Name: Doxycycline carregado de colágeno-chitosan andaime composto para a cura acelerada de feridas diabéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a preparar andaimes de colágeno-quitosana com doxiciclina para acelerar a cicatrização de feridas diabéticas em ratos Wistar. Este método combina liberação sustentada do fármaco, biocompatibilidade e ação antibacteriana.

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Os autores agradecem ao Dr. Ashish D Wadhwani. (Professor Assistente e Chefe do Departamento de Biotecnologia Farmacêutica, JSS College of Pharmacy, Ooty, Índia) por auxiliar em estudos de viabilidade celular in vitro.
Os autores gostariam de agradecer ao Departamento de Ciência e Tecnologia - Fundo de Melhoria da Infraestrutura de Ciência e Tecnologia em Universidades e Instituições de Ensino Superior (DST-FIST), Nova Deli, por apoiar nosso departamento.
Os autores também gostam de agradecer ao Sr. Sanju. S e Sr. Sriram. Narukulla M. Pharm estudantes por seu apoio na filmagem.
Esta pesquisa foi apoiada pela JSS Academy of Higher Education & Research (JSSAHER).

Todos os procedimentos animais realizados foram aprovados pelo comitê institucional de ética animal da JSS College of Pharmacy, Ooty, Índia.
1. Preparação de andaimes porosos carregados do DOX pelo método de secagem congelante
<ol><li>Adicione 1,2 g de COL a 100 mL de água (por exemplo, Millipore) e mantenha-se de lado para o inchaço.</li>
	<li>Mexa a dispersão do COL inchado a 2000 rpm durante a noite para garantir a dissolução completa do COL.</li>
	<li>Prepare a solução CS dissolvendo aproximadamente 0,8 g de CS em 100 mL de ácido acético de 1%.</li>
	<li>Mexa a solução CS durante a noite a 2000 rpm para garantir a dispersão uniforme.</li>
	<li>Mix DOX (1% c/v), seguido da solução CS, para a solução COL, e mexa por 30 min.</li>
	<li>Filtre a mistura física obtida usando um pano de musselina para remover a matéria particulada.</li>
	<li>Congele profundamente o filtrado obtido a -85 °C ± 4 °C por cerca de 24 h.</li>
	<li>Lyophilize a mistura de congelamento profundo a -85 °C ± 4 °C por 72 h.</li>
	<li>Armazene os andaimes obtidos em um desiccator para análise posterior 16,17.</li>
</ol>2. Crosslinking de andaime
<ol><li>Dissolver MES (0,488 g) em 50 mL de água.</li>
	<li>Mergulhe 50 mg do andaime carregado DOX em 20 mL do buffer MES por 30 min.</li>
	<li>Misture 19,5 mL de buffer MES com 0,1264 g de EDC e 0,014 g de NHS em um béquer separado.</li>
	<li>Mergulhe o andaime na mistura de tampão por 4h para alcançar o crosslinking 16.</li>
	<li>Armazene o DOX carregado de andaimes cruzados (CL) e andaimes não-cruzados (NCL) para avaliação posterior.</li>
</ol>3. Caracterização de andaimes
<ol><li>Exame morfológico usando uma microscopia eletrônica de varredura (SEM)<ol>
<li>Caracterize os andaimes para análise morfológica utilizando SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).</li>
		<li>Colora a superfície transversal e externa do andaime com a delicada camada de ouro (~150 Å).</li>
		<li>Capture a imagem fotográfica na tensão de excitação de 5 kV e 10 kV.</li>
		<li>Coloque as amostras em alumínio e coloque-as com o ouro a aproximadamente 9 V.</li>
		<li>Meça o andaime utilizando SEM com a resolução aumentada em 10 kV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinação porosidade<ol>
<li>Meça a porosidade dos andaimes utilizando o método de deslocamento líquido (etanol) 18.</li>
		<li>Calcule a porosidade dos andaimes usando as fórmulas abaixo. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62184/62184eq01.jpg"> Ww = Peso molhado do andaime Wd = Peso seco do andaime Wv = Volume do andaime</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinando a capacidade de absorção da água<ol>
<li>Meça o peso seco do andaime.</li>
		<li>Incubar o andaime pesado a 37 °C por 24 h em salina tampão fosfato (PBS) pH 7.4.</li>
		<li>Remova o excesso de PBS sobre o andaime usando papel filtro.</li>
		<li>Meça a capacidade de absorção de água utilizando a fórmula abaixo 17. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62184/62184eq02.jpg"> WS = Porcentagem de absorção de água W1=Peso molhado do andaime W0= Peso seco do andaime</li>
	</ol>
</li>
	<li>Degradação do andaime<ol>
<li>Incubar o andaime (1cm x 1cm) a 37 °C durante 7 dias em um PBS de pH 7.4 contendo lysozymes.</li>
		<li>Lave o andaime para remover quaisquer íons aderidos na superfície.</li>
		<li>Congele o andaime lavado 17.</li>
		<li>Calcule a taxa de degradação usando fórmulas. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62184/62184eq03.jpg"> Ww = Peso inicial do andaime Wd = Peso do andaime após a secagem congelante</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estudos de liberação in vitro<ol>
<li>Determine o comportamento de liberação do DOX do andaime usando o método de saco de diálise.</li>
