Microscopia Multifotol Intravital em Tempo Real para visualizar tratamentos focados de ultrassom e microbolhas para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica

A exposição ao ultrassom na presença de microbolhas emergiu como um método eficaz para aumentar transitoriamente e localmente a permeabilidade da barreira hematoencefálica. Normalmente, a barreira hemencefálica impede a entrega de drogas potenciais para várias doenças cerebrais. Após a sônica, os microbolhas injetados começam a oscilar e induzir tensão na parede do vaso, abrindo junções apertadas e eventualmente permitindo que as drogas atravessem a barreira hematoencefálica Em modelos pré-clínicos, o efeito do tratamento de ultrassom e microbolhas são frequentemente estudados por ressonância magnética aumentada em contraste ou por meio do estudo da extravasação de corantes ex vivo.

A desvantagem dessa abordagem é que a resposta em tempo real durante e imediatamente após a exposição ao ultrassom não pode ser adquirida. A imagem multifoton intravital do cérebro dá a oportunidade de estudar esses efeitos em tempo real. No vídeo a seguir, apresentaremos instruções stepwise sobre como colocar uma janela craniana em um rato e realizar o tratamento de microbolhas de ultrassom usando um transdutor de anel montado no crânio.

Este procedimento permite a sonicação simultânea e imagens multifoton in vivo. Para começar a preparar os materiais necessários para a cirurgia da janela craniana e tratamentos de microbolhas de ultrassom. Neste vídeo, mostramos uma cirurgia aguda de janela craniana não-recuperação.

Para a cirurgia da janela craniana de recuperação crônica, são necessárias ferramentas e materiais esterilizados, um espaço cirúrgico estéril e drogas apropriadas. Antes da cirurgia, a administração de anestesia e analgesia. Remova a pele na cabeça.

Coloque o animal em uma moldura estereotaxa. Insira um cateter na veia da cauda para injeções de dextran e microbolhas. Mantenha a temperatura do núcleo do animal de 37 graus usando uma fonte de calor.

Aqui estamos usando uma luva cheia de água morna. Para remover o couro cabeludo, levante a pele entre os olhos usando fórceps e corte ao longo da sutura sagital. Remova o periosteum que cobre a superfície externa do crânio com um cotonete.

Depois marque a localização desejada da janela craniana no crânio e comece a perfurar ao longo do contorno. Para evitar que o crânio superaqueça durante a perfuração, goteque soro fisiológico no crânio usando uma seringa ou aplique um pedaço de esponja cirúrgica embebido em soro fisiológico. Alternar entre perfurar e esfriar o crânio.

Verifique o progresso da perfuração aplicando pressão suave na ilha óssea. Remova a ilha óssea usando um par de fórceps. Certifique-se de que o cérebro é mantido úmido usando um pedaço de esponja cirúrgica que foi preso em soro fisiológico.

Para colocar uma janela craniana, coloque uma gota de soro fisiológico em um lado de uma mancha de cobertura e manobrá-la sobre o buraco no crânio. Espalhe uma camada de cola ao redor do perímetro da mancha para nexá-la ao crânio. Uma vez que a cola esteja completamente seca, deposite a solução agarose na janela e coloque o transdutor em cima.

Aplique pressão firme de tal forma que haja uma agarose mínima entre o transdutor e a janela craniana. Quando a agarose esfriar para uma consistência semelhante a gelatina, corte o excesso de agarose das circunferências do deslizamento de cobertura do transdutor. Espalhe uma camada de cola ao longo das circunferências da tampa do transdutor para aderir ao crânio.

Depois que a cola estiver completamente seca, posicione o animal sob a lente objetiva do microscópio. Certifique-se de que o objetivo não colida com o transdutor ou deslizamento de tampas. Selecione um campo de visão no microscópio multifotônio.

Configure uma varredura de imagem da vasculatura e comece a sônicação. Para este protocolo, utilizamos um transdutor de anel que é operado a uma frequência de condução de 0,82 mega-hertz, ciclos de 10 milissegundos mecanicamente indexados de 0,2 a 0,4, e frequências de repetição de pulso entre um e quatro Hertz. Microbolhas sonovue são injetadas a uma dose de um mililitro por quilograma.

Tratamentos de microbolhas de ultrassom bem sucedidos podem ser detectados pela extravasação do dextran fluorescente do intravascular ao espaço extravascular, indicando um aumento na permeabilidade do BBB. Para avaliar a cinética do vazamento do Dextran como modelo representativo para a entrega de medicamentos, a intensidade do sinal entre os espaços intra e extravascular pode ser avaliada utilizando ferramentas como o MATLAB. Para avaliar as alterações vasculares induzidas pelos tratamentos de microbolhas de ultrassom, o diâmetro do vaso de interesse pode ser medido antes, durante e após o tratamento de microbolhas de ultrassom.

A análise de imagens pode ser conduzida usando softwares como ImageJ, FIJI ou ferramentas de programação. Aqui Imaris foi utilizado para segmentação e classificação de vasos sanguíneos. Microscopia multifotílica intravital do cérebro combinada com transdutores de anel fornecem um método para monitorar os efeitos induzidos pelo tratamento de microbolhas de ultrassom em tempo real em alta resolução espacial e temporal.

Dados quantitativos e qualitativos podem ser obtidos para estudar, por exemplo, cinética de extravasação e alterações vasculares. O método experimental aqui apresentado pode ser aplicado a diversos modelos de pesquisa e a diversas aplicações de ultrassom.