Name: Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a produzir células CAR-T humanas editadas por CRISPR-Cas9 com alta eficiência. Este protocolo robusto permite edição multiplex de genes e facilita aplicações clínicas em imunoterapia contra câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconhecemos o Núcleo de Imunologia Humana por fornecer células T doadoras normais e o Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade da Pensilvânia.

As células T humanas foram adquiridas através do Núcleo de Imunologia Humana da Universidade da Pensilvânia, que opera sob princípios de Boas Práticas laboratoriais com procedimentos operacionais padrão estabelecidos e/ou protocolos para recebimento de amostras, processamento, congelamento e análise de acordo com as diretrizes éticas da MIATA e da Universidade da Pensilvânia.
1. Produção de vetores lentiviral
NOTA: Os produtos virais foram transformados com defeito de replicação pela separação de construtos de embalagens (Rev, gag/pol/RRE, VSVg e plasmid de transferência) em quatro plasmídeos separados, reduzindo consideravelmente a probabilidade de eventos de recombinação que podem resultar em vírus competentes para replicação.
<ol><li>Prepare as células HEK293T um dia antes da transfecção. Placa aproximadamente 6 x 106 células em vasos de cultura T150 em 30 mL de mídia de cultura padrão (referido como R10:RPMI 1640 complementado com 10% de soro fetal do bezerro, 10 mM HEPES, 1% Pen/Estreptococos, 1% L-glutamina) e incubar durante a noite a 37 °C. 18-24 h depois, as células devem ser 60-70% confluentes e parecem saudáveis (projeções dendríticas e distribuição uniforme em todo o frasco). Se as células parecerem saudáveis, prossigam para o passo 1.2.</li>
	<li>Prepare a mistura de transfecção contendo reagente de lipofecção (96 μL), gag/pol pTRP (Lote# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lote# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lote# RR13SEP19C) (7 μg) plasmídeos de embalagem e 15 μg de plasmídeo de expressão (CD19bbz scFv clonado em pTRPE).<ol>
<li>Para cada reação de transfecção, prepare um tubo contendo 1 mL de mídia essencial mínima de soro reduzido mais os quatro plasmídeos descritos na etapa 1.2, bem como um tubo contendo 2 mL de mídia essencial mínima de soro reduzido mais 90 μL de reagente lipofectivo. Combine essas duas soluções pela adição dropwise da mistura de plasmídeos de 1 mL ao mix de reagente de 2 mL de lipofecção. Certifique-se de misturar vigorosamente a solução, pipetting para cima e para baixo várias vezes. Incubar a solução por 15 minutos em temperatura ambiente.</li>
		<li>Enquanto isso, aspire a mídia do frasco de células HEK293T e lave suavemente as células com 10 mL de mídia essencial mínima de soro reduzido e aspire novamente.</li>
		<li>Adicione suavemente a mistura de transfecção (3 mL) da etapa 1.2.1 ao canto inferior do frasco de cultura celular usando uma pipeta sorológica de 5 mL. Incline suavemente o frasco para distribuir uniformemente a mistura de transfecção através do frasco de cultura celular e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Certifique-se de não perturbar a monocamada celular. Após uma incubação de 10 minutos, adicione 35 mL de mídia R10 e devolva o frasco à incubadora por 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após 24 horas, colete o supernaente dos frascos de cultura celular HEK293T e transfira para tubos cônicos de 50 mL. Adicione R10 fresco às células HEK29T e coloque as células de volta na incubadora por mais 24 h. Gire o supernante (300 x g) para remover detritos celulares e filtrar o sobrenante através de um filtro de 0,45 μm.</li>
	<li>Concentre o filtrado da etapa 1.3 por ultracentrifugação de alta velocidade (25.000 x g para 2,5 h ou 8000 x g durante a noite (O/N)). Armazene a pelota do vírus 24h a 4 °C enquanto junta o vírus de 48 horas.</li>
	<li>Repita as etapas 1.3-1.4 para a coleta de 48 horas e combine coletas de vírus de 24h e 48 horas. As pelotas da coleção de 48 h conterão uma colheita combinada do lentivírus.</li>
	<li>Resuspend pelota viral em aproximadamente 1 mL de R10 frio e alíquota em frascos de 100 μL. Imediatamente encaixe as alíquotas usando gelo seco e armazene a -80 °C.</li>
	<li>Calcule o títulor viral funcional em unidades transdutoras/mL transduzindo uma quantidade fixa de células T humanas primárias ativadas por contas CD3/CD28 com diluições seriais do supernatante lentiviral. Meça CAR-Transdução após 72 h por citometria de fluxo.<ol>
<li>Mancha para o CAR dirigido por CD19 com um anticorpo scFv anti-FCM63. Para outros receptores de antígeno quimérico, colori a mancha usando proteína recombinante rotulada por fluorohore que é específica do CAR scFv. A diluição do vírus que gera menos de 20% de células positivas car por citometria de fluxo é a diluição mais precisa para calcular o título viral. Acima de 20% de células CAR-positivas, a chance de cada célula positiva ser transduzida duas vezes aumenta, resultando em uma subestimação do número de partículas transdutoras. Calcule as unidades transdutoras por mL (TU/mL ) = (número de células transduzidas x por cento CÉLULAS POSITIVAS CAR x fator de diluição)/(volume de transdução em mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Projetando sgRNAs e interrupção genética em células T humanas primárias
<ol><li>Projetando crispr sgRNA's NOTA: Vários servidores e programas facilitam o design de sgRNA's específicos para alvos. Neste protocolo, os sgRNAs CRISPR foram projetados usando chopchop (https://chopchop.cbu.uib.no), e o portal de design gRNA do Instituto Broad (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).<ol>
