Fluorímetro em miniatura de código aberto para monitorar reações de amplificação de ácido nucleico isotérmico em tempo real em configurações limitadas de recursos

Este método permite que indivíduos sem experiência eletrônica construam instrumentos como este fluorímetro para amplificação e detecção de ácido nucleico isotémico, o que é fundamental para diagnósticos moleculares. A principal vantagem dessa técnica é que o sistema pode ser completamente montado a partir de materiais disponíveis comercialmente e software de código aberto a um baixo custo. Este fluorímetro pode ser usado com múltiplos métodos de amplificação isoteérmica.

Isso é importante porque os métodos de amplificação isoteérmica são cada vez mais utilizados para detectar uma ampla gama de doenças infecciosas e hereditárias. Para montar a carcaça óptica, coloque uma inserção roscada de 4-40 de comprimento de 3/16 polegadas no orifício em cima da peça STL inferior do gabinete óptico e coloque uma inserção roscada de 1/4 polegada de comprimento de 4-40 de comprimento em todos os outros orifícios da peça. Insira a placa de teste central, na cavidade superior da carcaça com os cinco pinos voltados para a parte superior e mais perto do eixo central do dispositivo e fixe a placa de teste com um parafuso de 4-40 de 3/16 polegadas de comprimento.

Coloque uma das lentes de distância focal de 20 milímetros na seção abaixo da placa de teste central com o lado convexo voltado para a parte inferior do dispositivo e longe da placa de teste. Para criar a primeira configuração, coloque o filtro de passagem longa na próxima seção abaixo da lente de distância focal de 20 milímetros. Para criar a segunda configuração, coloque duas folhas amarelas do filtro de emissão na seção abaixo da lente.

Para criar a primeira configuração, coloque o espelho dicroico na seção diagonal próxima ao centro do encadeamento enquanto observa a orientação do filtro especificada pelo fabricante. Para criar a segunda configuração, coloque o divisor de feixe na seção diagonal. Coloque uma segunda lente focal de 20 milímetros na seção abaixo do espelhodicrómico ou divisor de feixe, dependendo da configuração, com o lado convexo apontando para a parte superior do dispositivo.

Para criar a primeira configuração, coloque o filtro de excitação na seção à direita do espelhodicróico, certificando-se de que a seta aponta para o espelho dicroico. Para criar a segunda configuração, coloque uma folha azul do filtro de excitação na seção à direita do divisor de feixes. Coloque a lente de distância focal de 15 milímetros à direita do filtro de excitação com o lado convexo voltado para o espelhodicróico.

E coloque um LED na seção restante da impressão com o LED voltado para o espelhodicróico ou divisor de feixe, dependendo da configuração. Certifique-se de que os dois fios que levam do LED estão inseridos nos canais de recesso para que a impressão feche firmemente. E repita a configuração para o outro lado da peça de impressão 3D.

Em seguida, coloque as porções extrudadas da metade superior do encosto nas ranhuras rebaixadas da metade inferior do encosto para fechar o lado vazio da peça com os componentes ópticos. E segure as peças junto com parafusos de 4-40 de 3/8 polegadas de comprimento. Para montar a eletrônica e a tela sensível ao toque, conecte as duas mini tábuas de pão e coloque o microcontrolador em uma das tábuas de pão, garantindo que a porta micro-USB do microcontrolador se despreesse para fora.

Para conectar a modulação led, conecte o pino CTL do LED+driver a um pino digital do microcontrolador. E o pino de LED do driver LED para um pino GND do microcontrolador. Remova as tampas plásticas na parte de trás das tábuas de pão e pressione o apoio adesivo das tábuas de pão à peça impressa em 3D para anexar as tábuas combinadas ao interior da parte traseira da peça impressa STL do suporte de tela LCD.

Fixar o suporte de tela LCD com as tábuas montadas dentro do gabinete óptico com parafusos de 4 a 40 de comprimento de 1 polegada. Para conectar a fonte de alimentação LED, conecte o pino LED positivo do driver LED ao fio positivo do primeiro LED. E conecte o fio negativo do primeiro LED ao fio positivo do segundo LED na prancha.

Conecte o fio negativo do segundo LED ao pino LED do driver LED. Para conectar a fonte de alimentação LED, use uma tomada de barril ao adaptador de 2 pinos para conectar os fios positivos e negativos da fonte de alimentação de 10 volts aos pinos VIN+e VIN do driver LED, respectivamente. Para conectar a fonte de alimentação da placa de teste do sensor e a transferência de dados, use um fio de jumper feminino de 4 pinos para o macho para conectar os pinos SCK, SDA, VDUT e GND nas placas de teste do sensor leve a digital para a mini placa de pão através da abertura no canto superior direito da impressão do suporte LCD.

Na tábua de pão, confirme que o pino de 3,3 volts do microcontrolador e o pino VDUT de ambas as placas de teste, o pino GND do microcontrolador e o pino GND de ambas as placas de teste, o análogo de 4 pinos do microcontrolador e o pino SDA de ambas as placas de teste, e o análogo de 5 pinos do microcontrolador , e o pino SCK de ambas as placas de teste estão todos conectados. Use quatro parafusos M2.5 para fixar o computador de placa única no suporte da tela LCD, com as portas HDMI e adaptador de alimentação do computador de placa única voltado para cima e o computador de placa única centrado na parte impressa em 3D. Em seguida, conecte o visor da tela de toque ao computador de uma única placa de acordo com as instruções da tela de toque.

E conecte a porta HDMI do computador de placa única à porta HDMI da tela sensível ao toque. Para registrar os dados de fluorescência em tempo real, depois que o bloco de calor foi ligado e atingiu a temperatura apropriada, a energia no computador de uma única placa e use um cabo micro-USB para USB para conectar o computador de placa única ao microcontrolador. Abra o script Python fornecido na tela de toque e altere o tempo de medição.

Altere o caminho do arquivo de saída variável para o nome do arquivo de dados que o programa gera. E alterar as variáveis da porta serial para os valores desejados. Coloque dois tubos PCR contendo as reações a serem monitoradas no bloco de calor.

E coloque o fluorímetro no bloco de calor com os tubos PCR centrados entre os quatro pinos extrudando de cada canal óptico. Depois de confirmar que o fluorímetro impresso em 3D está conectado, conecte o adaptador de alimentação para os LEDs e inicie o programa Python. Uma interface gráfica do usuário aparecerá na tela LCD para medir a fluorescência em tempo real em ambos os tubos PCR.

No final do experimento, visualize as medições e os arquivos de dados de saída salvos no local definido pelo usuário. Uma vez montado, o desempenho do fluorímetro pode ser validado medindo a fluorescência de uma série de diluição de corante FITC. Nesta análise representativa, ambos os canais do fluorímetro mostraram uma resposta linear em toda a faixa desejada.

Aqui estão mostradas a fluorescência subtraída da linha de base da amplificação de polimerase recombinase positiva e as reações de controle negativo de um kit comercial padrão medido na segunda configuração do fluorímetro. As medidas de fluorescência em tempo real de uma reação de amplificação isotéria mediada por loop de transcrição reversa personalizada para o RNA SARS-COVID-2 na primeira configuração do fluorímetro mostram que a amplificação ocorre como esperado em uma faixa clinicamente relevante de números de cópias de RNA. Em um momento em que as cadeias globais de suprimentos estão muito estressadas, equipamentos de código aberto como este fluorímetro podem nos ajudar a reduzir algumas das iniquidades de saúde que estão associadas à pandemia.