Name: Sondas de Tensão de DNA para Mapear as Forças Transitórias do Receptor de Piconewton por Células Imunes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a usar sondas de tensão de DNA para mapear forças de piconewton em células imunes. Este método permite visualizar e armazenar eventos mecânicos transitórios usando microscopia de fluorescência convencional.

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Este trabalho foi apoiado pelos NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 e NSF CAREER 1350829. Agradecemos ao NIH Tetramer Facility pelos ligantes pMHC. Este estudo foi apoiado, em parte, pelo Emory Comprehensive Glycomics Core.

Os camundongos transgênicos OT-1 estão alojados na Divisão de Recursos Animais da Universidade de Emory. Todos os experimentos foram aprovados e realizados sob o protocolo da Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
1. Preparação de oligonucleotídeos
<ol><li>Dissolver o DNA da fita ligante em água (resistividade de 18,2 MΩ, utilizada durante todo o protocolo). Vórtice e gire a solução com uma centrífuga de mesa. Ajuste o volume de água de tal forma que a concentração final seja de 1 mM. Validar a concentração usando um espectrofotômetro de nanogotas para medir a absorbância a 260 nm e determinar a concentração final com base no coeficiente de extinção do oligonucleotídeo. NOTA: A fita ligante tem uma modificação em cada terminal, 5' amina e 3' biotina, para conjugar com o fluoróforo e apresentar o ligante biotinilado. O grupo amina na fita ligante precisa ser conjugado com um fluoróforo. O corante Cy3B é usado para esta conjugação devido ao seu alto brilho e fotoestabilidade, mas geralmente não é oferecido comercialmente e requer conjugação interna. Assim, a seção a seguir descreve a conjugação entre aminas e corantes ésteres do NHS. Para usuários finais que não têm acesso a instalações ou recursos para modificação de ácido nucleico, os ácidos nucleicos modificados podem ser comprados de fornecedores personalizados de síntese de DNA que oferecem corantes brilhantes e fotoestáveis, como a família de corantes Alexa e Atto.</li>
	<li>Prepare soluções 10x PBS e 1 M NaHCO3 . Misturar 10 μL da solução de fita ligante de amina 1 mM (10 nmol) com 10 μL de 10x PBS, 10 μL de 1 M NaHCO3 e 60 μL de H2O. Dissolver 50 μg de Cy3B NHS ester em 10 μL de DMSO imediatamente antes do uso e adicionar à mistura para um volume total de reação de 100 μL. Adicione Cy3B NHS ester por último. Deixar reagir à temperatura ambiente durante 1 h ou 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Prepare o fio de bloqueio Atto647N conjugando o fio de bloqueio de amina com o éster Atto647N NHS. Preparar 10x PBS e 1 M NaHCO3 solução. Misturar 10 μL da solução de fita de bloqueio de amina 1 mM (10 nmol) com 10 μL de 10x PBS, 10 μL de 1 M NaHCO3 e 60 μL de H2O. Dissolver 50 μg de éster Atto647N NHS em 10 μL de DMSO imediatamente antes do uso e adicionar à mistura para um volume total de reação de 100 μL. Adicione Atto647N NHS ester por último. Deixar reagir à temperatura ambiente durante 1 h ou 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Após as reações, remover os subprodutos, o excesso de corante e os sais por filtração em gel dessalinizador P2. Diluir a mistura de reacção com H2O para um volume total de 300 μL, adequado para a etapa subsequente de purificação por HPLC. Adicionar 650 μL de gel P2 hidratado a um dispositivo centrífugo e girar para baixo a 18.000 x g por 1 min. Retire o líquido na parte inferior do dispositivo, adicione a mistura de reação à coluna que contém o gel P2, gire para baixo a 18.000 x g por 1 min e colete a mistura de reação na parte inferior do dispositivo. NOTA: O gel P2 deve ser hidratado pelo menos 4 h antes do uso com H2O.</li>
	<li>Purificar a mistura de reação dessalinizada com HPLC usando uma coluna C18 designada para purificação de oligonucleotídeos, com solvente A: 0,1 M TEAA em H2O e B: ACN como fase móvel para uma eluição de gradiente linear 10-100% B durante 50 min a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. Injetar a mistura de reação dessalgada em HPLC de fase reversa com um circuito de injeção de 500 μL para purificação. Recolher o produto que tem um pico de absorbância para o ADN (260 nm) e um pico de absorbância para o fluoróforo (560 nm para Cy3B e 647 nm para Atto647N) e secá-los num concentrador centrífugo a vácuo durante a noite (ver Figura 2A).</li>
	<li>Reconstituir o produto oligocorante seco em 100 μL de água. Determinar a concentração da fita ligante Cy3B e da fita de bloqueio Atto647N com o espectrofotômetro de nanogotas. Certifique-se de que a proporção de rotulagem do corante esteja próxima de 1:1. Corrigir a absorbância de 260 nm do corante, se necessário, ao determinar a concentração de oligonucleotídeos.</li>
