Name: Gerenciamento Avançado do Ritmo Cardíaco Aplicando Fotoestimulação Optogenética Multi-Site em Corações Murinos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a controlar arritmias cardíacas em corações murinos usando fotoestimulação optogenética com matriz de micro-LEDs. Este método permite ajustar parâmetros de pulso e área iluminada para terminar taquiarritmias de forma mais segura que a desfibrilação elétrica convencional.

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Os autores gostariam de agradecer a Marion Kunze e Tina Althaus por seu excelente suporte técnico durante os experimentos. A investigação que conduziu aos resultados recebeu financiamento do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia FP7/2007-2013 ao abrigo da convenção de subvenção número HEALTH-F2-2009-241526. O apoio também foi fornecido pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular, DZHK e.V. (Projeto MD28), site parceiro Goettingen, a Fundação Alemã de Pesquisa CRC 1002 (projeto C03) e a Sociedade Max Planck. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG, número de concessão EXC 1086).

Todos os experimentos seguiram estritamente o regulamento de bem-estar animal, de acordo com a legislação alemã, as estipulações locais e de acordo com as recomendações da Federação das Associações Europeias de Zootecnia de Laboratório (FELASA). O pedido de aprovação de experiências em animais foi aprovado pela autoridade responsável pelo bem-estar animal e todas as experiências foram comunicadas aos nossos representantes em matéria de bem-estar animal.
1. Preparação e materiais da experiência
<ol><li>Configuração de mapeamento óptico NOTA: A configuração óptica, bem como a configuração elétrica, são mostradas na Figura 1. Todos os componentes utilizados na configuração óptica e elétrica estão listados em detalhes na Tabela de Materiais.<ol><li>Use LED 1 e LED 2 para indução de arritmia e desfibrilação de backup. Escolha LEDs de alta potência com um comprimento de onda λazul perto de 475 nm, que é o pico do comprimento de onda de excitação de ChR26. Para estreitar ainda mais o espectro óptico, use um filtro passa-banda de 470 ± 20 nm. NOTA: Neste trabalho, o LED 1 e o LED 2 têm um fluxo radiante típico de 3,9 a 5,3 W, de acordo com a ficha técnica20.</li>
		<li>Ilumine o epicárdio para mapeamento óptico com um LED vermelho de alta potência (LED 3 na Figura 1), que emite luz com um comprimento de onda central de λvermelho = 625 nm e um fluxo radiante de 700 mW21. A luz vermelha é filtrada com um filtro passa-banda de 628 ± 20 nm e refletida por um espelho dicroico de passagem longa (DM) com um comprimento de onda de corte de λDM = 685 nm.</li>
		<li>Use um filtro de emissão com λfilter-cam = 775 ± 70 nm na frente da objetiva da câmera para registrar apenas a emissão de fluorescência da atividade cardíaca. Use um objetivo rápido que seja adequado para aplicações com pouca luz. NOTA: A frequência de fibrilação de um coração de rato varia de 20 a 35 Hz; portanto, use uma câmera rápida o suficiente para gravar com uma frequência de 1 a 2 kHz, ou até mais.</li>
	</ol></li>
	<li>Matriz de micro-LED NOTA: As matrizes de micro-LED aplicadas aqui são realizadas usando o processamento de microssistemas, conforme detalhado em outro lugar16,17.<ol><li>Gire uma camada de poliimida (PI) de 5 μm de espessura sobre substratos de silício de 4 polegadas (polido de lado único, 525 μm de espessura).</li>
		<li>Curar esta camada PI a uma temperatura máxima de 450 °C sob uma atmosfera de azoto. Mantenha a temperatura máxima constante por 10 min.</li>
		<li>Depositar e padronizar um fotorresistente de reversão de imagem (PR) usando litografia ultravioleta (UV) e depósito de sputter uma fina camada de platina (Pt) de 250 nm.</li>
		<li>Engrosse esta metalização à base de Pt galvanizando uma camada de ouro (Au) de 1 μm de espessura com o PR padronizado servindo como uma camada de mascaramento.</li>
		<li>Antes de revestir uma segunda camada PI, exponha a bolacha com sua primeira camada PI e a metalização galvanizada por Au a um plasma de oxigênio que ativa quimicamente a superfície da camada PI.</li>
		<li>Cure a segunda camada PI novamente a 450 °C, aplique litografia UV para padronizar uma camada PR e abra as almofadas de contato da matriz para os chips micro-LED e a placa de circuito impresso (PCB) de interface por gravação de íons reativos (RIE) usando o PR padronizado como uma camada de mascaramento. NOTA: Nesta etapa do processo RIE, recomenda-se aplicar 200 W e 100 W por 10 e 30 min, respectivamente, para definir as aberturas da almofada de contato, bem como a forma externa da matriz de micro-LED bidimensional (2D).</li>
		<li>Retire o PR usando solventes e gravura a plasma. Engrosse ainda mais as almofadas de contato galvanizando uma camada de ouro adicional de 6 μm de espessura.</li>
		<li>Conecte os chips micro-LED às almofadas de contato usando um colador flip-chip.</li>
		<li>Ative a superfície PI em um plasma de oxigênio e preencha os chips micro-LED com um adesivo sem solvente. Cura, em seguida, o adesivo durante 12 h a 120 °C.</li>
		<li>Para encapsular os chips micro-LED, execute outro tratamento de plasma com argônio e aplique uma fina camada de fluoropolímero manualmente. Pré-curar esta camada a 80 °C durante 1 h.</li>
		<li>Aplique manualmente o silicone como a camada de encapsulamento final depois de expor a matriz de micro-LED a um plasma de oxigênio, usado para melhorar a adesão do silício à camada subjacente de fluoropolímero. Curar a camada de silicone a 80 °C e 180 °C durante 1 h cada. Essas etapas finais de cura também curam completamente a camada de fluoropolímero.</li>
		<li>Solde as almofadas de contato do substrato PI a uma placa de circuito impresso que transporta conectores de tira para interconexão da matriz a uma instrumentação externa. Cubra as almofadas de solda na PCB usando um adesivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração elétrica<ol><li>Use eletrodos adequados para registrar um eletrocardiograma (ECG), por exemplo, eletrodos de prata/cloreto de prata ou eletrodos de Potencial de Ação Monofásica (MAP) e um amplificador de ECG para monitorar a atividade elétrica do coração continuamente. Além disso, use um dispositivo de aquisição (DA) apropriado para registrar todos os sinais elétricos obtidos.</li>
		<li>Escolha um driver adequado para os LEDs de alta potência (LED 1, LED 2 e LED 3), que possa gerenciar a corrente máxima aplicada a cada dispositivo. Use um gerador de função arbitrária (AFG) para controlar a saída dos drivers LED com precisão.</li>
		<li>Use um driver de LED multicanal para controlar a corrente que flui através da matriz de micro-LED. Um AFG com várias saídas também é adequado para essa tarefa. NOTA: É aconselhável escolher drivers LED limitando a corrente à corrente máxima do micro-LED, caso contrário, os diodos podem ficar danificados. Um exemplo de um driver micro-LED multicanal é descrito em outro trabalho18. Se necessário, o AFG ou qualquer outro driver de LED pode estar conectado a um computador para controlar remotamente as configurações de micro-LED. Se este for o caso, conecte o driver LED ao computador com o protocolo de comunicação de sua escolha, por exemplo, GPIB (General Purpose Interface Bus) ou uma conexão serial.</li>
	</ol></li>
</ol>   