<li>Para cada gene alvo, projete de seis a dez sequências de sgRNA para direcionar sequências de exon de codificação precoce. NOTA: o sgRNA deve ter alta eficácia no alvo e baixa eficácia do alvo. Cada algoritmo de aprendizagem de máquina para determinar a eficácia do sgRNA funciona de forma ligeiramente diferente. Portanto, recomenda-se comparar múltiplas ferramentas de design sgRNA e fazer a curadoria de uma lista de seis a dez sgRNA para triagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Interrupção genética em células T humanas primárias<ol>
<li>Obtenha células mononucleares periféricas autólogas (PBMC's) de doadores voluntários saudáveis. Uma linha do tempo esquemática do protocolo é descrita na Figura 2A e descrita abaixo.</li>
		<li>Isole as células CD4+ e CD8+ T usando kits de seleção CD4 e CD8 disponíveis comercialmente.</li>
		<li>Combine células CD4+ e CD8+ T a uma proporção de 1:1 e incuba durante a noite a 3x106 células/mL em R10 complementadas com 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15 cada. A adição de IL-7 e IL-15 é recomendada, pois são conhecidas por promover um fenótipo de memória central e as células CAR-T expandidas com IL-7 e IL-15 têm eficácia tumoral superior em comparação com células CAR-T expandidas IL-222,23,24.</li>
		<li>No dia seguinte, conte células T e centrífuga 5-10 x 106 células a 300 x g por 5 min. Descarte todo o supernatante e lave a pelota celular em meio essencial mínimo de soro reduzido. Resuspente a pelota em 100 μL de solução de nucleosfeição de acordo com as instruções do fabricante(Tabela de Materiais).</li>
		<li>Durante a lavagem das células, prepare o complexo de ribonucleoproteína (RNP) com Cas9 e gRNA incubando 10 μg de nuclease Cas9 com 5 μg de sgRNA por 10 minutos à temperatura ambiente (RT). A relação molar de Cas9 para sgRNA é de 1:2.4. Um controle simulado que contém Cas9 e melhorador de eletroporação, mas nenhum sgRNA, é recomendado. NOTA: A edição de genes multiplex pode ser realizada nesta etapa, fazendo complexos RNP para cada alvo separadamente e combinando-os com células no momento da nucleofecção, conforme descrito na etapa seguinte. Escolher os reagentes para montar o complexo RNP é fundamental para obter alta eficiência ko. Por exemplo, os núcleos Cas9 de diferentes fornecedores têm efeitos fora do alvo variados e gRNA quimicamente modificados diminuem a toxicidade para as células T, aumentando assim a eficiência do KO.</li>
		<li>Combine as células resuspended da etapa 2.2.4 com o complexo RNP a partir da etapa 2.2.5 e adicione 4,2 μL de melhorador de eletroporação de 4 μM (oligonucleotídeo ssDNA que não é homólogo ao genoma humano). Misture bem e transfira para cuvetas de eletroporação. Evite bolhas, pois prejudicam a eficiência da eletroporação.</li>
		<li>Células eletroporadas usando código de pulso EH111. Após a eletroporação, incubar células em R10 complementadas com 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15 a 5x106 células/mL a 30 °C para 48 h em placas de 12 poços. Após 48 h, proceda com ativação e expansão de células T.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ativação celular T, transdução lentiviral e expansão
NOTA: Para a triagem do SGRNA's, a transdução lentiviral (Etapa 3.2) da construção do CAR não é necessária.
<ol><li>Conte células T eletroporadas e diluir a uma concentração de 1 x 106 células/mL usando R10 quente suplementado com 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15. Ative as células adicionando contas magnéticas monoclonais anti-CD3/anti-CD28 revestidas de contas magnéticas a uma proporção de 3 contas por célula T viva. NOTA: A eletroporação causa morte celular significativa, resultando em cerca de 60% ± 15% de células viáveis em comparação com células não eletroporadas. Use uma contagem de células vivas/mortas para determinar a quantidade apropriada de contas. Transfira as células para 37 °C e incubar durante a noite.</li>
	<li>Após a estimulação durante a noite, transduem células T projetadas pelo CRISPR com supernatante lentiviral a partir do passo 1. Adicione o volume apropriado com base no título viral calculado na etapa 1.7 para alcançar uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3 e incubar células por 72 h a 37 °C. NOTA: A pelota do vírus resuspendida em R10 é simplesmente adicionada em cima das células de acordo com a concentração celular, o título viral e o MOI desejado.</li>
	<li>Após 72 h, alimentar células com 50% do volume de cultura atual R10 contendo 10 ng/mL huIL-7 e huIL-15 e devolvê-las à incubadora por mais 48 h. Não perturbe os aglomerados que se formaram entre as células T e as contas.</li>
	<li>Após 48 h, remova as contas das células, reutilizando suavemente a mistura celular-contas seguida de separação magnética. Conte as células após a remoção das contas e leve a uma concentração de 0,8 x 106 células/mL usando R10 suplementado com 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15. Após a desescrição, os números de células devem ser semelhantes à contagem celular no dia 1 anterior à eletroporação(Figura 2B).</li>
	<li>Após 24 h, conte células e alimente uma concentração de 1 x 106 células/mL com R10 + 5 ng/mL huIL-7 e huIL-15. Repita isso a cada 24 horas até que a cinética de crescimento e o tamanho das células demonstrem que as células descansaram da estimulação. NOTA: A partir deste ponto, as células T dobram aproximadamente a cada 24h. As células T geralmente sofrem duplicações populacionais de 5 a 7 e têm um volume celular de aproximadamente 300 ± 50 fL quando descansadas.</li>