	<li>Validar o produto purificado com MALDI-TOF-MS usando 3-HPA como substrato em 50% ACN/H2O com TFA 0,1% e 5 mg/mL de citrato de amônio usando 0,5 μL do produto a 1-5 μM para preparação de amostra de MALDI-TOF-MS. Um exemplo de espectro de massa pode ser encontrado na Figura 2B.</li>
	<li>Dissolva o fio hairpin e o fio de âncora quencher em água e certifique-se de que a concentração das soluções estoque esteja entre 50 e 100 μM. NOTA: O fio hairpin não é modificado e pode ser sintetizado diretamente personalizado a partir de um fornecedor. A fita âncora tem um grupo de ancoragem tiol e um quencher BHQ2 e pode ser sintetizada diretamente de um fornecedor.</li>
	<li>Alíquota todos os oligonucleotídeos. Para utilização e armazenamento a curto prazo, conservar estes oligonucleótidos a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, congelar e mantê-los a -20 °C. Neste ponto, todos os oligonucleotídeos estão prontos para a montagem da sonda de tensão do DNA. NOTA: Ciclos repetidos de congelamento-descongelamento não são problemáticos para oligonucleotídeos.</li>
</ol>2. Preparação da superfície
NOTA: A preparação de substratos de sonda de tensão de DNA hairpin leva dois dias. A sonda de tensão do pino de DNA será funcionalizada sobre lamínulas de vidro.
<ol><li>Dia 1<ol><li>Coloque as lamínulas de 25 mm em um rack de politetrafluoretileno em um copo de 50 mL. Cada rack pode conter até 8 lamínulas. Enxágue as lamínulas submergindo em água três vezes.</li>
		<li>Adicionar 40 ml de uma solução de etanol na proporção 1:1 (v:v) misturada com água ao copo que contém a cremalheira e as lamínulas e selar o copo utilizando uma película de parafina.</li>
		<li>Sonicate o copo por 15 min em um limpador ultrassônico (frequência de operação 35 KHz) para limpar as lamínulas. Após a sonicação, descarte o líquido e enxágue o copo com a cremalheira e cubra com água pelo menos 6 vezes para remover qualquer solvente orgânico restante.</li>
		<li>Preparar solução fresca de piranha misturando ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio na proporção de 3:1. Para fazer 40 mL de solução de piranha, adicione 30 mL de ácido sulfúrico a um copo limpo de 50 mL primeiro e, em seguida, adicione lentamente 10 mL de H 2 O2. A solução de piranha aquece rapidamente e borbulha após a adição do H 2 O2. Misture suavemente a piranha usando a extremidade de uma pipeta de vidro.</li>
		<li>Em seguida, transfira o rack que contém as lamínulas para o copo contendo solução de Piranha suavemente misturada para condicionamento ácido (Figura 3A). Deixe a solução de Piranha hidroxilato e limpe as lamínulas por 30 min à temperatura ambiente. Após a gravação da piranha, transfira o rack com uma pinça de aço ou politetrafluoretileno para um copo limpo de 50 mL com água e enxágue novamente com água pelo menos 6 vezes. CUIDADO: Grandes quantidades de substâncias orgânicas podem reagir vigorosamente com a solução de piranha e podem causar explosão. Tenha cuidado e trabalhe sempre com solução de piranha em uma coifa de fumaça. Certifique-se de usar jaleco, luvas e óculos de segurança. Nunca guarde a solução fresca de piranha em um recipiente lacrado. NOTA: A relação peróxido de hidrogênio/ácido sulfúrico deve ser mantida abaixo de 1:2 (v:v) e nunca deve exceder 1:1. Ao submergir o rack com lamínulas em solução Piranha, coloque-as na solução de forma lenta e cuidadosa. Não descarte a solução imediatamente após o condicionamento térmico, pois ela ainda está ativa e quente. Deixe-o no copo durante a noite antes de despejá-lo no recipiente de resíduos ácidos.</li>
		<li>Mergulhe o rack que prende as lamínulas em um copo de 50 mL com 40 mL de etanol para remover a água. Descarte o etanol e repita 3 vezes para garantir que a água foi removida.</li>
		<li>Em seguida, imergir o rack em aminopropiltrietoxi-silano (APTES) a 3% (v/v) em 40 mL de etanol para reagir com o -OH nas lamínulas por 1 h à temperatura ambiente (Figura 3B). NOTA: O etanol pode ser substituído por acetona.</li>
		<li>Enxaguar as superfícies 6 vezes submergindo-as em 40 mL de etanol e, em seguida, secar em estufa a 80 °C por 20 min. Após o arrefecimento, guarde as lamínulas secas modificadas com amina a -20 °C para utilização futura (até 6 meses).</li>
		<li>Cubra a parte interna inferior de placas de Petri plásticas de 10 cm de diâmetro com filme de parafina. A película de parafina evita que as lamínulas deslizem para dentro da placa de Petri e ajuda a manter a solução para os próximos passos da funcionalização nas lamínulas. Coloque as tampas resfriadas modificadas com amina nas placas de Petri. O lado a ser funcionalizado deve estar voltado para cima.</li>
