resultados promissores; ou seja, eficácia, estabilidade e segurança do patch RPE por até 12 meses em 2 dos 10 pacientes tratados11. Além disso, vários grupos publicaram estudos nos quais as manchas de membrana-coroide autólogas de RPE-Bruch foram colhidas da retina periférica e transplantadas para a mácula12,13,14; e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) foram geradas para transplante15. Para a AAMD, anticorpos voltados para a via complementar foram testados em ensaios clínicos6,16 e um estudo de fase I utilizando uma única injeção intravitareal de um vetor viral associado ao Adeno (AAV) codificando o gene para o fator CD59 (AAVCAGsCD59) em pacientes com atrofia geográfica (GA) foi concluída17; o estudo da fase II começou recentemente e tem como objetivo recrutar 132 pacientes com aAMD avançado e avaliar o resultado aos 2 anos após a intervenção18. Finalmente, o grupo de estudo FocuS iniciou um ensaio clínico multicêntrico de fase I/II avaliando a segurança, a resposta de dose e a eficácia de um vetor AAV não replicante recombinante codificando um fator de complemento humano19.
Principalmente, o objetivo de uma terapia regenerativa de AMD é o transplante de células RPE funcionais, que foram danificadas ou perdidas. No entanto, as células IPE e RPE compartilham muitas semelhanças funcionais e genéticas (por exemplo, fagocitose e metabolismo retinol), e como as células IPE são mais viáveis colhidas, elas foram propostas como substitutas de RPE20. Embora tenha sido demonstrado anteriormente que o transplante de células IPE atrasa a degeneração fotorreceptora nos modelosanimais 21,22 e estabiliza a função visual em pacientes com nvAMD em estágio terminal, não foi observada melhora significativa nesses pacientes23. A falta de eficácia pode ser devido ao baixo número de células transplantadas e/ou ao desequilíbrio de fatores neuroprotetores da retina. Uma abordagem alternativa seria transplantar células epiteliais de pigmento transfectados que superexpressem fatores neuroprotetores para restaurar a homeostase da retina, manter células RPE remanescentes e proteger fotorreceptores e RGCs da degeneração. Consequentemente, propomos uma nova terapia que inclua o transplante de células funcionais de RPE ou IPE que passaram por engenharia genética para segregar proteínas neuroprotetoras e anti-angiogênicas, como PEDF, GM-CSF ou fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs). A vantagem de desenvolver e analisar essa abordagem em várias espécies em vez de usar uma linha celular, apenas uma espécie ou tecido humano é: 1) maior reprodutibilidade e transferência dos resultados, como mostram inúmeros estudos realizados em laboratórios independentes e diferentes espécies1,24,25; 2) as células suínas ou bovinas são factíveis descartáveis sem o sacrifício de animais adicionais; 3) a disponibilidade de células especialmente suínas e bovinas permite que grandes séries de testes produzam resultados robustos; 4) o conhecimento para isolar, cultura e modificar geneticamente células dos modelos mais utilizados permite análises in vivo em múltiplas espécies24,25,26 e, portanto, oferece uma melhor relação risco-benefício para os primeiros pacientes tratados; 5) a flexibilidade do protocolo apresentado permite seu uso em diversos modelos e configurações experimentais e para todas as terapias baseadas em células oculares com e sem engenharia genética. Em contraste, técnicas alternativas como linhas celulares ou tecido humano são apenas de transferência limitada e/ou capacidade de descarte limitada. Linhas celulares como o ARPE-19 são ideais para experimentos preliminares; no entanto, a baixa pigmentação e a alta proliferação diferem significativamente das células primárias1. As células RPE e IPE, isoladas do tecido doador humano, oferecem uma fonte preciosa para experimentos in vitro transferíveis; no entanto, obtemos tecido humano de um Banco de Olhos AMERICANO-Americano, o que significa que o tecido tem pelo menos dois dias de idade (após a enucleação) e requer um transporte longo e caro, mas o tecido doador local não está disponível em quantidades suficientes para uma pesquisa produtiva. A vantagem do uso de células primárias é confirmada por múltiplos estudos de outros grupos27,28.
Para o desenvolvimento de uma terapia genética não viral baseada em células usando o sistema transposon SB100X para transfecção de células primárias de RPE e IPE com os genes codificados para PEDF e/ou GM-CSF para tratar nvAMD e aAMD,respectivamente 29,30,31,32, estabelecemos pela primeira vez a transfesionamento de células ARPE-191 . Em seguida, os protocolos de isolamento e transfecção foram estabelecidos em células primárias bovinas e suínas facilmente acessíveis. Agora, foi estabelecido o isolamento e transfecção de células primárias de RPE e IPE de cinco espécies diferentes, desde pequenos (como camundongos) até grandes mamíferos (como gado). Foi confirmado em células primárias de RPE e IPE derivadas de olhos de doadores humanos30. A produção compatível com boas práticas de fabricação (GMP) do ATMP foi validada utilizando tecido doador humano, bem como33. Finalmente, tanto a segurança quanto a eficiência da abordagem foram avaliadas in vivo em três espécies diferentes para as quais o protocolo foi adaptado: rato, rato e coelho. Na configuração clínica, uma biópsia de íris será colhida do paciente e as células do IPE serão isoladas e transfectadas na sala limpa, antes que as células sejam transplantadas subretinarmente de volta para o mesmo paciente. Todo o processo ocorrerá durante uma única sessão cirúrgica que dura aproximadamente 60 minutos. O desenvolvimento da abordagem terapêutica e a avaliação de sua eficiência solicitaram excelentes modelos in vitro e ex vivo para implementar métodos robustos e eficientes de entrega de genes, analisar a eficiência da entrega de genes, produção de proteínas terapêuticas e efeitos neuroprotetores, e produzir transplantes celulares para testar a abordagem in vivo1,24,25,29,30 . Vale ressaltar que a terapia tem a aprovação ética para um ensaio de fase clínica Ib/IIa da comissão ética para pesquisa do Cantão de Genebra (nº 2019-00250) e atualmente os últimos dados pré-clínicos solicitados para autorização pelas autoridades reguladoras suíças são coletados usando o protocolo apresentado. Nesse sentido, os dados pré-clínicos do In Vivo demonstraram uma redução significativa na CNV e excelente segurança24,25,31.
Aqui, descreve-se o isolamento e a cultura das células RPE/IPE de bovinos, suínos, coelhos, ratos e camundongos, e o uso do sistema transposon integrativo SB100X combinado com a eletroporação como um método eficiente de entrega de genes. Particularmente, as células pe primárias foram transfectadas para superexpressar PEDF e GM-CSF. A coleta desses protocolos permite que os estudos in vitro e in vivo sejam realizados em todas as fases pré-clínicas do desenvolvimento do ATMP. Além disso, a configuração tem potencial para ser adaptada a outros genes de interesse e doenças.