		<li>Disperse o andaime em alguns mililitros de fluido de ferida simulado (pH 7.4) e transfira-o para um saco de diálise.</li>
		<li>Feche bem as extremidades do saco de membrana e mergulhe nos 500 mL de solução simulada de fluido de ferida.</li>
		<li>Mexa a solução de fluido de ferida contendo o saco de diálise a 200-250 rpm.</li>
		<li>Colete a solução sobrenante e substitua-a por uma quantidade igual de solução tampão fresca em intervalos de tempo definidos.</li>
		<li>Determine a porcentagem de liberação DOX dos andaimes da solução sobrenante usando um espectrômetro visível UV a 240 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Estudos antibacterianos in vitro
<ol><li>Determine a concentração inibitória mínima (MIC) dos andaimes CL e DOX-CL contra o S. aureus, S. epiderme, E. coli, P. aeruginosa usando o método de diluição do micro-caldo.</li>
	<li>Prepare as culturas bacterianas usando caldo Mueller-Hinton a uma proporção de 1:1000 para obter 0,5 turbidez McFarland.</li>
	<li>Adicione d-glicose (800 mg/dL) às culturas bacterianas para hiperglicação 19,20.</li>
	<li>Mince e solubilize o CL e DOX-CL em DMSO (controle negativo).</li>
	<li>Diluir em série a suspensão bacteriana hiperglicada (100 μL) e testar amostras (100 μL de solução de andaimes) em placa de 96 poços.</li>
	<li>Incubar a placa a 37 °C para 20-24 h.</li>
	<li>Regisso recorde a absorvância em um comprimento de onda de 600 nm 21.</li>
</ol>5. Estudos de biocompatibilidade in vitro
<ol><li>Avalie a biocompatibilidade dos andaimes preparados usando MTT [(3-(4, 5 dimetil thiazole-2 yl) -2, 5-difenil tetrazolium brometo)] ensaio.</li>
	<li>Esterilize os andaimes de dimensão padrão e coloque-os em 24 placas de poço.</li>
	<li>Adicione células 3T3-L1 à placa de 24 poços e incubada por 72 h.</li>
</ol>6. Estudos em animais in vivo
<ol><li>Indução de DM e ferida de excisão<ol>
<li>Alimente o animal com uma dieta rica em gordura por duas semanas e administre uma única dose de estreptozotocina (STZ) (50 mg/kg de peso corporal) em solução tampão citrato intraperitoneal para ratos albinos Wistar (180-200 g) para a indução de diabetes tipo 2.</li>
		<li>Escolha os animais com uma glicemia constante de 250 mg/dL para o estudo.</li>
		<li>Randomize os animais selecionados para a indução de feridas de excisão.</li>
		<li>Anestesiar os ratos diabéticos usando éter dietil (5 mL foi adicionado à câmara de anestesia saturada anteriormente) e confirmar usando o método de beliscar o dedo do pé e a cor da membrana mucosa.</li>
		<li>Raspe a área dorsal (torácica dorsal, região lombar) utilizando um aparador asséptico e lâminas (A40).</li>
		<li>Esterilize a área raspada com um cotonete alcoólico.</li>
		<li>Extite a pele (2 x 2 cm2 e uma profundidade de 1 mm) com uma lâmina A40 cirúrgica asséptica na área raspada para criar uma ferida aberta.</li>
		<li>Divida os animais em três grupos (Grupo 1- Controle de Doenças (Controle), Andaime do Grupo 2- CL (Placebo), Andaime CL do Grupo 3- DOX), cada grupo composto por 6 ratos.</li>
		<li>Afixe os andaimes CL e DOX CL usando fita cirúrgica e cubra o grupo controle com gaze estéril por 21 dias.</li>
		<li>Rastreie a área da ferida em uma folha de OHP estéril e meça a redução percentual da ferida utilizando o método de rede nos dias 0, 7, 14 e 21 para todos os grupos.</li>
		<li>Calcule a redução percentual da ferida usando a fórmula abaixo. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62184/62184eq04v2.png">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Estudos histopatológicos
<ol><li>Isole a área de ferida curada nos dias 7, 14 e 21, armazene em solução de formalina (10%).</li>
	<li>Seção os tecidos usando um microtoma para obter uma espessura de 6 μm.</li>
	<li>Monte as seções em um escorregador de vidro e colora usando Hematoxilina e eosina 17.</li>
	<li>Capture as imagens sob ampliação de 40x usando um microscópio digital.</li>
</ol>8. Estimativa de hidroxiprolina
<ol><li>Isole a área da ferida curada nos dias 0, 7, 14 e 21 para avaliação.</li>
	<li>Estime o teor de hidroxiprolina utilizando o procedimento descrito por Reddy G et al., 1996 22.</li>
</ol>9. Teste de Elisa
<ol><li>Estime os níveis de MMP-9 utilizando o kit Elisa de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Isole as amostras de tecido da área da ferida curada no dia 21 e pica-se usando um homogeneizador de tecido.</li>
	<li>Centrifugar o homogeneizar obtido e coletar o supernante.</li>
	<li>Diluir o supernatante em 100 vezes usando tampão de ensaio.</li>
	<li>Escaneie a placa usando um leitor de placas múltiplas.</li>
</ol>10. Análise estatística
<ol><li>Representam os resultados obtidos como Média ± SD.</li>
	<li>Realize a análise estatística utilizando Graph pad prism v5.01.</li>
	<li>Atinja a significância estatística usando a Análise de Variância de Uma Via (ANOVA) e o teste pós-hoc de Dunnet.</li>
	<li>Considere os valores com p≤0,05 como significativos.</li>
</ol>