		<li>Para modificar os grupos amina nas lamínulas, adicionar 300 μL de ácido lipóico a 0,5% p/v PEG NHS (LA-PEG-SC) e 2,5% p/v mPEG NHS (mPEG-SC) em NaHCO3 0,1 M em cada lamínula e incubar por 1 h à temperatura ambiente (Figura 3C). Para cada lamínula de 25 mm, pesar 1,5 mg de LA-PEG-SC e 7,5 mg de mPEG-SC. Dissolva os reagentes do NHS imediatamente antes de adicionar às superfícies, pois eles têm uma meia-vida curta (~10 min) em solução aquosa à temperatura ambiente. Após a reação, enxaguar as superfícies 3 vezes com água. NOTA: A reação do NHS pode ser realizada a 4 °C durante a noite. Os reagentes do NHS têm meia-vida mais longa antes da hidrólise a 4 °C, que é em torno de 4-6 h. Isso resultará em um procedimento de preparação de superfície de três dias.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de NaHCO3 0,1 M contendo 1 mg/mL de acetato de sulfo-NHS a um conjunto de lamínulas "sanduíche" (duas lamínulas voltadas uma para a outra com tampão de reação no meio). Permitir que a passivação ocorra por pelo menos 30 min. Para economizar reagente, essa etapa poderia ser feita com 50 μL de 1 mg/mL de acetato de sulfo-NHS. Enxaguar com água três vezes após a passivação.</li>
		<li>Adicionar 0,5 mL de nanopartículas de ouro (AuNP, 8,8 nm, ácido tânico, 0,05 mg/mL) a cada lamínula e incubar por 30 min à temperatura ambiente (Figura 3D). Para salvar o reagente, essa etapa pode ser feita com duas tampas também. Certifique-se de que nenhum sal esteja presente no sistema das etapas anteriores para evitar a agregação de nanopartículas de ouro. Não deixe as tampas secar após esta etapa.</li>
		<li>Enquanto isso, pré-hibridizar 4,7 pN hairpin, fita de ligante Cy3B e fita de âncora BHQ2 que formam as sondas de tensão de DNA constroem em uma proporção de 1,1:1:1 em 1 M NaCl a 300 nM em um tubo de PCR. Recozer os fios aquecendo a solução até 95 °C durante 5 minutos e, em seguida, arrefecer gradualmente diminuindo a temperatura para 20 °C durante 30 minutos num termociclador.</li>
		<li>Enxaguar as lamínulas com água três vezes após 30 min de incubação com nanopartículas de ouro. Adicione uma fita de ancoragem BHQ2 adicional (a partir de 100 μM de estoque) à solução de DNA recozido para fazer a relação entre a fita de ancoragem BHQ2 e a fita ligante Cy3B 10:1. Neste ponto, a solução de DNA deve conter 300 nM de construção de sonda de tensão e 2,7 μM de fita BHQ2. Adicionar 100 μL por duas lamínulas para fazer o "sanduíche" (Figura 3E).</li>
		<li>Coloque cuidadosamente uma bola de tecido de laboratório molhada na placa de Petri (longe de lamínulas) e sele a placa com filme de parafina para evitar que a solução seque. Cubra o prato com papel alumínio e incube a 4 °C durante a noite.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2<ol><li>Lave as sondas em excesso das lamínulas com 1x PBS. Verifique a qualidade da superfície da sonda de tensão do DNA em um microscópio epifluorescente.</li>
		<li>Preparar 40 μg/mL de estreptavidina em 1x PBS e incubar em lamínulas por 30 min à temperatura ambiente (Figura 3F). Normalmente, 100 μL são suficientes para uma lamínula de 25 mm. Enxaguar com PBS 3 vezes após a incubação para lavar o excesso de estreptavidina.</li>
		<li>Preparar 40 μg/mL de anticorpo/ligante biotinilado em 1x PBS. Adicionar 50-100 μL por sanduíche e incubar por 30 min à temperatura ambiente (Figura 3G). Enxaguar com PBS três vezes após a incubação para lavar a quantidade excessiva de anticorpo/ligante biotinilado.</li>
		<li>Monte as câmaras de imagem limpas com superfícies cuidadosamente. As superfícies podem ser facilmente rachadas ao apertar as câmaras. Adicionar 0,5-1 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) às câmaras de imagem e mantê-las prontas para aquisição de imagens com células (Figura 3H).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Forças de receptores celulares por imagem
<ol><li>Preparar células imunes de interesse em HBSS em 1-2 x 106 células/mL. NOTA: OT-1 CD8+ células virgens são usadas como exemplo neste artigo. Purificar células T virgens OT-1 CD8+ a partir do baço de camundongos sacrificados usando o kit de isolamento de células T CD8+ de camundongo MACS com um separador MACS seguindo as instruções do fabricante. Isolar e enriquecer as células T CD8+ removendo quaisquer células T não CD8+ às quais o coquetel de anticorpos de esgotamento magnético se ligou. Ressuspender as células T não VHS OT-1 CD8+ purificadas em HBSS a 2 x 106 células/mL e manter gelo antes do uso.</li>
