Preparação rápida da grade para microscopia crio-elétron resolvida pelo tempo

Olá, e bem-vindos a este vídeo do JoVE". Queremos apresentá-lo à configuração que temos aqui para fazer uma grade rápida, um estudo resolvido pelo tempo que estamos desenvolvendo em Leeds. Esteja ciente de que este não é um sistema padrão, mas esperamos que, dando-lhe um relato detalhado de todas as coisas e os parâmetros que fazemos, você será capaz de desenvolver sistemas semelhantes em seus próprios laboratórios.

Uma descrição detalhada do dispositivo é dada no protocolo richmond. Aqui, vamos dar um guia passo a passo para a preparação rápida da grade e o EM resolvido com o tempo. Em nossa experiência, a concentração de proteínas deve ser de dois miligramas por mililitro ou superior. O protocolo requer um volume mínimo de cerca de 50 microliters.

Ligue o dispositivo. Em seguida, ligue o PC de controle e inicie o software de controle. Inicialize todas as bombas de seringa pressionando o botão inicialize em cada bomba de seringa.

Ligue a fonte de alimentação do potencialiômetro, coloque-a em nove volts e inicie o software de controle do osciloscópio. Gás nitrogênio pressurizado é necessário para gerar o spray. Abra o cilindro de nitrogênio e coloque a pressão em 2 barras.

Certifique-se de que todas as válvulas da bomba de seringa estão em posição de carga. Para fazer isso, troque todas as válvulas para dispensar no software de controle e depois volte a carregar. Coloque todas as seringas a zero.

Quaisquer bolhas de ar presentes no sistema devem ser removidas nesta fase. Para isso, as seringas podem ter que ser desparafusadas, bolhas removidas manualmente, e as seringas montadas novamente quando não contêm mais bolhas. O sistema de manuseio líquido é geralmente armazenado em água.

Antes de carregar a amostra, o sistema é equilibrado com buffer. Isso é feito lavando a tubulação com um excesso de tampão. Coloque um tubo contendo pelo menos 200 microliters de tampão sobre uma seringa.

A parte superior do tubo deve ser perfurada para anexá-lo. Aspire uma quantidade adequada de buffer, entre 50 e cem microliters com seringa usando o software de controle. Troque a válvula um para dispensar.

Dispense todo o líquido em uma seringa. Volte a válvula um para a posição de carga e pressione o botão inicialize na seringa para preparar o sistema para o próximo ciclo de lavagem. Essas etapas geralmente são repetidas três vezes para garantir a lavagem completa da tubulação.

Em seguida, o bocal de spray está posicionado. Coloque uma grade EM no braço de mergulho. Posicione a grade em frente ao bocal de pulverização.

Dispense o buffer usando o software de controle. Se o bocal e a grade estiverem alinhados, o líquido deve acumular-se após a pulverização por um longo período de tempo. Se necessário, ajuste a posição do bocal e verifique novamente onde o líquido se acumula na grade.

Em seguida, ajuste a posição da xícara de etano. A ponta das pinças deve chegar aproximadamente ao centro do copo de etano. Realize um teste para garantir que todas as configurações estejam corretas.

Feche a câmara de umidade. Certifique-se de que o caminho do êmbolo está limpo. Aspire o volume de buffer necessário para uma única corrida em uma seringa.

Troque a válvula um para dispensar. Inicie a execução pressionando run'in no software de controle. Verifique se a bomba de seringa está se movendo, dois segundos neste caso, e a grade é mergulhada após um atraso apropriado, 1,5 segundos aqui.

Quando a corrida estiver concluída, coloque a pressão no braço do êmbolo para o valor desejado. Pressione OK'in no software de controle para liberar a pressão do braço mergulhando. Agora o copo de etano está frio e cheio de etano líquido.

Descarreto das grades antes de usar. Uma descarga típica de brilho é de 90 segundos a 10 miliamperes em ar de 0,1 milibar. A tubulação é então equilibrada com amostra.