<ol><li>International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 9th edn. , Brussels, Belgium. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.diabetesatlas.org">https://www.diabetesatlas.org</a> (2019).</li>
<li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+its+impairment+in+the+diabetic+foot%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Wound healing and its impairment in the diabetic foot.</a> The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).</li>
<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li>
<li>Alexiadou, K., Doupis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+diabetic+foot+ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Therapy%22%5BJournal%5D)">Management of diabetic foot ulcers.</a> Diabetes Therapy. 3 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Karri, V. V. S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+emerging+therapies+in+the+management+of+diabetic+foot+ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medical+Research+and+Opinion%22%5BJournal%5D)">Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers.</a> Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).</li>
<li>Sanapalli, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta+defensins+may+be+a+multifactorial+modulator+in+the+management+of+diabetic+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound.</a> Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).</li>
<li>Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and wound healing.</a> Advances in Wound Care. 4 (4), 225-234 (2015).</li>
<li>Reiss, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9+delays+wound+healing+in+a+murine+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model.</a> Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).</li>
<li>Gill, S. E., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors%3A+regulators+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).</li>
<li>Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+doxycycline+as+a+matrix+metalloproteinase+inhibitor+for+the+treatment+of+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research+for+Nursing%22%5BJournal%5D)">The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds.</a> Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).</li>
<li>Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracyclines%3A+a+pleitropic+family+of+compounds+with+promising+therapeutic+properties.+Review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).</li>
<li>Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+purified+collagenase+from+alkali-burned+rabbit+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).</li>
<li>Kraus, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+properties+of+minocycline%3A+neuroprotection+in+an+oxidative+stress+assay+and+direct+radical-scavenging+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).</li>
<li>Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracyclines+inhibit+microglial+activation+and+are+neuroprotective+in+global+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).</li>
<li>Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+the+development+of+wound+dressings+for+diabetic+foot+ulcer+treatment-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).</li>
<li>Natarajan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+Lipid+Carriers+of+Pioglitazone+Loaded+Collagen%2FChitosan+Composite+Scaffold+for+Diabetic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing.</a> Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).</li>
<li>Karri, V. V. S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+loaded+chitosan+nanoparticles+impregnated+into+collagen-alginate+scaffolds+for+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing.</a> International Journal Of Biological Macromolecules. 93, Part B 1519-1529 (2016).</li>
<li>Hsieh, W. -C., Chang, C. -P., Lin, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+characterization+of+3D+micro-porous+structured+chitosan+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).</li>
<li>Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+of+polyphenols%3A+structure-activity+relationship+and+influence+of+hyperglycemic+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition.</a> Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).</li>
<li>Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glucose+and+pH+on+uropathogenic+and+non-uropathogenic+Escherichia+coli%3A+studies+with+urine+from+diabetic+and+non-diabetic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals.</a> Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).</li>
<li>Eloff, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quick+microplate+method+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+of+plant+extracts+for+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria.</a> Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).</li>
<li>Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+the+analysis+of+hydroxyproline+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues.</a> Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).</li>
<li>Charulatha, V., Rajaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+crosslinking+treatments+on+the+physical+properties+of+collagen+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes.</a> Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).</li>
<li>Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+collagen+and+hyaluronic+acid+composite+materials+and+their+modification+by+chemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%3A+An+Official+Journal+of+The+Society+for+Biomaterials+and+The+Japanese+Society+for+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking.</a> Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).</li>
<li>Chang, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+enhances+survival+and+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).</li>
<li>Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+closure+in+neutrophil-depleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice.</a> Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).</li>
<li>Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical Perspective.</a> Circulation. 119 (16), 2209-2216 (2009).</li>
<li>Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+matrix+metalloproteinase-9+with+low-dose+doxycycline+reduces+acute+lung+injury+induced+by+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Clinical+And+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass.</a> International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O principal objetivo deste estudo foi determinar o efeito do andaime COL-CS carregado de DOX na cicatrização de DW em ratos. CL e NCL foram preparados e avaliados em termos de morfologia, índice de inchaço, cinética de liberação in vitro e biocompatibilidade.
Caracterização do DOX carregado NCL e andaime CL Os andaimes preparados foram encontrados porosos com poros interligados. Esses poros interconectados asseguram a natureza porosa e esponjosa que ajuda na difusão adequad...