	<li>Verificar a qualidade da superfície da sonda de tensão do pino de DNA sob um microscópio de fluorescência (objetiva 100x) para controle de qualidade antes de adicionar ligantes ou plaquear células. Imagem e quantificação da intensidade média de fundo no canal Cy3B de uma superfície de sonda de tensão hairpin DNA a partir de pelo menos 5 posições diferentes e 3 réplicas. Manter as condições de aquisição das imagens consistentes para que esse valor possa ser usado como um marcador confiável da qualidade da superfície e da densidade da sonda (Figura 4C). NOTA: Quantificar o número de fitas de DNA por nanopartícula de ouro e o número de nanopartículas de ouro por μm2 nas primeiras vezes de preparação da superfície de acordo com a literatura12, que pode ser usado como outro marcador confiável da qualidade da superfície.</li>
	<li>Placa ~4 x 10 4 - 10 x 104 células em cada sonda de tensão de DNA funcionalizada coverslip e permitir que eles se fixem e espalhem por ~15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>À medida que as células são plaqueadas nas sondas de tensão do pino de DNA e começam a se espalhar, os sinais de fluorescência que são gerados no canal Cy3B com a objetiva de 100x (Figura 3I).</li>
	<li>Depois que as células começam a produzir sinal de tensão em tempo real na superfície da sonda de tensão hairpin do DNA no canal Cy3B, adquirem imagens nos canais Cy3B e Atto647N (a microscopia TIRF fornece melhor relação sinal-ruído do que a epifluorescência). Em seguida, adicionar fita Atto647N às câmaras de imagem em uma concentração final de 200 nM para hibridização mecanicamente seletiva.</li>
	<li>Após 10 min de incubação, remova rápida e suavemente o tampão que contém o fio de bloqueio fluorescente Atto647N e substitua por sais balanceados frescos de Hank. Imagem nos canais Cy3B e Atto647N novamente e determinação do coeficiente de correlação de Pearson com o software Fiji15.</li>
	<li>No momento de interesse para a investigação, introduzir fita de bloqueio não fluorescente nas células na câmara de imagem para armazenar o sinal de tensão. Preparar o caldo de fita de bloqueio (100 μM) e adicionar às células a uma concentração final de 1 μM. Pipetar suavemente para misturar. A duração do bloqueio pode variar, mas 10 min é o tempo recomendado.</li>
	<li>Adquira filmes de lapso de tempo ou imagens de ponto final em epifluorescência para mapeamento qualitativo de tensão e análise quantitativa, conforme necessário (Figura 3J e Figura 5). NOTA: Se a medição de tensão em vários pontos de tempo for desejada, inicie o apagamento dos sinais de tensão armazenados pela adição de uma fita de desbloqueio. Para evitar o excesso de enxágue, uma concentração final mais alta da fita de destravamento a 2 μM é usada para iniciar uma reação de deslocamento da fita mediada pelo dedo do pé com a fita de travamento por 3 min, que apaga os sinais armazenados (Figura 3J). Enxágue suavemente o excesso de oligonucleotídeos com HBSS. A superfície da sonda de tensão do pino de cabelo do DNA e as células estão prontas para mais uma rodada de armazenamento e mapeamento de tensão. O desbloqueio de sinais de tensão não é necessário se apenas um ponto de tempo for de interesse no estudo.</li>
</ol>4. Análise dos dados
NOTA: A análise de imagens é realizada usando o software Fiji, e a análise quantitativa é realizada usando o software de análise.
<ol><li>Corrija qualquer desvio durante a aquisição de imagens com o comando Corrigir desvio 3D em Registro no menu Plug-ins .</li>
	<li>Remova o fundo da câmera da imagem com o comando Subtrair no menu Processo .</li>
	<li>Determine o coeficiente de correlação de Pearson com a função Colocalização no menu Analisar .</li>
	<li>Média e subtração do fundo de fluorescência produzido pelas sondas não abertas de três diferentes regiões de fundo local. Desenhe ROIs de células em imagens subtraídas em plano de fundo ou imagens RICM (microscopia de contraste de interferência de reflexão) com a ferramenta Image J Freehand Sselections . Meça qualquer métrica de interesse das ROIs, por exemplo, intensidade de fluorescência integrada e ocupação de tensão usando a ferramenta Medir no menu Analisar (Figura 6).</li>
	<li>Exporte as medições para análise quantitativa com software de análise.</li>
	<li>Plote os dados com qualquer software de análise.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Com os procedimentos detalhados fornecidos aqui, pode-se preparar substratos de sonda de tensão de DNA hairpin para mapear e quantificar a tensão do receptor produzida pelas células imunes. Quando as células são plaqueadas no substrato da sonda de tensão do pino de DNA, elas pousam, se ligam e se espalham à medida que os receptores detectam os ligantes química e mecanicamente, o último dos quais é detectado por nossas sondas. No entanto, em alguns casos, as células podem não se espalhar (Figura 7A</s...