Se o volume amostral disponível for baixo, a tubulação pode ser equilibrada com apenas um volume morto. Amostra aspirada. Normalmente, o volume morto é de cerca de 30 microliters.

Troque a válvula um para dispensar. Distribua a amostra através de tubos e bocal. Em seguida, aspire a quantidade de amostra necessária para uma única corrida.

Troque a válvula um para dispensar. Verifique se a umidade relativa atingiu o valor desejado. Normalmente preparamos grades a 60% ou mais.

Isso pode levar alguns minutos. Coloque a pinça segurando uma grade com descarga de brilho no braço de mergulho. Coloque o deslizamento do potencialiômetro na posição inicial, pronto para a medição da velocidade.

Defina o gatilho para a medição de velocidade no software osciloscópio. Coloque o copo de etano líquido e perto da câmara de umidade. Certifique-se de que o caminho do êmbolo está limpo.

Inicie a execução no software de controle. Quando a corrida estiver concluída, pressione OK'in no software de controle para liberar a pressão do braço mergulhando. Abra a câmara de umidade, solte a conexão entre o braço mergulhando e a pinça.

Mova o braço mergulhando enquanto mantém a grade em etano líquido. Em seguida, transfira as grades para nitrogênio líquido e para armazenamento. Salve a medição do osciloscópio.

Reinicie manualmente a posição do controle deslizante e do êmbolo do potencialiômetro. Repita o protocolo para preparar grades de replicação. Experimentos resolvidos pelo tempo são feitos de forma semelhante.

Maiores concentrações de estoque são necessárias para experimentos resolvidos por causa da diluição na etapa de mistura. Para um experimento resolvido pelo tempo, use as três seringas. A tubulação é anexada às bombas de seringa e ao bocal de pulverização.

O bocal de spray microfluido usado aqui também contém um elemento de mistura. Observe que tubos mais longos darão um maior volume morto e as etapas de equilíbrio de lavagem requerem mais buffer e amostra. Equilibre todas as seringas com tampão e amostra separadamente.

Normalmente, a seringa é usada para a amostra A'e as seringas dois e três são usadas para a amostra B'Depois que a tubulação é equilibrada, carregue a amostra A em uma seringa e prove B em seringas dois e três. Em seguida, troque as válvulas de um a três para dispensar. Inicie a execução no software de controle.

Observe que um script de execução diferente é necessário para um experimento resolvido com o tempo. Diferentes atrasos de tempo podem ser alcançados de duas maneiras. Ajustando a velocidade do êmbolo, o atraso de tempo da mistura para o congelamento pode ser alterado.

Uma velocidade de mergulho mais rápida levará a um menor atraso de tempo. Alternativamente, a distância de etano spray é alterada ajustando a posição vertical do bocal de pulverização. Aumentar a distância resultará em um atraso de tempo maior.

No microscópio eletrônico em baixa ampliação, uma grade típica se parece com isso. Áreas de gelo fino, como indicado, são adequadas para aquisição de dados. Em ampliações mais altas, as partículas devem ser claramente visíveis.

Com um espécime de teste como a apoferritina, um conjunto de dados relativamente pequeno de uma única grade é suficiente para uma reconstrução a três a quatro de resolução angstrom. Para experimentos resolvidos com o tempo, coletamos conjuntos de dados de diferentes pontos de tempo ou grades. É útil combinar os dados para classificação 3D e, em seguida, rastrear partículas de volta aos seus pontos de tempo.

Dessa forma, os dados podem fornecer informações estruturais e informações sobre a cinética de reação. Em conclusão, esperamos que tenham gostado do vídeo. Esperamos que, com as descrições detalhadas no artigo do JoVE junto com o vídeo, você seja capaz de conduzir seus próprios experimentos através da fabricação rápida da grade, que tem sido mostrado para aliviar alguns dos problemas da mutação ou para ajudar com interações na interface ar-água, tudo o que você precisa para conduzir seus próprios estudos resolvidos no tempo para tentar capturar alguns desses estados de equilíbrio não-equilíbrio.

Então, feliz grid making.