Diabetes mellitus (DM) é uma condição em que a falha do corpo em fornecer insulina ou reagir aos seus resultados na digestão anormal de açúcares simples provoca um aumento da glicemia 1. O emaranhado mais consecutivo e esmagador do DM é a ferida diabética (DW). Cerca de 25% dos pacientes com DM têm a oportunidade de construir um DW em sua vida 1. A cura dificultada da DW é credenciada a uma triopatia de DM: imunopatia, vasculopatia e neuropatia. Sempre que a DW não for tratada, pode resultar em desenvolvimento de gangrena, levando, portanto, à remoção do órgão em causa 2.
Muitos tratamentos, como instruir os pacientes (inspecionar a ferida diariamente, limpar a ferida, evitar atividades que criam pressão sobre a ferida, monitoramento periódico de glicose, etc.), controlar sua glicemia, desbridamento de feridas, descarga de pressão, procedimento médico, oxigenoterapia hiperbárica e terapias avançadas são na prática 3,4. A maioria desses medicamentos não consegue atender a todos os pré-requisitos vitais para o cuidado da DW à luz das condições fiofofosiológicas multifatoriais e despesas inesperadas relacionadas a esses medicamentos 5. Embora a patogênese dw seja multifatorial, a inflamação persistente com o manejo inadequado do tecido é declarada como a verdadeira razão para a cicatrização retardada em DWs 5,6.
Níveis aumentados de mediadores inflamatórios e pró-inflamatórios na DW resultam em fatores de crescimento diminuídos responsáveis pela cicatrização tardia da ferida 2,6. A formação inadequada de matriz extracelular (ECM) em DWs é credenciada ao aumento dos níveis de metaloproteinases matricial (MMPs) responsáveis pela rápida degradação do ECM formado. Nos MMPs, o MMP-9 é relatado como um dos principais intermediários responsáveis pela inflamação prolongada e degradação rápida do ECM 7. Afirma-se que o tratamento local com um medicamento anti-inflamatório que diminui os níveis elevados de MMP-9 restabelece homeostase cutânea, arranjo de estrutura e solicita melhor cicatrização de DWs 8,9.
A doxiciclina (DOX), inibidora de MMP-9, foi escolhida para suprimir os níveis elevados de MMP-9, um dos principais mediadores inflamatórios responsáveis pela inflamação persistente em DWs 10,11,12. Além disso, o DOX possui antioxidantes (produzem radicais hidroxi e fenoxidos livres capazes de se ligar com espécies reativas de oxigênio) 13 e anti-apoptótico (inibir a expressão caspase e estabilização mitocondrial) 14 atividades essenciais para o tratamento da DW. Foi escolhido o arranjo de quadros contendo DOX, colágeno (COL) e chitosan (CS). A escolha do COL depende da forma como ajuda a fornecer a estrutura necessária responsável pela resistência mecânica e regeneração tecidual 15. Por outro lado, a CS é estruturalmente homóloga ao glicosaminoglicano, associada a várias fases de cicatrização de feridas. Também é relatado que a CS possui uma propriedade antibacteriana significativa 15. Assim, o andaime COL/CS do DOX é formulado para suprimir a inflamação prolongada, seguido por apoiar a formação matricial para cicatrização bem sucedida da ferida em condições de DM.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de 1-etil-(3-3-dimetil aminopropil) carbodiimida (EDC)</td><td>Merck Millipore, Mumbai, Índia</td><td>E7750</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino) etano sulfônico (MES)</td><td>Merck Millipore, Mumbai, Índia</td><td>137074</td><td></td></tr><tr><td>3-(4, 5-dimetil tiazol-2 il) -2, brometo de 5-difenil tetrazólio (MTT)</td><td>Thermo Fisher, Mumbai, Índia</td><td>M6494</td><td></td></tr><tr><td>Vertical</td> <td>de freezerLabline Instruments, Kochi, Índia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saco de diálise</td><td>Merck Millipore, Mumbai, Índia</td><td>D6191-Avg. largura plana 25 mm (1,0 pol.), MWCO 12.000 Da</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, Índia</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Elisa kit</td><td>R& D Systems</td><td>RMP900</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli (E. coli)</td><td>Coleção Nacional de Microrganismos Industriais, Pune, Índia</td><td>NCIM 2567</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck Millipore, Mumbai, Índia</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador-SZ042</td><td>Instrumentos de laboratório Sub-Zero, Chennai, Índia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador Mecânico-RQ-122/D</td><td>Instrumentos de laboratório Remi, Mumbai, Índia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quimosana de peso molecular médio Sisco</td><td>Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, Índia</td><td>18824</td><td></td></tr><tr><td>Microtome-RM2135</td><td>Leica, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células de fibroblastos embrionários de camundongo (3T3-L1)</td><td>Centro Nacional de Ciências Celulares, Pune, Índia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas múltiplas -Inifinte M200 Pro</td><td>Tecan Instrumentos, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxi succinimida (NHS)</td><td>Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, Índia</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)</td><td>Coleção Nacional de Microrganismos Industriais, Pune, Índia</td><td>NCIM 2036</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM)-S-4800</td><td>Hitachi, Índia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Qualigen fine chemicals, Mumbai, Índia</td><td>Q27815</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus (S. aureus)</td><td>Coleção Nacional de Microrganismos Industriais, Pune, Índia</td><td>NCIM 5022</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus epidermis (S. epidermis)</td><td>Coleção Nacional de Microrganismos Industriais, Pune, Índia</td><td>NCIM 5270</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin (STZ)</td><td>Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, Índia</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Tipo-1 rato Colágeno</td><td>Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, Índia</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Ultravioleta&ndash; espectroscopia visível-1700</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