As células imunes defendem-se contra patógenos e células cancerígenas rastejando e varrendo continuamente as superfícies das células-alvo em busca de antígenos, fixando sua superfície 1,2. O reconhecimento do antígeno é iniciado após a ligação entre o receptor de células T (TCR) e o complexo MHC (pMHC) do complexo peptídeo-principal de histocompatibilidade expresso na superfície das células-alvo. Como o reconhecimento do TCR-pMHC ocorre na junção entre duas células móveis, há muito se suspeita que ele experimente forças mecânicas. Além disso, isso levou ao modelo mecanosensor de ativação do TCR, que sugere que as forças do TCR contribuem para sua função 3,4. Para entender quando, onde e como as forças mecânicas contribuem para o funcionamento das células T, é imperativo desenvolver ferramentas para visualizar as forças moleculares transmitidas pelas células T. Tradicionalmente, métodos como a microscopia de força de tração (MFT) e os arranjos de micropilares são utilizados para investigar as forças celulares 5,6. No entanto, a sensibilidade à força dos arranjos de MTF e micropilares está na escala de nanonewton (nN) e, portanto, muitas vezes é insuficiente para estudar as forças moleculares de piconewton (pN) transmitidas por receptores celulares7. Para melhorar a força e a resolução espacial para detecção, nosso laboratório foi pioneiro no desenvolvimento de sondas de tensão molecular, que foram inicialmente sintetizadas usando polímeros de polietilenoglicol (PEG)7. As sondas de tensão molecular são compostas por uma "mola" molecular extensível (PEG, proteína, DNA) flanqueada por um fluoróforo e quencher e estão ancoradas em uma superfície. Forças aplicadas ao término da sonda levam à sua extensão, separando o fluoróforo e o quencher, gerando um forte sinal de fluorescência (Figura 1A)8,9,10.
Na última década, desenvolvemos uma biblioteca de diferentes classes de sondas de tensão molecular com elementos de mola feitos de ácidos nucléicos11, proteínas10 e polímeros8. Dentre estas, as sondas de tensão baseadas em DNA fornecem a maior relação sinal/ruído e a maior sensibilidade à força, que é facilmente sintonizada de alguns pN até ~20 pN11. Usamos essas sondas de tensão de DNA em tempo real para estudar as forças moleculares geradas por diversos tipos celulares, incluindo fibroblastos, células cancerosas, plaquetas e células imunes11,12,13. Este manuscrito descreverá protocolos para sintetizar e montar sondas de tensão de DNA em uma superfície para mapear forças de receptores moleculares com resolução de força de pN usando um microscópio de fluorescência convencional. Embora o procedimento atual inclua modificações químicas no ácido nucleico para introduzir o repórter fluorescente (Figura 1B), é importante notar que muitas das etapas de modificação e purificação podem ser terceirizadas para empresas de síntese de DNA personalizadas. Portanto, a tecnologia de sondas de tensão de DNA é fácil e acessível para as comunidades mais amplas de biologia celular e mecanobiologia.
Resumidamente, para montar sensores de tensão de DNA, um hairpin de DNA é hibridizado a uma fita fluorescente ligante em um braço e uma fita de âncora quencher no outro braço e, em seguida, imobilizado em um substrato de vidro (Figura 1C, tensão em tempo real). Na ausência de força mecânica, o hairpin é fechado e, assim, a fluorescência é apagada. No entanto, quando a força mecânica aplicada é maior que o F1/2 (a força em equilíbrio que leva a uma probabilidade de 50% de desdobramento), o hairpin derrete mecanicamente e um sinal fluorescente é gerado.
Com base no sensor de tensão do DNA em tempo real, também descrevemos protocolos para mapear forças acumuladas, o que é particularmente útil para estudar interações entre receptores em células imunes e seu ligante natural. Isso ocorre porque os receptores imunes frequentemente apresentam ligações de curta duração 3,14. As forças acumuladas são imageadas usando uma fita de "travamento" que se liga preferencialmente aos pinos de cabelo de DNA abertos e permite o armazenamento de sinais de fluorescência associados a eventos de tração mecânica (Figura 1C, tensão bloqueada). O fio de bloqueio é projetado para ligar um local de ligação críptico que é exposto após o derretimento mecanicamente induzido do hairpin e travar o hairpin no estado aberto, bloqueando a redobração do hairpin, armazenando assim o sinal de tensão e gerando um mapa de tensão acumulado. Além disso, a fita de travamento é projetada com um suporte de oito nucleotídeos, que permite uma reação de deslocamento de fita mediada por dedos dos pés com seu complemento completo, a fita de "destravamento". Com a adição do fio de desbloqueio, o fio de travamento preso é retirado da construção do hairpin, apagando o sinal de tensão armazenado e redefinindo o hairpin de volta ao estado em tempo real.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Figura 1: Esquema das sondas de tensão molecular de última geração. (A) Projeto geral de sonda de tensão molecular em tempo real, (B) Fitas para a construção de sonda de tensão baseada em DNA e (C) Sondas de tensão baseadas em DNA projetadas e sua alternância entre o estado em tempo real e o estado bloqueado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O protocolo principal consiste em quatro seções principais - preparação de oligonucleotídeos, preparação de superfície, imagem e análise de dados. Este protocolo foi demonstrado com sucesso por nosso laboratório e outros em células T CD8+ OT-1 virgens e ativadas, células CD4+ OT-II, bem como hibridomas, e pode ser aplicado para interrogar diferentes receptores de células imunes, incluindo receptor de células T, receptor de morte celular programada (PD1) e forças do antígeno 1 associado à função linfocitária (LFA-1). Células T virgens de OT-1 CD8+ são usadas como um exemplo de linhagem celular neste artigo.