<table><tbody><tr><td>Placas de 12 poços Placas de 12 poços</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Placas</td><td>de</td> 48 poços Corning 353047 <td></td></tr><tr>Placas <td></td><td>de 48 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td> 150687 <td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bonn micro fórceps plana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça Colibri (estéril)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Drape (estéril)</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>800530</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de eletroporação 3P.14</td><td>3P Farmacêutico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps (tamanho diferente) (estéril)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressa de gaze</td><td>PROMEDICAL AG</td><td>25403</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (0,9%)</td><td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td><td>1000090</td><td></td></tr><tr><td>Agulha (18G)&nbsp;</td><td>Kit de</td> transfecção de néon <td>Terumo TER-NN1838R</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transfecção de Néon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>Câmara Neubauer</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur (polidor de fogo)</td> <td>Witeg</td><td>4100150</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Tiopental Inresa)</td><td>Ospedalia AG</td><td>31408025</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-PEDF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-SB100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-Venus</td><td></td><td></td><td>Pastor et al., 2018. Gentilmente cedido pelo Prof. Scherman e Prof. Marie</td></tr><tr><td>pSB100X (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td> <td>M &aacute; t&eacute; s et al., 2009. Fornecido pelo Prof. Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CAGGS-Venus</td><td></td><td></td><td>Johnen et al., 2012</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His DNA plasmidial (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td> <td>Clonado em nosso laboratório</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-His DNA plasmidial (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td><td>Pastor et al., 2018</td></tr><tr><td>scarpel nº 10</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>scarpel nº 11</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>Ponta afiada curvada Tesoura Bonn Extra Fina (estéril)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponta afiada reta Tesoura Bonn Extra Fina (estéril)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tali Citômetro Baseado em Imagem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0.25%&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25050014</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 5% / EDTA 2%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas curvada (estéril)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, cultura e engenharia genética de células epiteliais de pigmento primário mamífero para terapia genética não viral