	<li>Uma vez descansado, gire as células CAR-T projetadas pelo CRISPR e resuspende em mídia congelada (1:1 X-Vivo e FBS mais 10% DMSO) para criopreservação. As células CAR-T utilizadas devem ser descongeladas e descansadas a 37 °C durante 16 horas antes de um experimento. NOTA: Mantenha aproximadamente 10x106 células reservadas para medir a eficiência do nocaute e a integração do CAR. As duplicações populacionais esperadas e as mudanças de volume durante a expansão foram mostradas na Figura 2B,2C. Além disso, a Figura 2D mostra níveis de expressão CAR em células CAR-T editadas por genes e genes.</li>
</ol>4. Eficiência CRISPR
<ol><li>Extração genômica de DNA e amplificação genética alvo<ol>
<li>A partir de cada cultura de triagem, gire para baixo 3-5 x 106 células T. As células podem ser congeladas como uma pelota seca ou pode-se prosseguir com a extração genômica de DNA. No momento da extração do DNA, resuspend pelotas em 200 μL de Salina Tampão fosfato (PBS) e extrato de DNA genômico de células eletroporadas usando um kit padrão de extração de DNA de acordo com a instrução do fabricante.<ol>
<li>Resumidamente, células de lise com proteinase K e carregam lysate em uma coluna de ligação de DNA. Durante a centrifugação, o DNA está ligado à membrana enquanto os contaminantes passam. Depois de duas etapas de lavagem para remover contaminantes restantes e inibidores de enzimas, elute DNA na água.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplie 200-300 ng de DNA genômico usando mistura pcr padrão contendo polimerase de DNA, proteínas acessórias, sais e dNTPs e primers 10 μM para frente e reverso flanqueando a região do rompimento de dois fios pretendido. NOTA: Para o design da cartilha PCR, a sequência genômica de referência (pode ser encontrada usando http://www.ensemble.org) flanqueando o local de corte de gRNA são inseridos na ferramenta de explosão do primer NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Os primers PCR devem ser projetados de tal forma que o amplicon tenha um tamanho de alvo de 600-700bp. Este comprimento permite projetar primers de sequenciamento que se ligam dentro do amplicon com distância suficiente do local de corte de gRNA (pelo menos 150 bp) para garantir uma boa qualidade de sequenciamento em torno dos indelos induzidos cas9 (ver 4.2.1). Cada gRNA requer um par de primer único, a menos que os locais de corte de gRNA estejam próximos.</li>
		<li>Execute todo o produto PCR em um gel de 1% de agarose e purifique o amplicon usando um kit padrão de purificação de gel agarose. NOTA: O processo de determinação do Tm ideal para PCR pode levar várias rodadas de solução de problemas. Isso ocorre porque a sequência ko tem indels e o gene alvo deve ser preparado para sequenciamento onde não haveria indels geralmente 100 bp upstream ou downstream do local cortado. Isso pode variar muito devido aos indels resultantes da adesão final não homólogo. Projetar primers de sequenciamento aninhados para os primers PCR e aumentar a concentração de sequenciados do produto pode eliminar problemas com sequenciamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Sequenciamento e detecção indel<ol>
<li>Projete primers de sequenciamento que se ligam ao amplificador purificado de gel e envie amplificadores simulados e eliminatórios para sequenciamento Sanger. Uma vez que o sequenciamento esteja concluído, carregue os arquivos de rastreamento para o software Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) para análise de TIDE.<ol>
<li>Para sequenciar o design da primer, digite a sequência da amplicon PCR em um software de design primer padrão (NCBI, Eurofins ou outras ferramentas disponíveis publicamente). O software de design sugerirá várias sequências de primer adequadas para sequenciamento de sanger.</li>
			<li>Escolha primers para a frente e para trás que se ligam dentro do amplicon pelo menos 150 bp upstream ou downstream do local de corte gRNA para garantir uma boa qualidade de sequenciamento em torno dos indels. O cromatógrafo sequenciamento será usado em 4.2 para análise de MARÉ, portanto é importante que a qualidade do sequenciamento seja boa para a decomposição indeléfera precisa (ver Hultquist et al.) 25.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use a análise TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) para detectar a eficiência do knock out (KO) no nível genômico26. O algoritmo reconstrói com precisão o espectro de indels a partir dos traços de sequência e calcula os valores de R2, refletindo a bondade do ajuste após a modelagem linear não negativa pelo software TIDE.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de proteínas-alvo<ol>
<li>Para genes-alvo cujo produto genético é expresso na superfície das células T, colora aproximadamente 1 x 105 células de cada cultura de triagem com um anticorpo marcado fluorocromo específico para a proteína alvo. Compare os níveis de expressão da proteína alvo entre o controle simulado e os grupos eliminatórios por citometria de fluxo, como mostrado na Figura 3A,3B.</li>
		<li>Para genes-alvo cujo produto genético é expresso intracelularmente, lise aproximadamente 3 x 106 milhões de células por grupo de triagem em tampão de lise e siga protocolos padrão para SDS-PAGE e mancha ocidental. Alternativamente, a flutometria de fluxo superficial ou intracelular pode ser usada para sondar a proteína alvo.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Monitoramento de efeitos fora do alvo usando iGUIDE - Preparação da biblioteca, sequenciamento de DNA e análise
NOTA: a técnica iGUIDE permite a detecção de locais de decote guiado Cas9 e quantificar as distribuições dessas quebras duplas de DNA.
<ol><li>Realize iGUIDE como descrito por Nobles et al.21. Os efeitos fora do alvo do sgRNA visando o lócus TRAC usando a técnica iGUIDE foram mostrados em Stadtmauer et al, 202013.</li>
</ol>