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPA)</td><td>Sigma</td><td>56197</td><td>maldi-TOF-MS matrix</td></tr><tr><td>&nbsp; mPEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>MF001023-2K preparação de</td><td>superfície</td></tr> <tr><td>(3-Aminopropil) trietoxissilano</td><td>Acros</td><td>AC430941000</td><td></td></tr><tr><td>preparação de superfície 10x Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Biolegend</td><td>00-4333-57</td><td>tampão</td></tr><tr><td>8,8 nm nanopartículas de ouro, ácido tânico</td><td>Nanocomposix</td><td>personalizado pedido</td><td>preparação de superfície</td></tr><tr><td>Atto647N NHS éster</td><td>Sigma</td><td>18373-1MG-F</td><td>fluoróforo, oligo prep</td></tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber, para microscopia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>imaging</td></tr><tr><td>BD Seringas apenas com Luer-Lok</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td>cells</td></tr><tr><td>biotinilated anti-mouse CD3e</td><td>ebioscience</td><td>13-0031-82</td><td>anticorpo/ligante</td></tr><tr><td>Ovalbumina pMHC biotinilada (SIINFEKL)</td><td>NIH Tetramer Core Facility na Emory University</td><td>Anticorpo</td><td>/ligante</td>NA</tr><tr><td>albumina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>735078001</td><td>bloqueia interações não específicas</td></tr><tr><td>Filtros celulares</td><td>Biologix</td><td>15-1100</td><td>células</td></tr><tr><td>Coverslip Mini-Rack, teflon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td>preparação de superfície</td></tr><tr><td>Cy3B NHS éster</td><td>GE Healthcare</td><td>PA63101</td><td>fluoróforo, oligo preparação</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>tampão</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td>preparação de superfície</td></tr><tr><td>Hank' s sais balanceados (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td>tampão</td></tr><tr><td>peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>preparação de superfície</td></tr><tr><td>LA-PEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>HE039023-3.4K</td><td>preparação de superfície</td></tr><tr><td>Midi MACS (LS) kit de inicialização</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-301</td><td>células</td></tr><tr><td>de camundongo CD8+ kit de isolamento de células T</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td>células</td></tr><tr><td>Dispositivos centrífugos Nanosep MF</td><td>Pall laboratório</td><td>ODM02C35</td><td>preparação de oligo</td></tr><tr><td>No. 2 lamínulas de vidro redondas</td><td>VWR</td><td>48382-085</td><td>preparação de superfície</td></tr><tr><td>NTA-SAM</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>N475-10</td> preparação de <td>superfície</td></tr><tr><td>P2 gel</td><td>Bio-rad</td><td>1504118</td><td>oligo preparação</td></tr><tr><td>ácido sufúrico</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>SX1244-6</td><td>preparação de superfície</td></tr><tr><td>Acetato de Sulfo-NHS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26777</td><td>preparação de superfície</td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotídeo C18 coluna, 4,6 x 150 mm, 2,7 &mu; m</td><td>653950-702</td><td></td><td>preparação de oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>Barnstead Sistema de purificação de água nanopura</td><td></td><td>Água Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo 100&times; NA 1.49 objetiva</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>Cy5 cubo</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>evoluir dispositivo acoplado de carga multiplicadora de elétrons (EMCCD)</td><td>Microscopia fotométrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia líquida de alta eficiência</td><td>Agilent 1100</td><td></td><td>preparação de oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>Fonte de epifluorescência Intensilight</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistido por matriz (MALDI-TOF-MS)Preparação</td> <td>de oligonucleotídeos</td> <td>Voyager STR</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis Nanodrop 2000 Preparação</td><td>de oligonucleotídeos</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Nikon Eclipse Ti</td><td>Microscopia</td><td></td> Nikon <td></td></tr><tr><td>Perfect Focus System</td><td>Nikon Nikon</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopy</td></tr><tr><td>quad band TIRF 405/488/561/647 cubo</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>RICM cubo</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>Lançador TIRF com 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) e 640 nm</td><td>Microscopia</td><td>Coerente</td><td></td></tr><tr><td>TRITC cubo</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Microscopia</td></tr><tr><td>< nome > oligo forte< / forte ></td> <td>< forte > modificação de 5 '/ modificação de 3 '< / forte ></td> <td>< forte > sequência (5 'a 3') < / forte ></td> <td>< forte > Uso < / forte ></td></tr> <tr><td>15mer fio de travamento de amina</td> <td>< forte > 5 'modificação: < / forte> sem modificação < forte > 3 ': /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>bloqueando sinal de tensão em tempo real</td></tr><tr><td>15mer Atto647N fio de travamento</td><td><forte>5' modificação: </forte> Atto647N 3' modificação:</forte> /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC</td><td>bloqueio de sinal de tensão em tempo real</td></tr><tr><td>15mer fio</td> <td>de travamento não fluorescente<forte>5' modificação:</forte> sem modificação <forte>3' modificação:</forte> sem modificação</td><td>UM AAA AAC ATT TAT AC</td><td>bloqueio de sinal de tensão em tempo real para análise quantitativa</td></tr><tr><td>4,7 pN fio de grampo de cabelo</td><td><forte>5' modificação:</forte> sem modificação <forte>3' modificação: sem modificação</td><td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC</td><td>hairpin probe</td></tr><tr><td>fio de ligante de amina</td><td>5' modificação: /5AmMC6/ 3' modificação: /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>ponta de prova hairpin</td></tr><tr><td>BHQ2 fio</td> <td>de ancoragem<forte>5' modificação: /5ThiolMC6-D/ 3' modificação: /3BHQ_2/</td><td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; sonda de grampo de cabelo</td></tr><tr><td>Cy3B ligante strand</td><td>5' modificação: Cy3B 3' modificação: /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>sonda de grampo</td></tr><tr><td>de cabelo destravando a <</td><td>forte>5' modificação: sem modificação 3' modificação: nenhuma modificação</td><td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td><td>desbloqueando sinal de tensão acumulada</td></tr></tbody></table>