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

A degeneração macular relacionada à idade (DAM) é a causa mais frequente de cegueira em pacientes > 60 anos, afetando ~30 milhões de pessoas em todo o mundo. A APA é uma doença multifatorial influenciada por fatores ambientais e genéticos, que levam ao comprometimento funcional da retina devido à degeneração celular epitelial do pigmento da retina (RPE), seguida pela degradação do fotorreceptor. Um tratamento ideal incluiria o transplante de células de RPE saudáveis que secretam fatores neuroprotetores para prevenir a morte celular de RPE e a degeneração do fotorreceptor. Devido às semelhanças funcionais e genéticas e à possibilidade de uma biópsia menos invasiva, o transplante de células epiteliais de pigmento de íris (IPE) foi proposto como um substituto para o RPE degenerado. A secreção de fatores neuroprotetores por um baixo número de células subretinamente transplantadas pode ser alcançada pela transfecção mediada pela Transposon -mígio com genes codificados para o fator derivado do epitélio pigmento (PEDF) e/ou pelo fator estimulante da colônia de macrófago granulocyte (GM-CSF). Estabelecemos o isolamento, a cultura e a transfecção mediada por SB100Xde células RPE e IPE de várias espécies, incluindo roedores, suínos e bovinos. Globos são explantados e a córnea e as lentes são removidas para acessar a íris e a retina. Usando uma espátula personalizada, as células IPE são removidas da íris isolada. Para colher células RPE, pode ser necessária uma incubação de trippsina, dependendo da espécie. Em seguida, usando espátula personalizada rpe, as células são suspensas em média. Após a semeadura, as células são monitoradas duas vezes por semana e, após atingirem a confluência, transfectadas pela eletroporação. Integração genética, expressão, secreção de proteínas e função foram confirmadas por qPCR, WB, ELISA, imunofluorescência e ensaios funcionais. Dependendo da espécie, 30.000-5 milhões (RPE) e 10.000-1,5 milhões (IPE) podem ser isoladas por olho. Células geneticamente modificadas apresentam uma superexpressão significativa de PEDF/GM-CSF com a capacidade de reduzir o estresse oxidativo e oferece um sistema flexível para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos para desenvolver abordagens de terapia genética ocular.

Isolamento de PE de diferentes espécies de mamíferos Utilizando os protocolos acima mencionados, as células IPE e RPE foram isoladas com sucesso e cultivadas a partir de cinco espécies diferentes. O número de células obtidas a partir de cada procedimento depende da espécie e tamanho do olho (Tabela 1). Como mostrado na Figura 1,as células mostram morfologia e pigmentação típica das células pe (exceto para as células de coelho mostradas, derivadas de coelh...

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e transfetar células epiteliais de íris primária e pigmento da retina de vários mamíferos (ratos, ratos, coelhos, suínos e bovinos). O método é ideal para estudar abordagens de terapia genética ocular em várias configurações para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