2. Procedimentos experimentais
<ol><li>Preparação da solução<ol><li>Preparar a solução da Tyrode: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH2 PO4, 5,6 mM de glicose, 0,1% BSA/Albumina.</li>
		<li>Prepare a solução Low-K+ Tyrode: Low-K+ Tyrode's é feita da mesma forma que a solução Tyrode's regular, exceto que apenas metade da quantidade de KCl é adicionada (2 mM em vez de 4 mM KCl). NOTA: Para um experimento com duração de 3 h geralmente 2-3 L de Tyrode Low-K+ (adicionalmente misturado com Blebistatina (Passo 2.1.5) se o mapeamento óptico for realizado) e 1-2 L de Tyrode regular são suficientes.</li>
		<li>Adicionar Pinacidil à solução de Low-K+ Tyrode para facilitar o processo de indução de arritmia, conforme descrito em22, para obter uma concentração de 100 mM. Use luvas de laboratório protetoras ao manusear Pinacidil.</li>
		<li>Preparar 1 ml de 50 μM DI-4-ANBDQPQ com a solução regular de Tyrode. Proteja o corante da luz para evitar o fotobranqueamento.</li>
		<li>Faça uma solução de estoque de 10 mM de Blebbistatin. Para o mapeamento óptico, misturar a Blebistatina com a solução de Pinacidil-Tirode a 100 mM (Passo 2.1.3) para obter uma solução de 5 μM. Use luvas de laboratório protetoras ao manusear Blebbistatin. NOTA: Mantenha o corante e a solução de Blebistatina de lado até que o mapeamento óptico comece.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusão Langendorff NOTA: A configuração consiste em dois reservatórios para as duas soluções da Tyrode. Eles são conectados a uma armadilha de bolhas através de tubos com galos de três vias. O coração é posteriormente anexado à armadilha de bolhas por um conector de bloqueio Luer, e é então suspenso em um banho de água hexagonal. O banho-maria é, por sua vez, ligado a um contentor de resíduos para recolher a solução utilizada da Tyrode.<ol><li>Limpe todos os tubos antes de cada experimento com água totalmente desmineralizada.</li>
		<li>Arejar ambas as soluções da Tyrode com Carbogen (5% de CO 2 e 95% de O2) por 30 min à temperatura ambiente antes do início do experimento. Ajustar o valor de pH das soluções de Tyrode para 7,4 com NaOH.</li>
		<li>Encha 500 ml de cada solução de Tyrode no reservatório correspondente e desaregue os tubos, bem como a armadilha de bolhas, executando a solução de Tyrode através do sistema de perfusão até que não sejam mais vistas bolhas de ar presas nos tubos ou na armadilha de bolhas.</li>
		<li>Continue arejando as soluções de Tyrode durante todo o experimento nos reservatórios com Carbogen para garantir que o pH do perfusato permaneça estável mais tarde durante a perfusão.</li>
		<li>Aqueça o sistema de perfusão a 37 °C com uma bomba de calor de água. Mantenha a temperatura do perfusato constante dentro do banho-maria usando um elemento de aquecimento adicional, como um cabo de aquecimento à prova d'água. NOTA: Durante o experimento, é crucial reabastecer os reservatórios do Tyrodes antes que eles fiquem vazios. Caso contrário, as bolhas de ar podem entrar no coração, o que pode entupir os vasos e levar à isquemia.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do mouse<ol><li>Injetar por via subcutânea 0,1 mL de 500 I.E. Heparina 30 min antes do procedimento de isolamento cardíaco.</li>
		<li>Encha uma placa de Petri de 6 cm e uma seringa de 2 ml com solução de Tyrode gelada. Coloque sob o microscópio estereoscópico.</li>
		<li>Realizar anestesia de curto prazo de camundongos por um ambiente saturado de isoflurano por 2 min e luxação cervical imediata depois. NOTA: A fim de verificar anestesia suficiente, uma verificação para o reflexo negativo entre os dedos do pé é absolutamente necessária.</li>
		<li>Abra o peito, retire o coração, como descrito em outro lugar23, e coloque-o na placa de Petri de 6 cm com solução gelada de Tyrode. O batimento cardíaco será diminuído devido à queda de temperatura.</li>
		<li>Faça a preparação fina sob um microscópio estereoscópico, conforme detalhado em outro lugar23. Prenda a aorta na agulha contundente e fixe o vaso com material de sutura.</li>
		<li>Como controlo, injete a solução de Tyrode gelada através da agulha no coração e verifique se o coração está bem montado. Este passo também enxagua o sangue restante para fora do coração.</li>