doxycycline carregado de colágeno-chitosan andaime composto para a cura acelerada de feridas diabéticas

Doxycycline Loaded Collagen-Chitosan Composite Scaffold for the Accelerated Healing of Diabetic Wounds

Uma complicação maior do diabetes mellitus são as feridas diabéticas (DW). A fase prolongada de inflamação no diabetes obstrui os estágios adicionais de uma lesão que leva à cicatrização tardia da ferida. Selecionamos a doxiciclina (DOX), como uma droga potencial de escolha, devido às suas propriedades antibacterianas, juntamente com suas propriedades anti-inflamatórias relatadas. O presente estudo visa formular andaimes de colágeno-chitosan carregados do DOX (NCL) e crosslinked (CL) e avaliar sua capacidade de cura em condições diabéticas. O resultado da caracterização dos andaimes revela que o andaime DOX-CL possui porosidade ideal, baixa taxa de inchaço & degradação e uma liberação sustentada de DOX em comparação com o andaime DOX-NCL. Os estudos in vitro revelam que o andaime DOX-CL era biocompatível e melhorou o crescimento celular em comparação com os grupos de controle e tratamento do andaime CL. Os estudos antibacterianos mostraram que o andaime DOX-CL foi mais eficaz do que o andaime CL contra as bactérias mais comuns encontradas na DW. Utilizando a estreptozotocina e o modelo DW induzido pela dieta de alto teor de gordura, observou-se uma taxa significativamente (p≤0,05) mais rápida de contração de feridas no grupo tratado do andaime DOX-CL em comparação com aqueles em grupos de tratamento e controle de andaimes CL. O uso do andaime DOX-CL pode ser uma abordagem promissora para o tratamento local para DWs.

Caracterização do DOX carregado NCL e andaime CL No exame visual, verificou-se que o andaime NCL e CL era de cor creme. Além disso, ambos os andaimes parecem ser como uma esponja, duro e inelástico quando examinados fisicamente. As imagens SEM dos andaimes NCL e CL são mostradas na Figura 1. A partir da figura, ficou claro que houve uma diminuição no tamanho dos poros após a ligação cruzada, formando ligações intermoleculares. Além disso, a porosidade dos andaimes NCL e C...

O andaime DOX-CL preparado satisfazia os pré-requisitos de um curativo DW ideal em resistência mecânica, porosidade, absorção de água, taxa de degradação, liberação sustentada, antibacteriano, biocompatibilidade e propriedades anti-inflamatórias, que são consideradas essenciais para a recuperação de tecido danificado em DWs.

Doxycycline carregado de colágeno-chitosan andaime composto para a cura acelerada de feridas diabéticas

One major complication of diabetes mellitus is diabetic wounds (DW). The prolonged phase of inflammation in diabetes obstructs the further stages of an ...