<ol><li>Kowolik, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).</li>
<li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-dependent+CD28+signaling+selectively+enhances+survival+and+proliferation+in+genetically+modified+activated+human+primary+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).</li>
<li>Kuwana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+chimeric+receptor+composed+of+immunoglobulin-derived+V+resions+and+T-cell+receptor-derived+C+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+Communications%22%5BJournal%5D)">Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions.</a> Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).</li>
<li>Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-lymphocyte+cytotoxicity+and+proliferation+directed+by+a+single+chimeric+TCR%CE%B6%2FCD28+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR-T cell therapy.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+ciloleucel+CAR-T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+and+NK-cell+infiltration+into+solid+tumors%3A+a+key+limiting+factor+for+efficacious+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy.</a> Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).</li>
<li>Mohammed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cell+function+by+reversing+the+immunosuppressive+tumor+microenvironment+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer.</a> Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).</li>
<li>Moon, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifactorial+T-cell+hypofunction+that+is+reversible+can+limit+the+efficacy+of+chimeric+antigen+receptor-transduced+human+T+cells+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).</li>
<li>Beatty, G. L., O'Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+the+treatment+of+solid+tumors%3A+defining+the+challenges+and+next+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps.</a> Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).</li>
<li>Stadtmauer, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-engineered+T+cells+in+patients+with+refractory+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer.</a> Science. 367 (6481), (2020).</li>
<li>MacLeod, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+a+CD19+CAR+into+the+TCR+alpha+chain+locus+streamlines+production+of+allogeneic+gene-edited+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells.</a> Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+editing+to+generate+universal+CAR-T+cells+resistant+to+PD1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).</li>
<li>Ureña-Bailén, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+technology%3A+towards+a+new+generation+of+improved+CAR-T+cells+for+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).</li>
<li>Li, C., Mei, H., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+explorations+of+CRISPR%2FCas9+in+CAR-T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, 00471(2013).</li>
<li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).</li>
<li>Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+choices%3A+regulation+of+memory+CD8+T+cell+generation+and+homeostasis+by+interleukin+%28IL%29-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Hultquist, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+engineering+of+primary+CD4%2B+T+cells+for+the+interrogation+of+HIV-host+factor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.</a> Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm revelações.