		<li>Transfira o coração montado para o sistema de perfusão. Certifique-se de que o perfusato está fluindo para evitar que o ar entre no coração enquanto conecta a agulha com a armadilha de bolhas. Verifique se o coração está coberto com a solução de Tyrode's no banho de água. As etapas 2.3.4, 2.3.5 e 2.3.7 são ilustradas na Figura 2.</li>
		<li>Certifique-se de que o coração comece a bater dentro de alguns minutos. Deixe o coração adaptar-se à configuração de perfusão durante 15 a 20 minutos e, em seguida, mude para a solução de Tyrode de baixo K + com Pinacidil (Passo 2.1.3) respetivamente solução de Tyrode de baixo K + com Pinacidil e Blebistatina (Passo 2.1.5) se o mapeamento óptico for para ser realizado.</li>
	</ol></li>
	<li>Indução de arritmia e desfibrilação óptica<ol><li>Coloque um dos eletrodos de ECG o mais próximo possível da superfície do coração para garantir uma boa qualidade de sinal. Suspender o segundo eléctrodo de ECG na solução de Tyrode. Certifique-se de que o ECG adquirido está sendo registrado pelo DA de escolha.</li>
		<li>Coloque a matriz micro-LED na área de interesse do estudo, por exemplo, no ventrículo esquerdo.</li>
		<li>Mude a perfusão para Tyrode's low-K+ com Pinacidil e perfunda o coração por 15 a 30 min.</li>
		<li>Para induzir arritmia, ilumine o coração com LED 1 e LED 2 com um trem de 20 a 50 pulsos de luz com uma frequência f ind de 25 a 35 Hz, duração do pulso Wind de 2 a 15 ms, e intensidade de luz LIopt_ind de 2,8 mW mm-2.</li>
		<li>Repita o processo até que a arritmia seja induzida. NOTA: As arritmias são fáceis de identificar no sinal de ECG porque a frequência e a morfologia do sinal diferem do ritmo sinusal normal. Se a arritmia terminar dentro dos próximos 5 s, classifique-a como auto-terminada e inicie uma nova tentativa de indução.</li>
		<li>Uma vez que uma arritmia sustentada é detectada visualmente, aplique uma explosão de pulsos com diferentes larguras W def e frequências fdef, usando três, seis ou nove micro-LEDs da matriz a umpulso de corrente pulsante I de 15 mA cedendo a uma intensidade de luz LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2.</li>
		<li>Se a arritmia continuar após cinco ensaios de desfibrilação baseados em matriz de micro-LED, classifique a tentativa como malsucedida e inicie a desfibrilação de backup.</li>
		<li>Para desfibrilação de backup, use o LED 1 e o LED 2 usando os mesmos parâmetros de temporização definidos para a matriz de micro-LED. NOTA: Como o coração é exposto ao estresse isquêmico e metabólico durante todo o período experimental, é possível que as tentativas de terminação da arritmia não sejam bem-sucedidas, mesmo com a desfibrilação de backup. Sempre que isso acontecer, mude a solução de perfusão para o Tyrode regular e deixe o coração se recuperar por 5 a 10 minutos. Quando o ECG retornar ao ritmo sinusal, repita o protocolo da Etapa 2.4.3 novamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Mapeamento óptico<ol><li>Perfundir o coração com a solução de Blebistatina preparada na Etapa 2.1.5 e aguardar até que ocorra o desacoplamento mecânico. Isso é realizado quando o coração para de bater, mas um sinal de ECG ainda é mensurável. NOTA: A mistura da solução de Blebistatina à concentração mencionada e a manutenção do coração perfundido com esta solução mantêm a atividade mecânica cardíaca desacoplada da atividade elétrica durante todo o experimento.</li>
		<li>Dê o corante de tensão de 1 mL DI-4-ANBDQPQ (preparado na Etapa 2.1.4) como um bolus na armadilha de bolhas da perfusão de Langendorff. Aguarde de 5 a 10 minutos para permitir que o corante perfunda o coração uniformemente. NOTA: Evite o fotobranqueamento do corante desligando a luz vermelha sempre que nenhuma gravação estiver sendo feita. Se a relação sinal-ruído da gravação se tornar muito pequena (o sinal adquirido é muito ruidoso), repita as etapas 2.1.4 e 2.5.2.</li>
		<li>Foque a câmera na superfície do coração, ligue o LED 3 e aplique energia óptica de 1,27 mW mm-2 .</li>
		<li>Desligue as luzes do laboratório e comece a gravar. Certifique-se de que um sinal óptico está sendo adquirido comparando a frequência do sinal obtido com a frequência do ECG gravado. Isso garante que o sinal óptico obtido esteja puramente relacionado à atividade elétrica do coração. NOTA: Como a luz de fluorescência emitida pelo corante é muito semanal, o mapeamento óptico é feito em uma sala escura. Isso evita a interferência de sinal de quaisquer outras fontes de luz.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram qualquer conflito de interesses.