O protocolo é significativo, pois mostra o isolamento e transfecção de células epiteliais pigmentares de cinco mamíferos como um sistema ideal para estudar a terapia genética ocular em várias configurações. A principal vantagem deste método é sua flexibilidade, transferência, alto rendimento celular, viabilidade e taxa de transfecção devido às cinco espécies e ao sistema transposon SB100X não viral utilizado. Essas técnicas foram desenvolvidas para estudar abordagens de terapia genética direcionadas às células epiteliais de pigmento da retina e íris, isoladas e transfetificadas no protocolo atual, mas são utilizáveis para qualquer pesquisa ocular.Demonstrando o procedimento estará Gregg Sealy, um técnico do laboratório. Depois de eutanásia do animal, use tesouras curvas e fórceps colibri para enuclear os olhos e, em seguida, limpar o tecido muscular restante e a pele dos olhos. Colete os olhos em um tubo de 50 mililitros cheio de PBS não estérei e transfira o tubo para a coifa de fluxo laminar.Desinfetá-los submergindo em solução à base de iodo por dois minutos, em seguida, transfira os olhos para um tubo de 50 mililitros cheio de PBS estéril. Coloque um olho em uma compressa de gaze estéril e segure firmemente o olho perto do nervo óptico. Em seguida, corte perto do limite da íris com um bisturi número 11.Usando uma tesoura, corte ao redor da íris e remova o segmento anterior e coloque-o em uma placa de Petri, deixando a lâmpada com o vítreo até que o pigmento da retina epitelial, ou células RPE, sejam isolados. Para isolar o pigmento de íris, ou células IPE, remova a lente com fórceps finos e retire delicadamente a íris que contém as células IPE. Coloque a íris em uma placa de Petri e lave-a com PBS estéril.Adicione 500 microliters de 0,25% de trippsina e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Retire a trippsina, adicione 500 microliters de meio completo e raspe o IPE delicadamente com uma pipeta Pasteur plana e polida em fogo. Pegue a suspensão do celular e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro.Conte as células usando a câmara de Neubauer, e sementes 0,2 milhões de células por poço em uma placa de 24 poços com um mililitro de meio completo. Coloque a placa em uma incubadora e culta-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para isolar as células RPE, remova o humor vítreo e a retina do segmento posterior com fórceps finos.Coloque as lâmpadas na placa de 24 poços e adicione 500 microliters de 0,25% trypsin por olho e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Remova a trippsina, adicione 500 microliters de meio por globo completos e raspe as células RPE delicadamente com uma pipeta Pasteur curva, polida pelo fogo. Pegue a suspensão do celular e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro.Conte as células usando a câmara de Neubauer e semee as células como descrito anteriormente. Coloque a placa na incubadora. Limpe o tecido muscular e a pele restantes dos olhos e desinfete os olhos em solução à base de iodo e enxágue-os com PBS.Para isolar as células IPE, remova a lente e puxe a íris como descrito anteriormente. Depois de preparar duas íris, adicione um mililitro de meio completo e isole as células coçando com uma pipeta Pasteur plana e polida em fogo, em seguida, conte e semee as células. Coloque a placa na incubadora.Para isolar as células RPE, remova o vítreo e a retina do segmento posterior e coloque a lâmpada em uma placa de Petri. Encha a lâmpada com um mililitro completo. Usando uma pipeta Pasteur curva, polida em fogo, remova as células RPE.Colete a suspensão celular dentro da lâmpada usando uma pipeta de 1.000 microliter e transfira-a para um tubo de 1,5 mililitro para resuspensão. Em seguida, conte e semee as células e incubar a placa como demonstrado anteriormente. Após a limpeza, abra o olho e corte ao redor da íris para remover o segmento anterior, em seguida, coloque em uma placa de Petri.Deixe a lâmpada com o vítreo até que as células RPE estejam isoladas. Para isolar as células IPE, se a lente vier com o segmento anterior, remova a lente e use fórceps finos para retirar delicadamente a íris que contém as células IPE. Coloque a íris em uma placa de Petri e lave-a com PBS estéril.Corte o corpo ciliar com um bisturi número 10. Depois de preparar as íris, incuba-as com dois mililitros de 0,25% de trippsina a 37 graus Celsius por 10 minutos. Remova a trippsina e adicione dois mililitros de meio completo, em seguida, isole as células coçando com uma pipeta Pasteur plana e polida.Transfira a suspensão celular para um tubo de dois mililitros e centrifugar as células por 10 minutos a 120 vezes G.Descarte o sobrenante e resuspenque as células em dois mililitros de meio completo. Semente 0,32 milhões de células por poço em uma placa de seis poços em três mililitros de meio completo. Coloque a placa em uma incubadora e culta-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Para isolar as células RPE, remova o humor vítreo e a retina do segmento posterior com fórceps. Evite danificar o pigmento da retina epitélio. Lave a lâmpada com PBS.Depois de preparar ambos os olhos, encha a lâmpada cerca de três quartos cheio com trippsina, e incubar por 25 minutos a 37 graus Celsius com a tampa da placa de Petri em cima do olho da lâmpada. Remova a trippsina e adicione um mililitro de meio completo. Usando uma pipeta Pasteur curva, polida em fogo, remova as células RPE.Colete a suspensão celular dentro da lâmpada e transfira-a para um tubo de 1,5 mililitro para a ressuspensão. Centrifugar as células por 10 minutos a 120 vezes G.Seed 0,32 milhões de células por poço em uma placa de seis poços em três mililitros de meio completo. Coloque a placa em uma incubadora e culta-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Cultume as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono em uma incubadora umidificada. Depois de três a quatro dias, pipeta para cima e para baixo para coletar células não aadeentes e colocar metade do volume em outro poço. Encha o poço a um mililitro com meio completo.Depois de mais três a quatro dias, repita a coleção celular, desta vez agrupando as células não aadeentes de dois poços em um. Adicione meio a todos os poços. Observe as células e troque o meio duas vezes por semana.Quando as células atingirem a confluência, mude para meio completo com 1%FBS. Utilizando os protocolos acima mencionados, as células IPE e RPE foram isoladas com sucesso e cultivadas a partir de cinco espécies diferentes. O padrão de expressão RPE foi confirmado em células de IPE bovina primária por imunofluorescência para RPE65.A viabilidade celular foi estudada para excluir uma toxicidade potencial do tampão de eletroporação usando um kit de ensaio de citotoxicidade comercialmente disponível e um controle eletroporado de nós. Não foi observado impacto na viabilidade celular. Células epiteliais de pigmento pré-cultivadas de diferentes espécies foram transfeinadas com a proteína amarela fluorescente de Vênus.As células RPE19 transfectadas foram utilizadas como controle positivo. A quantificação da eficiência de transfecção em RPE de suínos pré-esculpidos é mostrada aqui. Células epiteliais de pigmento de coelho recém-isoladas foram transfeinadas com a proteína fluorescente amarela Vênus e foram monitoradas por microscopia.As células epiteliais pigmentadas foram transfeinadas com fator derivado do epitélio pigmento e a secreção proteica foi monitorada pela mancha ocidental. O sinal para células transfeinadas foi maior em comparação com células não transfectadas para todas as espécies e dias estudados, e não foi observada diminuição na secreção proteica dentro deste período. É crucial evitar raspar as células com ferramentas afiadas.Aqui, pipetas Pasteur polidas com fogo são usadas, exceto em pequenos olhos de rato, onde um bisturi redondo deve ser usado. Células epiteliais pigmentares podem ser usadas para desenvolver abordagens de terapia genética e simular condições patológicas, por exemplo, danos ao estresse oxidativo. Esses modelos também podem ser usados para testar drogas terapêuticas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, mostramos um procedimento para obter células epiteliais pigmentares oculares de um modelo de coelho. As células são úteis no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças degenerativas da retina.