Aqui descrevemos abordagens para editar células CAR-T de genes usando a tecnologia CRISPR Cas9 e fabricar produtos para testar melhor a função e eficácia. O protocolo acima foi otimizado para a realização da edição de genes CRIPSR em células T humanas primárias combinadas com células T de engenharia com receptores de antígeno quimérico. Este protocolo permite alta eficiência de nocaute com variabilidade mínima de doador para doador. A modificação usando CRISPR pode melhorar tanto a eficácia quanto a segurança das células...

A terapia celular quimérico de antígeno (CAR)-T revolucionou o campo das terapias celulares adotivas e da imunoterapia contra o câncer. As células CAR-T são células T projetadas expressando um receptor imunológico sintético que combina um fragmento de anticorpo de cadeia única específico de antígeno com domínios de sinalização derivados da cadeia TCRzeta e domínios costimulatórios necessários e suficientes para ativação e co-estimulação de células T1,2,3,4 . A fabricação de células CAR-T começa extraindo as próprias células T do paciente, seguida pela transdução viral ex vivo do módulo CAR e expansão do produto celular CAR-T com contas magnéticas que funcionam como antígenos artificiais apresentando células5. As células CAR-T expandidas são reinfundidas no paciente onde podem engrafar, eliminar células tumorais alvo e até persistir por vários anos após a infusão6,7,8. Embora a terapia celular CAR-T tenha resultado em taxas notáveis de resposta em malignidades de células B, o sucesso clínico para tumores sólidos tem sido desafiado por múltiplos fatores, incluindo a má infiltração de células T9,um microambiente tumoral imunossupressor10,cobertura e especificidade de antígenos, e disfunção celular CAR-T11,12 . Outra limitação da terapia celular CAR-T atual inclui o uso de células T autólogas. Após várias rodadas de quimioterapia e alta carga tumoral, as células CAR-T podem ser de má qualidade em comparação com produtos CAR-T aogeneicos de doadores saudáveis, além do tempo e despesas associados à fabricação de células CAR-T autólogas. A edição de genes do produto car-t por CRISPR/Cas9 representa uma nova estratégia para superar as limitações atuais das células CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 é um sistema de dois componentes que pode ser usado para edição de genomas direcionados em células de mamíferos18,19. O Endonuclease Cas9 associado ao CRISPR pode induzir quebras de dois fios específicas do local guiadas por pequenos RNAs através do emparelhamento de base com a sequência de DNAalvo 20. Na ausência de um modelo de reparo, as quebras de dois fios são reparadas pela via de junção final nonhomologous propensa a erros (NHEJ), resultando em mutações de mudança de quadro ou codons de parada prematura através de mutações de inserção e exclusão (INDELs)19,20,21. Eficiência, facilidade de uso, custo-efetividade e a capacidade de edição de genoma multiplex fazem do CRISPR/Cas9 uma ferramenta poderosa para aumentar a eficácia e a segurança das células CAR-T autólogas e aogenéticas. Essa abordagem também pode ser usada para editar células T direcionadas tcr substituindo a construção do CAR por um TCR. Além disso, células CAR-T aogenéticas que têm potencial limitado para causar enxerto versus doença hospedeira também podem ser geradas pela edição de genes do lócus TCR, b2m e HLA.
Neste protocolo, mostramos como a engenharia CRISPR de células T pode ser combinada com a entrega mediada por vetores virais do CAR-Transgene para gerar produtos celulares CAR-T editados por genoma com maior eficácia e segurança. Um diagrama esquemático de todo o processo é mostrado na Figura 1. Usando essa abordagem, demonstramos um nocaute genético de alta eficiência nas células CAR-T humanas primárias. A Figura 2A descreve em detalhes a linha do tempo de cada etapa para edição e fabricação de células T. Estratégias para o design de RNA guia e validação de nocaute também são discutidas para aplicar essa abordagem a vários genes-alvo.