Um tratamento bem-sucedido das taquiarritmias cardíacas é fundamental para a terapia cardíaca. No entanto, os mecanismos biofísicos subjacentes ao início, perpetuação e término da arritmia não são totalmente compreendidos. Portanto, a pesquisa cardíaca visa otimizar a terapia de choque elétrico para uma terminação mais suave das arritmias, aumentando assim a qualidade de vida dos pacientes 28,29,30,31.<sup class="xref...

Investigações iniciais da dinâmica espaço-temporal durante a arritmia revelaram que os complexos padrões elétricos durante a fibrilação cardíaca são impulsionados por ondas de excitação rotativas semelhantes a vórtices1. Esse achado deu novos insights sobre os mecanismos subjacentes das arritmias, o que levou ao desenvolvimento de novas terapias de terminação elétrica baseadas na excitação multissítio do miocárdio 2,3,4. No entanto, os tratamentos que utilizam estimulação elétrica de campo não são locais e podem inervar todas as células excitáveis circundantes, incluindo o tecido muscular, causando danos celulares e teciduais, bem como dor intolerável. Em contraste com as terapias elétricas, as abordagens optogenéticas fornecem uma técnica específica e protetora dos tecidos para evocar potenciais de ação de cardiomiócitos com alta precisão espacial e temporal. Portanto, a estimulação optogenética tem o potencial de controle invasivo mínimo dos padrões de ativação caótica durante a fibrilação cardíaca.
A introdução do canal iônico sensível à luz canalrodopsina-2 (ChR2) em células excitáveis via manipulação genética 5,6,7, possibilitou a despolarização do potencial de membrana de células excitáveis por meio da fotoestimulação. Várias aplicações médicas, incluindo a ativação de redes neuronais, o controle da atividade cardíaca, a restauração da visão e da audição, o tratamento de lesões medulares e outras 8,9,10,11,12,13,14 têm sido desenvolvidas. A aplicação da ChR2 em cardiologia tem potencial significativo devido ao seu tempo de resposta de milissegundos15, tornando-a adequada para o controle direcionado da dinâmica cardíaca arrítmica.
Neste estudo, a fotoestimulação multi-local de corações intactos de um modelo de rato transgênico é mostrada. Em resumo, foi criada uma linha de ratinhos alfa-MHC-ChR2 transgénicos no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) e gentilmente fornecida pelo Prof. S. E. Lehnart. Em geral, machos adultos transgênicos C57/B6/J, expressando Cre-recombinase sob controle de alfa-MHC foram pareados para acasalar com fêmeas B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Como o STOP cardíaco foi apagado na segunda geração, a prole apresentou expressão estável de MHC-ChR2 e foi utilizada para manter colônias fotossensíveis cardíacas. Todos os experimentos foram feitos com camundongos adultos de ambos os sexos com uma idade de 36 a 48 semanas. A iluminação é obtida usando uma matriz de micro-LED 3 x 3, fabricada conforme descrito em16,17, exceto que o invólucro à base de silício e as fibras de vidro ópticas curtas não são implementados. Seu primeiro uso em uma aplicação cardíaca é encontrado em18. Uma matriz linear de micro-LED baseada em uma tecnologia de fabricação semelhante foi aplicada como uma sonda penetrante para o ritmo cardíaco19. Os micro-LEDs são dispostos em uma matriz 3 x 3 a um passo de 550 μm, proporcionando uma alta resolução espacial e uma alta potência radiante em uma área muito pequena. Os autores demonstram neste trabalho uma fotoestimulação multissítio local versátil que pode abrir caminho para o desenvolvimento de novos métodos de terapia antiarrítmica.
O protocolo experimental a seguir envolve uma perfusão retrógrada de Langendorff ex vivo, para a qual a aorta canulada funciona como entrada de perfusão. Devido à pressão de perfusão aplicada e à contração cardíaca, o perfusato está fluindo através das artérias coronárias, que se ramificam da aorta. No trabalho apresentado, o coração é perfundido utilizando-se uma configuração de pressão constante alcançada pela elevação dos reservatórios de perfusato a 1 m de altura, equivalente a 73,2 mmHg, o que resulta em uma vazão de 2,633 ± 0,583 mL/min. Dois tipos de solução de Tyrode's são usados como perfusato durante o experimento. A solução de Tyrode regular suporta um ritmo sinusal estável, enquanto a solução de Tyrode Low-K+ é misturada com Pinacidil para permitir a indução de arritmia em corações murinos. O uso de um banho-maria hexagonal permite a observação do coração através de seis janelas planares diferentes, permitindo o acoplamento de vários componentes ópticos com menor distorção por refração.