Isolando células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentares oculares do olho de coelho

Neste vídeo, descrevemos uma técnica para isolar células epiteliais pigmentares da íris e da retina de olhos suínos para obter suas culturas primárias para estudos in vivo e ex vivo. Essas células pigmentares podem ser geneticamente modificadas para estudar abordagens regenerativas para tratar distúrbios oculares.

Isolamento de células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentadas de olho suíno isolado

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar as células epiteliais pigmentares da retina, ou EPR, e as células epiteliais pigmentares da íris, ou EIP, de olhos bovinos colhidos. As células isoladas podem ser cultivadas para estudar seu papel no tratamento de doenças oculares.

Isolando células RPE e IPE do olho bovino: um procedimento para colher e cultivar células epiteliais de pigmento primário bovino

Culturas de células da retina pintinho embrionárias constituem ferramentas importantes para o estudo da biologia de fotorreceptores. Nós desenvolvemos uma técnica de transferência de gene eficiente com base em ex ovo plasmídeo electroporação das retinas antes da cultura. Esta técnica aumenta consideravelmente a eficiência de transfecção através de protocolos disponíveis atualmente, fazendo a manipulação genética viável para este sistema.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An Ex-ovo Eletroporação Approach

Desenvolvemos um protocolo para transfectar células epiteliais primárias de pigmento humano por eletroporação com o gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) usando o sistema de transposon da Bela Adormecida (SB). A transfecção bem-sucedida foi demonstrada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), immunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA).

Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

Aqui, um método fácil de seguir para a cultura de células epiteliais primárias do pigmento da retina suína in vitro é apresentado.

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

Descrevemos um método simples e eficiente para isolar células do epitélio pigmentado da retina (EPR) de olhos de cobaias pigmentadas jovens. Este procedimento permite o acompanhamento de estudos de biologia molecular do EPR isolado, incluindo análises de expressão gênica.

Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia

Este protocolo descreve o procedimento para obtenção e cultivo de células epiteliais pigmentares primárias da retina (EPR) a partir de olhos suínos de origem local. Essas células servem como uma alternativa de alta qualidade às células-tronco e são adequadas para pesquisas in vitro da retina.

Isolamento de células epiteliais pigmentares primárias da retina suína para modelagem in vitro

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Aprenda a isolar e transfectar células epiteliais de pigmento de cinco mamíferos para terapia gênica ocular não viral usando o sistema SB100X. Este método oferece alta viabilidade celular e flexibilidade para pesquisas translacionais.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

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