O trabalho de pesquisa atual é doxycycline carregado de cetamimes compostos de colágeno-chitosano para a cura acelerada de feridas diabéticas. Diabetes é uma doença metabólica crônica caracterizada por níveis elevados de glicose no sangue. Quanto maior o tempo que o indivíduo tem diabetes, maior o risco de complicações, como doenças cardiovasculares, nefropatia, neuropatia, retinopatia e dano no pé, etc.Danos nos nervos nos pés e também fluxo sanguíneo ruim para os pés aumentam o risco de várias complicações do pé. Se não tratadas, essas feridas podem, em última análise, exigir amputações nos dedos, pés ou pernas. Aproximadamente, 25% dos pacientes com diabetes mellitus têm a oportunidade de construir uma ferida diabética durante a vida.O manejo terapêutico das feridas diabéticas continua sendo um obstáculo até o momento que precisa ser eventualmente cruzado. Embora a fisiopatologia da ferida diabética seja multifatorial, acredita-se que o tratamento local com anti-inflamatórios poderia diminuir os níveis elevados de MMP-9 e restabelecer o arranjo da estrutura cutânea da homeostase e provocar a cicatrização em feridas diabéticas. Doxycycline, o inibidor MMP-9, foi escolhido neste estudo para suprimir esses níveis elevados de MMP-9, uma das principais moléculas inflamatórias responsáveis pela inflamação contínua das feridas diabéticas.Por outro lado, os biomateriais fascinam os seres humanos por várias décadas e têm sido o cerne de muitos avanços médicos que mudam o jogo para a entrega eficiente de drogas e macromoleculares e o desenvolvimento de dispositivos biomédicos sob medida. Assim, com esta breve introdução, preparamos um andaime de colágeno-chitosano carregado de doxiciclina para atenuar, para acelerar a cicatrização retardada em feridas diabéticas. Este é Bharat Kumar Reddy, pesquisador do Departamento de Farmacologia, JSS College of Pharmacy, Ooty, Índia.Hoje estamos aqui para olhar o procedimento, como preparar o andaime de colágeno carregado de doxiciclina para a cura acelerada de feridas diabéticas. Vamos ter um vislumbre do procedimento, como se preparar. Vamos preparar 1,2% da solução de colágeno, para a qual estamos tomando 1,2 gramas de colágeno Tipo-I, que é de origem rabo de rato.Para isso, estamos adicionando 100 ml de água millipore e manteve-a de lado por meia hora, a fim de permitir que o colágeno fique protuberância na água. Na etapa seguinte, foi preparada 0,8% da solução quitosana, para a qual estamos tomando 0,8 gramas de quitosan de peso molecular médio, e isso foi misturado com 100 ml de ácido acético de 1%. Esta solução também, nós mantivemos de lado por meia hora.Após meia hora, ambas as soluções foram submetidas a agitação mecânica durante a noite em um RPM de 2000. Para a solução de colágeno agitado durante a noite estamos lentamente adicionando um grama de doxiciclina. E a solução contendo este colágeno e doxiciclina foi submetida por meia hora de agitação em um RPM de 2000.Para esta solução estamos lentamente adicionando solução chitosana agitada durante a noite. E isso, certifique-se de que é rotulado como mistura física que contém doxiciclina, colágeno, chitosan. Esta mistura física que submetemos por mais meia hora de agitação em um RPM de 2000.Após meia hora, essa mistura física foi transferida para os respectivos moldes de alumínio, que tem uma dimensão de dois a dois centímetros e uma espessura de 0,5 centímetro. Mais tarde, esses moldes foram transferidos para um recipiente de metal. Estes recipientes metálicos continham os moldes de alumínio, foi submetido a congelamento profundo.Depois de 24 horas, podemos ver claramente a mistura física solidificada contendo doxilalina, colágeno e chitosan. Essa mistura física