<table><tbody><tr><td>Componentes químicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blebbitatina</td><td>TargetMol</td><td>T6038</td><td>10 mM solução estoque</td></tr><tr><td>BSA/Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Westfalen</td><td></td><td>50 l garrafa</td></tr><tr><td>DI-4-ANBDQPQ</td><td>AAT Bioquest</td><td>21499</td><td>Corante para Mapeamento Óptico</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>LEO Pharma</td><td></td><td>Heparina-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, disponível apenas mediante receita médica</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck</td><td>1.09057.1000</td><td>HCl, solução estoque 1 M</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>CP Pharma</td><td></td><td>1 ml/ml, disponível apenas mediante receita médica</td></tr><tr><td>Magnésio Cloreto</td><td>Merck</td><td>8.14733.0500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Fosfato monopotássico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30407</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Pinacidil monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P154-500mg</td><td>10 mM solução estoque</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Sódio Cloreto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>NaOH, solução de estoque de 1 M</td></tr><tr><td>Configuração</td><td></td><td></td><td></td>elétrica</tr><tr><td>Biopac MP150</td><td>Biopac Systems</td><td>Sistema de</td><td>aquisição e análise de dados</td>MP150WSW</tr><tr><td>ECG personalizado, alternativa ECG100C</td><td>Biopac Systems</td><td>ECG100C</td><td>Amplificador de eletrocardiograma</td></tr><tr><td>Aquecedor de banho-maria personalizado com cabo de aquecimento</td><td>Sistema de aquecimento RMS</td><td>HK-5,0-12</td><td>Cabo de aquecimento 120W</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td>hexagonal</tr><tr><td>Driver LED Fonte de alimentação</td><td>Thorlabs</td><td>KPS101</td><td>15 V, 2,4 A Fonte de alimentação com conector Jack de 3,5 mm para um cubo K ou T.</td></tr><tr><td>Driver LED LEDD1B</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>T-Cube LED Driver, Corrente de Acionamento Máxima 1200 mA</td></tr><tr><td>MAP, Eletrodo de ECG</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>BS4&nbsp; 73-0200</td><td>Eletrodo Mini-ECG para corações isolados</td></tr><tr><td>micro-LED Driver, por exemplo, AFG</td><td>Agilent Instruments</td><td>A-2230</td><td>Gerador de função arbitrária (AFG)</td></tr><tr><td>Gerador de sinal</td><td>Agilent Instruments</td><td>A-2230</td><td>AFG</td></tr><tr><td>micro-LED Componentes</td><td></td><td></td><td></td>de matriz</tr><tr><td>Cola epóxi</td><td>Tecnologia epóxi</td><td>EPO-TEK 353ND</td><td>Epóxi</td></tr> <tr><td>de dois componentesFluoropolímero</td><td>&nbsp; Fornecedor:Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>Cytop 809M</td><td>Fluoropolímero com alta transparência</td></tr><tr><td>Reversão de imagem fotorresistente</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ 5214E</td><td>Resistência à Reversão de Imagem para chip LED de Alta Resolução</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Cree Inc.</td><td>C460TR2227-S2100</td><td>Micro-LED azul</td></tr><tr><td>fotorresiste</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ 9260</td><td>fotorresiste positivo espesso</td></tr><tr><td>poliimida</td><td>UBE Industries Ltd.</td><td>U-Verniz S</td><td>Solução de Poliimida</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>NuSil Technology LLC</td><td>MED-6215</td><td>Elastômero de silicone de baixa viscosidade</td></tr><tr><td>Adesivo sem solvente</td><td>John P. Kummer GmbH</td><td>Epo-Tek 301-2</td><td>Resina epóxi com baixa viscosidade</td></tr><tr><td>Mapeamento óptico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro azul</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td>ET470 / 40x</td><td>Filtro</td></tr> <tr>de excitação azul<td>Câmera</td><td>Photometrics</td><td>Cascade 128+</td><td>Câmera EMCCD de alto desempenho</td></tr><tr><td>Objetiva</td><td>de Câmera Navitar</td><td>DO-5095</td> As <td>lentes de alta velocidade de distância focal fixa Navitar funcionam com câmeras CCD e CMOS</td></tr><tr><td>Espelho Dicróico</td><td>Semrock</td><td>FF685-Di02-25x36</td><td>685 nm edge BrightLine&reg; divisor de feixe dicróico epi-fluorescência padrão de borda única</td></tr><tr><td>Filtro de Emmissão</td><td>Semrock</td><td>FF01-775/140-25</td><td>775/140 nm BrightLine&reg; filtro passa-banda de banda única</td></tr><tr><td>Dissipador de calor</td><td>Advanced Thermal Solutions</td><td>ATSEU-077A-C3-R0</td><td>Dissipadores de calor - LED STAR LED Dissipador de calor LED, 45mm dia., 68mm, Preto/Prata, Hardware de placa de base não rosqueada</td></tr><tr><td>LED 1 e LED 2</td><td>LED Engin Osram</td><td>LZ4-00B208</td><td>LEDs de alta potência - Cor única Azul, 460 nm 130 lm, 700mA</td></tr><tr><td>LED 3</td><td>Thorlabs</td><td>M625L3</td><td>625 nm, 700 mW (Min) LED montado, lentes de 1000 mA</td></tr><tr><td></td><td>Engin LED Osram</td><td>LLNF-2T06-H</td><td>Conjuntos de lentes de iluminação LED LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM</td></tr><tr><td>Fotodiodo para medidor</td><td>de energia Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>Sensor de potência de fotodiodo padrão</td></tr><tr><td>Medidor de potência</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Medidor compacto de energia e energia</td></tr><tr><td>Filtro vermelho</td><td>Semrock</td><td>FF02-628 / 40-25</td><td>BrightLine&reg; Filtro passa-banda de banda única</td></tr></tbody></table>