<table><tbody><tr><td>Unidade central 4D-nucleofator</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofator X-Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Accuprime Pfx Supermix</td><td>ThermoFisher</td><td>12344040</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima XPN ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anticorpo CD3</td><td>Biolegend</td><td>317322</td><td>Clone OKT3</td></tr><tr><td>BV711 Anti-humano PD1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone EH12.2H7</td></tr><tr><td>Cas9-Intensificadores de eletroporação</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>CD3 / CD28 Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CD4 + Kit de isolamento de células T</td><td>StemCell technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CD8 + Kit de isolamento de células T</td><td>StemCell technologies</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>Filtro/garrafa de vácuo Corning 0.45 micron</td><td>Corning</td><td>430768</td><td></td></tr><tr><td>Corning T150 frasco de cultura de células</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNAeasy Kit de Sangue e Tecido</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento</td> <td>GlutamaxThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>células HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>para IL-15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>para IL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel e PCR</td><td>Takara</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>P3 Célula primária 4D-nucleofator X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>expressão de pTRPE Plasmídeo</td><td>em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv, (R19M), PE</td><td>CytoArt</td><td>200105</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>ThermoFisher</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spy Fi Cas9</td><td>Aldevron</td><td>9214</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de embalagem viral</td><td>em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo-15 Media</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de células car-t projetadas por crispr humanas

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Terapias celulares adotivas usando células T do receptor de antígeno quimérico (células CAR-T) demonstraram notável eficácia clínica em pacientes com malignidades hematológicas e estão atualmente sendo investigadas para vários tumores sólidos. As células CAR-T são geradas removendo células T do sangue de um paciente e projetando-as para expressar um receptor imunológico sintético que redireciona as células T para reconhecer e eliminar células tumorais alvo. A edição de genes das células CAR-T tem o potencial de melhorar a segurança das terapias atuais de células CAR-T e aumentar ainda mais a eficácia das células CAR-T. Aqui, descrevemos métodos para ativação, expansão e caracterização de células CAR-T direcionadas por CRISPR. Isso compreende a transdução do vetor lentiviral CAR e o uso de RNA guia único (sgRNA) e Cas9 endonuclease para atingir genes de interesse em células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser universalmente aplicados a outras construções car e genes-alvo além dos utilizados neste estudo. Além disso, este protocolo discute estratégias para o design de gRNA, seleção de gRNA de chumbo e validação de genes-alvo para alcançar de forma reproduibivelmente alta eficiência, engenharia multiplex CRISPR-Cas9 de células T humanas de grau clínico.