solidificada foi ainda mais submetida à liofilização. A liofilização foi realizada a menos 85 graus mais ou menos quatro graus Celsius durante 72 horas.Após 72 horas, o material liofilizado foi retirado do liofilizado. E aqui podemos ver claramente a mistura física completamente seca, que não é nada além de conhecida como doxycycline carregado de colágeno-chitosan andaime. Estes andaimes foram submetidos a crosslinking A fim de realizar crosslinking, inicialmente, o buffer MES foi preparado tomando 0,488 gramas de MES e 15 ml de água, dos quais estamos tirando 20 ml de buffer MES e transferindo separadamente para o seu béquer.Para estes 20 ml de béquer, 50 mg de doxycycline carregado colágeno-chitosan foi adicionado. E a imersão deste andaime foi realizada por meia hora. Depois de meia hora, o andaime de colágeno-chitosano carregado de doxycycline foi retirado do buffer MES de 20 ml.Além disso, foi embebido em uma solução contendo 19,5 ml de tampão MES, 0,1264 gramas de EDC e 0,014 gramas de NHS. A imersão foi realizada durante quatro horas de intervalo de tempo para a conclusão do crosslinking. Após o crosslinking, o andaime de doxiciclina carregado de doxiciclina foi retirado da solução e transferido para um recipiente, que foi detalhado no procedimento anteriormente, e secou separadamente.Aqui podemos ver claramente o andaime não-cruzado e transligado, juntamente com as mesmas imagens. A partir das imagens é claro que a interligação do andaime resultou na diminuição do tamanho dos poros devido à formação de fortes ligações intramoleculares. O rato Wistar macho foi levado e os dois em marca de dois centímetros foram desenhados na região torácica dorsal.A ferida de excisão foi criada em torno da marca e o rastreamento da ferida foi levado em uma folha de OHP. O traço da ferida foi medido com a ajuda do método gráfico. A ferida criada no animal foi de cerca de 176 mm.Mais tarde, a ferida criada foi tratada com doxycycline crosslinked carregado de ceta de colágeno-chitosan com o curativo primário e monitorado por 21 dias. Uma vez que o animal foi recuperado da anestesia, cada animal foi enjaulado individualmente. E esses animais foram alimentados com dieta normal e água.Todos os animais, após a criação da ferida, foram divididos em três grupos em que cada grupo continha seis animais. Aqui podemos ver claramente a diferença entre zero dia e sete dias em que a doxiciclina carregada de escaminho cruzado foi de cerca de 48% E nesta imagem podemos ver claramente a diferença entre o dia 14 e o dia 21 de todos os grupos em que o andaime de colágeno carregado de doxiciclina foi curado em torno de 99% A área curada foi isolada e processada para estudos histopatológicos com a ajuda da coloração do HMB. Aqui podemos ver claramente a epiderme reepithelizada, no dia 21, no andaime de colágeno carregado de doxiciclina.Considerando que no controle e no andaime cruzado, nada além de placebo, ainda assim a epiderme tinha que ser formada. Como nosso próprio estudo, os andaimes cruzados doxiciclina preparados têm exibido muitas propriedades ideais, como boa resistência mecânica, biocompatibilidade, absorção sustentada de água de liberação, juntamente com propriedades antibacterianas e anti-inflamatórias. Estes andaimes podem ser uma forma ideal de dosis para o tratamento de feridas diabéticas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um grande obstáculo em terapias com células-tronco atuais é determinar o método mais eficaz para entregar essas células para tecidos do hospedeiro. Aqui, nós descrevemos um método de entrega de quitosana-base que é eficiente e simples na abordagem, ao mesmo tempo permitindo que as células-tronco adiposas para manter a sua multipotency.