gerenciamento avançado do ritmo cardíaco aplicando fotoestimulação optogenética multi-site em corações murinos

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

As taquiarritmias ventriculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A desfibrilação elétrica usando choques elétricos de alta energia é atualmente o único tratamento para fibrilação ventricular com risco de vida. No entanto, a desfibrilação pode ter efeitos colaterais, incluindo dor intolerável, danos teciduais e piora do prognóstico, indicando uma necessidade médica significativa para o desenvolvimento de estratégias de manejo do ritmo cardíaco mais suaves. Além das abordagens elétricas redutoras de energia, a optogenética cardíaca foi introduzida como uma ferramenta poderosa para influenciar a atividade cardíaca usando canais iônicos de membrana sensíveis à luz e pulsos de luz. No presente estudo, um método robusto e válido para fotoestimulação bem-sucedida de corações murinos intactos perfundidos de Langendorff será descrito com base na estimulação multi-local aplicando uma matriz 3 x 3 de microdiodos emissores de luz (micro-LED). O mapeamento óptico simultâneo das ondas de tensão da membrana epicárdica permite a investigação dos efeitos da estimulação específica da região e avalia a atividade cardíaca recém-induzida diretamente no local. Os resultados obtidos mostram que a eficácia da desfibrilação é fortemente dependente dos parâmetros escolhidos para a fotoestimulação durante uma arritmia cardíaca. Será demonstrado que a área iluminada do coração desempenha um papel crucial para o sucesso da terminação, bem como a forma como o controle direcionado da atividade cardíaca durante a iluminação para modificar os padrões de arritmia pode ser alcançado. Em resumo, essa técnica oferece a possibilidade de otimizar a manipulação do mecanismo no local no caminho para o controle de feedback em tempo real do ritmo cardíaco e, em relação à especificidade da região, novas abordagens na redução do dano potencial ao sistema cardíaco em comparação com o uso de aplicações de choque elétrico não específicas.