Descrevemos aqui um protocolo para criar geneticamente células T, que podem ser usadas para gerar células CAR-T autólogas e aogenéricas, bem como células T redirecionadas T.
A Figura 1 fornece uma descrição detalhada das etapas envolvidas no processo de fabricação de células T editadas pelo CRISPR. O processo começa projetando sgRNA para o gene de interesse. Uma vez que o sgRNA é projetado e sintetizado, eles são então usados para fazer complexos RNP com a proteín...

Aqui, apresentamos um protocolo para edição de genes em células T humanas primárias usando a tecnologia CRISPR Cas para modificar células CAR-T.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Nosso protocolo de laboratório permite a combinação de edição de genoma humano com terapia celular CAR T. O procedimento laboratorial é a abordagem com o CRISPR-Cas9 para atingir até três genes com alta eficiência. E, finalmente, nossa abordagem é capaz de ser traduzida em testes clínicos em humanos.Os métodos descritos podem ser aplicados a outras construções car e genes de destino. A base das técnicas são robustas o suficiente para serem traduzidas para maior escala e para colaboradores acadêmicos e industriais para o desenvolvimento posterior. Ao tentar este protocolo pela primeira vez, limite o número de grupos na tela RNA guia para permitir tempos precisos de incubação.Aderindo às condições culturais e à densidade de semeaduras como descrito, provaram ser críticos em nossa experiência. Para começar, obtenha células mononucleares de sangue periféricos autólogos, ou PBMCs, de doadores voluntários saudáveis e isole células T positivas CD4 e CD8 usando kits de seleção cd4 e CD8 disponíveis comercialmente. Combine células T positivas cd4 e CD8 em uma proporção de um para um e incubar 3 milhões de células por mililitro em R10, complementados com 5 nanogramas por mililitro de cada IL7 humano e IL15 humano durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, conte as células T e centrífugas de 5 a 10 milhões de células a 300 vezes G durante cinco minutos. Descarte todos os supernascedores e lave a pelota celular em uma mídia essencial mínima de soro reduzido. Suspenda a pelota em 100 microliters de solução de afeto nuclear de acordo com as instruções do fabricante.Durante a lavagem das células, prepare uma ribonucleoproteína, ou complexo RNP, incubando 10 microgramas de nuclease Cas9 com 5 microgramas de RNA guia único por 10 minutos à temperatura ambiente. Inclua um controle simulado sem RNA de guia único. Combine as células re-suspensas com o complexo RNP e adicione 4,2 microliters de quatro aprimoradores de eletroporação micromolar.Misture bem e transfira para cuvetas de eletroporação. Eletroporar as células usando o código de pulso EH111, em seguida, incubar 5 milhões de células por mililitro em R10, complementado com 5 nanogramas por mililitro humano IL7 e IL15 humano a 30 graus Celsius por 48 horas em 12 placas de poço. Após a incubação, prossiga com ativação e expansão de células T.Projete os primers de sequenciamento inserindo a sequência da amplicon PCR em um software de design primer padrão. O software de design sugerirá várias sequências de primer adequadas para sequenciamento Sanger. Escolha primers para frente e reverso que se unam com o amplicon pelo menos 150 pares de base rio acima ou rio abaixo do local de corte gRNA para garantir uma boa qualidade de sequenciamento em torno dos indels.Use a análise TIDE para detectar a eficiência do nocaute no nível genômico. O algoritmo reconstrói com precisão o espectro de indels a partir dos traços de sequência e calcula os valores quadrados R. Após a ativação, as células T são expandidas na cultura e criopreservadas para estudos futuros.Durante a expansão, a duplicação populacional e as mudanças de volume são acompanhadas ao longo do protocolo tanto para células CAR T simuladas quanto editadas. Não foram detectadas alterações significativas na proliferação e ativação durante a expansão. Uma vez que as células foram criopreservadas, os níveis de expressão CAR foram determinados para estudos funcionais adicionais tanto para as células CAR T simuladas e knockout.Não foram observadas alterações significativas. A eficiência do nocaute pode ser determinada usando múltiplas técnicas. Nestes gráficos representativos de citometria de fluxo, os locis PDCD1 e TRAC foram direcionados usando RNA de guia único, mostrando uma eficiência de 90% para o RNA guia único PDCD1 e 98% para o TRAC guia único RNA em vários doadores saudáveis.É importante ter certeza de que as relações molares de Cas9 e guiar RNAs são precisas. Durante o procedimento, as células devem ser sempre mantidas a quatro graus Celsius e não serem deixadas na solução de eletroporação por longos períodos de tempo. Após a preservação do CAR, as células CAR T projetadas pelo CRISPR podem ser usadas para ensaios funcionais in vitro e in vivo, como ensaios de citotoxicidade, produção de citocinas e modelos de camundongos tumorais sintéticos ou xenógrafos.Nossa abordagem usando a tecnologia CRISPR Cas9 está sendo aplicada a testes clínicos. A abordagem pode ser usada tanto para o câncer, quanto para uma doença genética não maligna, como hemoglobinofias, que afetam milhões de crianças e adultos em todo o mundo.