Construindo um hidrogel de colágeno para a entrega de células-tronco carregado microesferas

A engenharia de tecidos muitas vezes inclui expansão in vitro, a fim de criar auto-enxertos para regeneração de tecidos. Neste estudo, um método para a expansão do tecido, a regeneração, e a reconstrução in vivo, foi desenvolvida de modo a minimizar o processamento de materiais biológicos e as células fora do corpo.

O tecido triturado em Compressed Collagen: Um BioTransplant contendo celular para o reparo Reconstructive Single-encenado

Células-tronco adiposo-derivado (ASCs) são facilmente isoladas e colhidas a partir da gordura de ratos normais. ASC as folhas podem ser criadas usando a célula-folha engenharia e podem ser transplantadas Zucker ratos diabéticos gordos, exibindo a espessura total da pele defeitos com osso exposto e então coberto com uma BICAMADA de pele artificial.

Criação e transplante de uma folha de células-tronco adiposo-derivado (ASC) em um modelo de cicatrização de feridas diabética

As feridas crônicas são desenvolvidas a partir de feridas agudas em um modelo de mouse diabético induzindo altos níveis de estresse oxidativo após uma ferida cutânea de espessura total. A ferida é tratada com inibidores para catalase e glutationa peroxidase, resultando em comprometimento da cicatrização e desenvolvimento de biofilme por bactérias presentes no microbioma cutâneo.

Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

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Síntese de Hidrogéis de Matriz Extracelular de Cartilagem Descelularizada

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Otimizando a entrega de vesículas extracelulares usando um andaime bioimpresso em 3D com bainha central para tratamento de feridas crônicas

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Desenvolvimento de um Modelo de Bancada para Avaliação da Compatibilidade de Materiais de Curativos com Sistemas de Terapia de Feridas por Pressão Negativa

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Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

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Doxycycline carregado de colágeno-chitosan andaime composto para a cura acelerada de feridas diabéticas

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