O protocolo permite a indução de arritmias ventriculares em corações murinos intactos utilizando pulsos de fotoestimulação gerados por LED 1 e LED 2 (Figura 1) com frequência f ind entre 25 Hz e 35 Hz e pulso de duração Wind entre 2 ms e 10 ms. Observe que o objetivo de tais pulsos de luz rápidos não é capturar o ritmo cardíaco, mas sim desequilibrar a atividade cardíaca para que ondas elétricas erráticas possam ser geradas, o que facilita uma arritmia. A vantagem de i...

Este trabalho relata um método de controle do ritmo cardíaco de corações murinos intactos de camundongos transgênicos com canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulação local com matriz micro-LED e mapeamento óptico simultâneo do potencial de membrana epicárdica.

Gerenciamento Avançado do Ritmo Cardíaco Aplicando Fotoestimulação Optogenética Multi-Site em Corações Murinos

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

A fibrilação e desfibrilação cardíaca mais subjacentes do estado físico permanece não completamente compreendida. A optogenética pode oferecer uma maneira de obter mais informações sobre os fenômenos cardíacos em um ambiente bem controlado. A estimulação de luz local usando micro LEDs permite a inovação de áreas específicas do tecido cardíaco.Esta estimulação direcionada é uma nova ferramenta para desenvolver métodos de terapia anti-aritmética suave do coração. O protocolo mostrado pode ser usado para estudar o comportamento cardíaco durante a arritmia cardíaca e, especialmente, durante a terminação. Em perspectiva, as técnicas desenvolvidas podem ser utilizadas para estudar modelos animais de grande porte mais relevantes clinicamente.Antes de cada experimento, limpe todos os tubos com água totalmente desmineralizada. Arejar as soluções tireoidianas com carbogênio por 30 minutos à temperatura ambiente e ajustar o pH para 7,3 com hidróxido de sódio e ácido clorídrico. Aqueça o sistema de perfusão a 37 graus Celsius com uma bomba de calor de água.Mantenha a temperatura do perfusato constante dentro do banho-maria usando um elemento de aquecimento adicional, como um cabo de aquecimento à prova d'água. Adicione 500 mililitros de cada solução tireoidiana ao reservatório correspondente e desaregue os tubos, bem como a armadilha de bolhas, executando a solução da tireoide através do sistema de perfusão até que não sejam mais vistas bolhas de ar presas nos tubos ou na armadilha de bolhas. Continue arejando as soluções tireoidianas durante todo o experimento nos reservatórios com carbogênio para garantir que o pH do perfusato permaneça estável mais tarde durante a perfusão.Depois de remover o coração, execute a preparação fina sob um microscópio estereoscópico. Prenda a aorta na agulha contundente e fixe o vaso com material de sutura. Como controle, injete solução de tireoide gelada através da agulha no coração e verifique se o coração está bem montado.Transfira o coração montado para o sistema de perfusão e certifique-se de que o perfusato está fluindo para evitar que o ar entre no coração enquanto conecta a agulha com o purgador de bolhas. Verifique se o coração está coberto com solução de tireoide no banho-maria e se está batendo em poucos minutos. Coloque um dos eletrodos de ECG o mais próximo possível da superfície do coração para garantir uma boa qualidade de sinal.Suspenda o segundo eletrodo de ECG na solução da tireoide, certificando-se de que o ECG está sendo registrado. Coloque a matriz de micro LED na área de interesse. Mude a perfusão para tireoide com baixo teor de potássio com penécida e examine o coração por 15 a 30 minutos.Para induzir a arritmia, ilumine o coração com LED um e LED dois com um trem de 20 a 50 pulsos de luz com uma frequência de 25 a 35 hertz, duração do pulso de dois a 15 milissegundos e intensidade de luz de 2,8 miliwatts por milímetro quadrado. Repita o processo até que a arritmia seja induzida. Uma vez que uma arritmia sustentada é detectada visualmente, aplique uma explosão de pulsos com diferentes larguras e frequências usando três, seis ou nove micro LEDs da matriz a uma corrente pulsante de 15 pilares de miliamperes.Se a arritmia continuar após cinco ensaios de desfibrilação baseados em matriz de micro LED, classifique a tentativa como malsucedida e inicie a desfibrilação de backup, usando LED um e LED dois com os mesmos parâmetros de tempo. Perfundir o coração com a solução de blebbisstatina e esperar até que ocorra o desacoplamento mecânico, o que é realizado quando o coração para de bater, mas um sinal de ECG ainda é mensurável. Dê o corante de tensão de um mililitro, corante 4-A-N-B-D-Q-P-Q como um bolus na armadilha de bolhas da perfusão de Langendorff e espere de cinco a 10 minutos para permitir que o corante examine o coração uniformemente.Ligue o LED três. Foque a câmera na superfície do coração e aplique 1,27 miliwatts por milímetro quadrado de potência óptica. Desligue as luzes do laboratório e inicie a gravação, certificando-se de que um sinal óptico está sendo adquirido, comparando a frequência do sinal obtido com a frequência do ECG gravado.Uma série de experimentos com diferentes frequências, número de micro LED e durações de pulso foram testados para 11 camundongos, demonstrando que pulsos de 1 a 20 milissegundos podem desfibrilar com diferentes taxas de sucesso. Há um aumento significativo na taxa de sucesso dos nove LEDs com durações de pulso de um milissegundo e 20 milissegundos a uma frequência de desfibrilação de 18 e 20 hertz, o que é mais próximo da frequência média de arritmia analisada de 22,55 de todas as arritmias com um intervalo de erro de mais ou menos quatro pontos zero três hertz. Duas tentativas diferentes de desfibrilação com frequência de 14 hertz com seus registros de ECG e seus respectivos espectrogramas são mostradas aqui.Em um exemplo de desfibrilação com pulsos de 30 milissegundos, a frequência dominante da arritmia aumenta ligeiramente até que a fotoestimulação comece. A FV é transformada em um VT onde a frequência dominante cai para 14 hertz seguida de terminação malsucedida e retorno ao comportamento arrítmico com uma frequência dominante de 24 hertz. No segundo exemplo, o segmento um mostra um VT com frequência dominante de 23 hertz e seus componentes harmônicos até o início da fotoestimulação, com uma largura de pulso de 20 milissegundos.O segmento três exibe uma terminação bem-sucedida que leva a um ritmo sinusal normal com uma frequência fundamental de 3,5 hertz e os harmônicos resultantes. O mapeamento óptico com câmeras de alta velocidade mostrou uma mudança de intensidade de fluorescência durante uma única batida do coração durante um ritmo sinusal normal. O comprimento da perfusão deve manter todas as condições para manter o coração saudável, ou seja, a temperatura, o valor de pH e a oxidação precisam permanecer constantes.É particularmente importante que a solução tiroide não fique vazia, pois as bolhas de ar no sistema podem danificar o coração. O micro reality array oferece grande flexibilidade. Você pode segmentar diferentes locais do coração ou até mesmo combinar várias matrizes em um experimento, a fim de terminar adequadamente a arritmia.