production-of-human-crispr-engineered-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O vídeo descreve um processo para criar células CAR T geneticamente modificadas por meio do Sistema CRISPR-Cas9. Infectar células T com lentivírus CRISPR e CAR resulta em modificações no gene alvo e na síntese de um receptor de antígeno quimérico ou CAR, levando à formação de células T CAR geneticamente modificadas.

Células T CAR geneticamente modificadas usando um sistema CRISPR-Cas9

Este vídeo demonstra um ensaio para realizar a edição de genes em células T humanas usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Uma mistura de células T CD4+ e CD8+ primárias é combinada com um complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, visando genes específicos para nocaute. Após a eletroporação, o sgRNA guia Cas9 para a sequência de DNA alvo, criando cortes precisos. Esses cortes são então reparados pelo mecanismo de junção final não homólogo da célula, levando ao nocaute do gene.

Uma técnica CRISPR-Cas9 para edição de genes em células T

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno por meio de transdução retroviral. As células T CD8+ murinas ativadas são adicionadas a uma placa de micropoços revestida com fragmentos de fibronectina recombinante. Vetores retrovirais contendo RNA transgênico que codifica um receptor de antígeno quimérico específico do antígeno (CAR) são então introduzidos e a placa é centrifugada para facilitar a transdução. Após a incubação,...

Uma técnica para a geração de células T CAR específicas para antígenos

As células T que expressam um receptor CD19 específico de antigénio quimérico (CAR) são infundidos como tratamento experimental de células B malignas nos nossos primeiro-em-humanos, os ensaios de terapia génica. Descrevemos a modificação genética das células T utilizando...

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

Os efeitos linfodepletivos e imunomoduladores do padrão de tratamento da quimioterapia e radiação podem ser aproveitados para aumentar a eficácia antitumoral da imunoterapia com células T. Descrevemos um método para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas do EGFRvIII e administrá-las no contexto do tratamento padrão de glioblastoma.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

Aqui, apresentamos um protocolo para editar geneticamente as células CAR-T através de um sistema CRISPR/Cas9.

Usando CRISPR/Cas9 para knock out GM-CSF em células CAR-T

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Um protocolo detalhado é fornecido para o uso da tecnologia CRISPR / Cas9 para obter knock-in direcionado altamente eficiente de grandes construções multicistrônicas em células T humanas primárias por meio da via de reparo de DNA de junção de extremidade mediada por homologia (HMEJ). As células T projetadas com este protocolo adaptável ao cGMP mantêm excelente expansão celular, citotoxicidade e produção de citocinas.

Engenharia não viral de células T humanas primárias por meio de integração direcionada de junção de extremidade mediada por homologia de grandes modelos de DNA

Este protocolo descreve as etapas essenciais para o cultivo das células T primárias, incluindo seu isolamento, ativação, expansão e transfecção transitória por eletroporação de mRNA. Além disso, é proposto um fluxo de trabalho e um painel de anticorpos para análise citométrica de fluxo do fenótipo, marcadores de ativação, viabilidade e expressão do receptor de antígeno quimérico (CAR).

Isolamento, cultivo e transfecção transitória de células T humanas primárias para gerar células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)

Aprenda a produzir células CAR-T humanas editadas por CRISPR-Cas9 com alta eficiência. Este protocolo robusto permite edição multiplex de genes e facilita aplicações clínicas em imunoterapia contra câncer.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Explorar mais vídeos