sondas de tensão de dna para mapear as forças transitórias do receptor de piconewton por células imunes

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

As forças mecânicas transmitidas na junção entre duas células vizinhas e na junção entre as células e a matriz extracelular são críticas para a regulação de muitos processos que vão desde o desenvolvimento até a imunologia. Portanto, desenvolver ferramentas para estudar essas forças em escala molecular é fundamental. Nosso grupo desenvolveu um conjunto de sensores de tensão molecular para quantificar e visualizar as forças geradas pelas células e transmitidas a ligantes específicos. A classe mais sensível de sensores de tensão molecular é composta por grampos de alça de haste de ácido nucleico. Esses sensores usam pares fluoróforo-quencher para relatar a extensão mecânica e o desdobramento de pinos de cabelo de DNA sob força. Um desafio com os sensores de tensão hairpin de DNA é que eles são reversíveis com redobramento rápido do hairpin após o término da tensão e, portanto, as forças transitórias são difíceis de registrar. Neste artigo, descrevemos os protocolos de preparação de sensores de tensão de DNA que podem ser "travados" e impedidos de redobrar para permitir o "armazenamento" de informações mecânicas. Isso permite o registro de forças de piconewton altamente transitórias, que podem ser posteriormente "apagadas" pela adição de ácidos nucleicos complementares que removem a fechadura. Essa capacidade de alternar entre o mapeamento de tensão em tempo real e o armazenamento de informações mecânicas revela forças fracas, de curta duração e menos abundantes, que são comumente empregadas pelas células T como parte de suas funções imunológicas.

Aqui mostramos imagens representativas de controle de qualidade de superfície (Figura 4). Uma superfície de alta qualidade deve ter um fundo limpo no canal RICM (Figura 4B) e intensidade de fluorescência uniforme no canal Cy3B (Figura 4C). Com o mesmo equipamento de imagem e condições idênticas de aquisição de imagens de fluorescência, a intensidade de fluorescência de fundo deve ser consistente e reprodutível sempre ao realizar exp...

Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso de sondas de tensão baseadas em DNA para obter imagens das forças receptoras aplicadas por células imunes. Essa abordagem pode mapear forças receptoras >4.7pN em tempo real e pode integrar forças ao longo do tempo.

Sondas de Tensão de DNA para Mapear as Forças Transitórias do Receptor de Piconewton por Células Imunes

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Este protocolo oferece um método para mapear as forças moleculares geradas pelas células e, particularmente, pelas células imunes. O protocolo é fundamental para laboratórios interessados em estudar mecanotransdução em mecanobiologia. A principal vantagem desta técnica é que é super fácil e permite usar microscopia de fluorescência convencional para quantificar a transmissão de força em células imortalizadas e primárias.Para começar, coloque as lamínulas de 25 milímetros em um rack de politetrafluoretileno em um copo de 50 mililitros e enxágue as lamínulas três vezes, submergindo-as em água. Misture volumes iguais de etanol e água e adicione 40 mililitros desta solução ao copo que contém a cremalheira e as lamínulas. Em seguida, sele o copo usando fita parafilm.Limpe as tampas sonicando o copo por 15 minutos em um limpador ultrassônico e descarte o líquido após a sonicação. Em seguida, enxágue o copo que contém a cremalheira e as lamínulas com água pelo menos seis vezes para remover qualquer solvente orgânico restante. Para preparar uma solução fresca de piranha, adicione 30 mililitros de ácido sulfúrico a um copo de 50 mililitros e adicione lentamente 10 mililitros de peróxido de hidrogênio.Misture suavemente a solução de piranha usando a extremidade de uma pipeta de vidro. Para iniciar o condicionamento, transfira o rack que contém as lamínulas para o copo contendo solução de piranha e incube por 30 minutos à temperatura ambiente para limpar e hidroxilar as lamínulas. Em seguida, transfira o rack usando pinças de aço ou politetrafluoretileno para um copo limpo de 50 mililitros e enxágue com água seis vezes.Para remover completamente a água, mergulhe o rack que prende as tampas em um copo de 50 mililitros com 40 mililitros de etanol. Em seguida, descarte o etanol. Em seguida, imergir o rack em 40 mililitros de etanol contendo 3% de aminopropiltrietoxisilano por uma hora à temperatura ambiente para iniciar a reação com o grupo hidroxila nas lamínulas.Enxágue a superfície das tampas seis vezes, submergindo-as em 40 mililitros de etanol e seque-as em forno a 80 graus Celsius por 20 minutos. Cubra o fundo interno da placa de Petri com uma fita parafilm para evitar que as tampas deslizem para dentro da placa de Petri. Em seguida, coloque as tampas cobertas de amina com o lado a ser funcionalizado com sondas de tensão de DNA voltadas para cima.Cubra as lamínulas a 20 graus Celsius para uso futuro. Para modificar os grupos de amina nas lamínulas, adicione ácido lipóico PEG NHS e mPEG NHS e incube a placa de Petri à temperatura ambiente por uma hora. Ao final da incubação, enxaguar a superfície três vezes com água.Depois disso, adicione 100 microlitros de bicarbonato de sódio 0,1 molar contendo um miligrama por mililitro de Sulfo-NHS-Acetato a um conjunto de lamínulas de sanduíche e incube por 30 minutos para que ocorra a passivação. Adicione 0,5 mililitros de nanopartículas de ouro a cada lamínula e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, enxágue as lamínulas com água três vezes.Depois de adicionar a fita Black Hole Quencher 2 à sonda de tensão de DNA recozido em uma proporção de dez para um, adicione 100 microlitros da mistura por duas lamínulas para fazer o sanduíche. Coloque cuidadosamente uma bola de tecido de laboratório molhada na placa de Petri longe das lamínulas e sele a placa com fita parafilm para evitar que a solução seque. Depois disso, cubra o prato com um papel alumínio e incube-o a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, monte a câmara de imagem, tomando cuidado para evitar rachaduras na superfície enquanto aperta a câmara. Em seguida, adicione 0,5 a um mililitro de Hank's Balanced Salt Solution à câmara de imagem. Use o canal Cy3B com uma objetiva de 100X para capturar sinais fluorescentes de células plaqueadas nas sondas de tensão hairpin de DNA quando elas começam a se espalhar.Depois de preparar 100 microMolares não fluorescentes de fita de bloqueio, no ponto de tempo desejado, adicione-o às células em uma concentração final de um micromolar na câmara de imagem para armazenar o sinal de tensão e misturá-lo com as células por pipetagem. Após cerca de 10 minutos de bloqueio, adquira filmes de lapso de tempo ou imagens de ponto final em epifluorescência para mapeamento qualitativo de tensão e análise quantitativa. Uma superfície bem-sucedida tinha uma cor rosa pálido.A alta qualidade da superfície foi demonstrada com um fundo limpo e a microscopia de contraste de interferência de reflexão ou canal RICM e intensidade de fluorescência uniforme no canal Cy3B. Imagens de lapso de tempo do bloqueio de tensão indicaram que os sinais de tensão TCR anti-CD3 epsilon e TCR-peptide-MHC foram amplificados devido ao bloqueio do hairpin e acúmulo de sinal. A fita de bloqueio registrou eventos de tração mecânica de curta duração do peptídeo TCR MHCN4 a partir de zero minutos, o que facilitou a análise quantitativa e revelou o padrão distinto da força MHC do peptídeo TCR que se assemelhava ao padrão bullseye das sinapses imunes.A cada passo, sua intenção de preparação do substrato da sonda precisa de atenção aos detalhes e manuseio cuidadoso dos materiais. Essa tecnologia permite a visualização de forças moleculares transitórias que ocorrem na superfície celular quando ela interage com o ambiente, especialmente nas células imunes em busca de antígenos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós apresentamos dois independentes, microscópio de ferramentas baseadas em medir as deformações induzidas nucleares e citoesqueleto em single, vivendo células aderentes em resposta à aplicação de tensão global ou localizada. Estas técnicas são utilizadas para determinar a rigidez nuclear (ou seja, deformabilidade) e para transmissão de força sonda intracelular entre o núcleo e citoesqueleto.

Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas

Neste vídeo, as sondas de força de biomembrana (BFPs) são usadas para medir as forças entre receptores e ligantes. Essa técnica pode detectar interações monitorando a pressão necessária para quebrar as ligações entre o pMHC conjugado nos grânulos da sonda e os TCRs nas células-alvo.

Sonda de força de biomembrana para quantificar as interações receptor-ligante

O vídeo demonstra um método para avaliar as forças do receptor aplicadas por células imunes usando nanopartículas de ouro ancoradas em polietilenoglicol e sondas de tensão de gancho de cabelo de DNA. As interações de células T CD8-positivas desencadeiam o desdobramento da sonda, emitindo fluorescência enquanto as fitas de bloqueio sustentam o sinal para quantificar as forças aplicadas pelas células imunes.

Usando sondas de tensão baseadas em DNA para avaliar as forças receptoras aplicadas pelas células imunes

Medimos a libertação da tensão num axónio que foi parcialmente lesionada com um dissecador de laser através da medição simultânea de espectroscopia de força realizado em uma sonda opticamente preso aderida à membrana do axónio. O protocolo experimental desenvolvido avalia a aderência do axónio para o substrato de cultura.

Medição da tensão Lançamento Durante Laser Induced Axon lesão axonal Avaliar Adesão ao substrato em piconewton e resolução de milissegundos

Descrevemos uma técnica para medir simultaneamente a cinética de ligação de um único receptor-ligante regulada por força e imagens em tempo real da sinalização de cálcio em um único linfócito T.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

Vários biossensores de força baseados em FRET foram desenvolvidos recentemente, permitindo a resolução específica da proteína da força intracelular. Neste protocolo, demonstramos como um desses sensores, projetado para o ligante da proteína do complexo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, pode ser usado para medir as forças de actomiosina no complexo nuclear LINC.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Neste protocolo, descrevemos um método de micropipeta para aplicar directamente uma força controlada para o núcleo de uma célula viva. Este ensaio permite interrogatório das propriedades mecânicas nucleares na célula viva, aderente.

Uma sonda de força direta para medir a integração mecânica entre o núcleo e o citoesqueleto

Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Tensão de integrina tem um papel importante em várias funções da célula. Com um sensor de tensão Integrativa, integrina tensão é calibrado com sensibilidade de picoNewton (pN) e cuja imagem em resolução de submicron.

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Este método mede a propensão de uma célula a romper duplex de DNA imobilizado que apresenta ligantes para relatar forças de tração celular relativas. Oligos fluorescentes rompidos são entregues na célula e analisados por citometria de fluxo, registrando a história mecânica da célula. Isso permite a medição de alto rendimento da geração de força celular no contexto da mecanofenotipagem celular.

Medição de citometria de fluxo de alto rendimento do mecanótipo celular com base na ruptura e entrega de sondas de tensão de DNA nas células

Aprenda a usar sondas de tensão de DNA para mapear forças de piconewton em células imunes. Este método permite visualizar e armazenar eventos mecânicos transitórios usando microscopia de fluorescência convencional.

Sondas de Tensão de DNA para Mapear as Forças Transitórias do Receptor de Piconewton por Células Imunes

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