Gerenciamento Avançado do Ritmo Cardíaco Aplicando Fotoestimulação Optogenética Multi-Site em Corações Murinos

A fibrilação e desfibrilação cardíaca mais subjacentes do estado físico permanece não completamente compreendida. A optogenética pode oferecer uma maneira de obter mais informações sobre os fenômenos cardíacos em um ambiente bem controlado. A estimulação de luz local usando micro LEDs permite a inovação de áreas específicas do tecido cardíaco.

Esta estimulação direcionada é uma nova ferramenta para desenvolver métodos de terapia anti-aritmética suave do coração. O protocolo mostrado pode ser usado para estudar o comportamento cardíaco durante a arritmia cardíaca e, especialmente, durante a terminação. Em perspectiva, as técnicas desenvolvidas podem ser utilizadas para estudar modelos animais de grande porte mais relevantes clinicamente.

Antes de cada experimento, limpe todos os tubos com água totalmente desmineralizada. Arejar as soluções tireoidianas com carbogênio por 30 minutos à temperatura ambiente e ajustar o pH para 7,3 com hidróxido de sódio e ácido clorídrico. Aqueça o sistema de perfusão a 37 graus Celsius com uma bomba de calor de água.

Mantenha a temperatura do perfusato constante dentro do banho-maria usando um elemento de aquecimento adicional, como um cabo de aquecimento à prova d'água. Adicione 500 mililitros de cada solução tireoidiana ao reservatório correspondente e desaregue os tubos, bem como a armadilha de bolhas, executando a solução da tireoide através do sistema de perfusão até que não sejam mais vistas bolhas de ar presas nos tubos ou na armadilha de bolhas. Continue arejando as soluções tireoidianas durante todo o experimento nos reservatórios com carbogênio para garantir que o pH do perfusato permaneça estável mais tarde durante a perfusão.

Depois de remover o coração, execute a preparação fina sob um microscópio estereoscópico. Prenda a aorta na agulha contundente e fixe o vaso com material de sutura. Como controle, injete solução de tireoide gelada através da agulha no coração e verifique se o coração está bem montado.

Transfira o coração montado para o sistema de perfusão e certifique-se de que o perfusato está fluindo para evitar que o ar entre no coração enquanto conecta a agulha com o purgador de bolhas. Verifique se o coração está coberto com solução de tireoide no banho-maria e se está batendo em poucos minutos. Coloque um dos eletrodos de ECG o mais próximo possível da superfície do coração para garantir uma boa qualidade de sinal.

Suspenda o segundo eletrodo de ECG na solução da tireoide, certificando-se de que o ECG está sendo registrado. Coloque a matriz de micro LED na área de interesse. Mude a perfusão para tireoide com baixo teor de potássio com penécida e examine o coração por 15 a 30 minutos.

Para induzir a arritmia, ilumine o coração com LED um e LED dois com um trem de 20 a 50 pulsos de luz com uma frequência de 25 a 35 hertz, duração do pulso de dois a 15 milissegundos e intensidade de luz de 2,8 miliwatts por milímetro quadrado. Repita o processo até que a arritmia seja induzida. Uma vez que uma arritmia sustentada é detectada visualmente, aplique uma explosão de pulsos com diferentes larguras e frequências usando três, seis ou nove micro LEDs da matriz a uma corrente pulsante de 15 pilares de miliamperes.

Se a arritmia continuar após cinco ensaios de desfibrilação baseados em matriz de micro LED, classifique a tentativa como malsucedida e inicie a desfibrilação de backup, usando LED um e LED dois com os mesmos parâmetros de tempo. Perfundir o coração com a solução de blebbisstatina e esperar até que ocorra o desacoplamento mecânico, o que é realizado quando o coração para de bater, mas um sinal de ECG ainda é mensurável. Dê o corante de tensão de um mililitro, corante 4-A-N-B-D-Q-P-Q como um bolus na armadilha de bolhas da perfusão de Langendorff e espere de cinco a 10 minutos para permitir que o corante examine o coração uniformemente.

Ligue o LED três. Foque a câmera na superfície do coração e aplique 1,27 miliwatts por milímetro quadrado de potência óptica. Desligue as luzes do laboratório e inicie a gravação, certificando-se de que um sinal óptico está sendo adquirido, comparando a frequência do sinal obtido com a frequência do ECG gravado.

Uma série de experimentos com diferentes frequências, número de micro LED e durações de pulso foram testados para 11 camundongos, demonstrando que pulsos de 1 a 20 milissegundos podem desfibrilar com diferentes taxas de sucesso. Há um aumento significativo na taxa de sucesso dos nove LEDs com durações de pulso de um milissegundo e 20 milissegundos a uma frequência de desfibrilação de 18 e 20 hertz, o que é mais próximo da frequência média de arritmia analisada de 22,55 de todas as arritmias com um intervalo de erro de mais ou menos quatro pontos zero três hertz. Duas tentativas diferentes de desfibrilação com frequência de 14 hertz com seus registros de ECG e seus respectivos espectrogramas são mostradas aqui.

Em um exemplo de desfibrilação com pulsos de 30 milissegundos, a frequência dominante da arritmia aumenta ligeiramente até que a fotoestimulação comece. A FV é transformada em um VT onde a frequência dominante cai para 14 hertz seguida de terminação malsucedida e retorno ao comportamento arrítmico com uma frequência dominante de 24 hertz. No segundo exemplo, o segmento um mostra um VT com frequência dominante de 23 hertz e seus componentes harmônicos até o início da fotoestimulação, com uma largura de pulso de 20 milissegundos.

O segmento três exibe uma terminação bem-sucedida que leva a um ritmo sinusal normal com uma frequência fundamental de 3,5 hertz e os harmônicos resultantes. O mapeamento óptico com câmeras de alta velocidade mostrou uma mudança de intensidade de fluorescência durante uma única batida do coração durante um ritmo sinusal normal. O comprimento da perfusão deve manter todas as condições para manter o coração saudável, ou seja, a temperatura, o valor de pH e a oxidação precisam permanecer constantes.

É particularmente importante que a solução tiroide não fique vazia, pois as bolhas de ar no sistema podem danificar o coração. O micro reality array oferece grande flexibilidade. Você pode segmentar diferentes locais do coração ou até mesmo combinar várias matrizes em um experimento, a fim de terminar adequadamente a arritmia.