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Medicine

Medicina

Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

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Apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos eletromecânicos da ativação do GtACR1 em cardiomiócitos de coelho. Fornecemos informações detalhadas sobre isolamento celular, cultivo e transdução adenoviral, e sobre experimentos funcionais com as técnicas de patch-clamp e fibra de carbono.

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O presente protocolo descreve a geração de Drosophila melanogaster expressando opsinas eNpHR2.0 ou ReaChR no coração para imagem OCT e ritmo cardíaco optogenético. Instruções detalhadas para imagem de Drosophila OCT e modulação de batimentos cardíacos, incluindo a simulação de parada cardíaca restauradora, bradicardia e taquicardia em animais vivos em diferentes estágios de desenvolvimento, são relatadas.

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Este protocolo introduz o mapeamento óptico dual-dye de corações de camundongos obtidos de animais selvagens e knock-in afetados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluindo medidas eletrofisiológicas de voltagem transmembrana e transientes intracelulares de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial.

Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica

Este protocolo ilustra um método para estimulação optogenética de neurônios cardíacos intrínsecos em corações de camundongos transgênicos. A abordagem descrita é usada para investigar a cinética da ativação súbita de neurônios cardíacos em corações perfundidos ex vivo e as interações entre a atividade colinérgica e catecolaminérgica.

Ativação optogenética de neurônios autônomos cardíacos intrínsecos em corações de camundongos perfundidos excisados

O uso da luz para controlar células e tecidos cardíacos permite a estimulação sem contato, preservando assim o estado natural e a função das células, tornando-se uma abordagem valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações terapêuticas.

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Aprenda a controlar arritmias cardíacas em corações murinos usando fotoestimulação optogenética com matriz de micro-LEDs. Este método permite ajustar parâmetros de pulso e área iluminada para terminar taquiarritmias de forma mais segura que a desfibrilação elétrica convencional.

Gerenciamento Avançado do Ritmo Cardíaco Aplicando Fotoestimulação Optogenética Multi-Site em Corações Murinos

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