Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

A crescente demanda por coleta de dados em larga escala na tomografia criogênica de elétrons requer rotinas de aquisição de imagens de alto rendimento. Descrito aqui é um protocolo que implementa os recentes desenvolvimentos de estratégias avançadas de aquisição que visam maximizar o tempo-eficiência e o throughput da coleta de dados tomográficos.

A configuração de uma sessão de coleta de dados em larga escala é um procedimento demorado que pode reduzir consideravelmente o tempo restante do microscópio disponível para aquisição da série tilt. Este método permite a configuração rápida da aquisição automatizada de dados de tomografia em larga escala para maximizar a eficiência de tempo dos experimentos de tomografia que requerem uma seleção cuidadosa de metas de aquisição. Comece abrindo uma instância serialem falsa.

Uma vez mapeado o primeiro quadrado de grade, use a opção de menu do navegador SerialEM para ver a montagem na instância serialEM falsa. Clique duas vezes na janela do navegador para abrir o mapa quadrado da grade. Pesquise o mapa e use a opção de navegador SerialEM falsa adicionar pontos para adicionar pontos de aquisição de imagem no alvo de interesse.

Depois de mapear os novos quadrados, salve o arquivo do navegador e mescle novamente o navegador. Continue até que todos os quadrados da grade sejam mapeados. Novamente, mescla o arquivo do navegador com a instância serialEM falsa.

Execute o script de mapas virtuais Pi EM a partir do menu SerialEM falso. Selecione ferramentas e selecione mapas de âncora virtual. Isso pode levar algum tempo dependendo do tamanho e quantidade dos mapas quadrados da grade, bem como do binning dos mapas de exibição e visualização.

Para garantir o bom desempenho do microscópio, use a mesma configuração de ampliação e tamanho do feixe para aquisição de dados na seguinte ordem. Execute o alinhamento sem coma serialem pelo CTF. Insira e centrale uma abertura objetiva.

Execute serialem astigmatismo correto por CTF e GIF quick tune. Em SerialEM, abra o novo arquivo do navegador. Deses selecione todos os pontos A.

Selecione os mapas de primeira exibição. Selecione o colapso. Clique em Um colapso duas vezes e dese selecione.

Selecione a posição do mapa de visualização da primeira. Pressione Shift T e selecione a última posição do mapa de exibição e pressione Shift T novamente. Escolha imagens de quadro único nas propriedades do arquivo para abrir uma caixa de diálogo.

Na próxima caixa de diálogo de propriedades do arquivo, selecione os parâmetros desejados de acordo com as necessidades de imagem e a configuração do instrumento. Quando solicitado, dê um nome com um número e clique em salvar. Configure o controlador da série de inclinação para a primeira posição TS.

Quando terminar, clique em OK para definir esses parâmetros para todas as séries de inclinação após este item de aquisição. Todos os mapas de visualização são agora selecionados como TS com um nome de arquivo numerado. Se necessário, defina a distância de foco/faixa para cada alvo.

Clique duas vezes no mapa de exibição para carregá-lo. Selecione o mapa de visualização na lista do navegador. Em seguida, selecione editar foco na janela do navegador.

No painel de controle de baixa dose, dese selecione girar o eixo inter-área para posicionar o ensaio e focar ao longo do eixo de inclinação do estágio. Clique na região desejada no mapa de exibição carregado para definir a posição de teste de foco para esta série de inclinação e garantir que o item do navegador tenha conjunto TSP. Repita o procedimento para todos os itens.

Edite o intervalo de foco no script PreTomo que é executado antes de cada série de inclinação. No menu da série de inclinação SerialEM, verifique o script de execução em TS e selecione o número de script do script DuringTomo durante cada inclinação. Verifique o nível do tanque de nitrogênio e se o turbo-off do carregador automático está selecionado.

Verifique o espaço livre de armazenamento de dados. No menu de arquivos SerialEM, dese selecione a economia contínua para o arquivo log. Cada série de inclinação terá seu próprio arquivo de registro.

Depois de clicar em adquirir em itens no menu de navegação, execute o script PreTomo. Selecione a tarefa principal de adquirir séries de inclinação e selecione executar script após PostTomo. Selecione válvulas de coluna fechada no final e envie e-mail no final e clique em ir.

Foram selecionados 71 quadrados adequados no mapa da grade na ampliação inferior. Foram adquiridos mapas médios de ampliação com configurações que permitem a visualização direta e identificação da amostra de interesse, coronavírus neste caso. O tempo de aquisição foi de três minutos por quadrado, três horas e 45 minutos no total.

À medida que o primeiro mapa quadrado foi criado, uma instância serialEM falsa foi aberta em um computador separado para visualizar o mapa quadrado e adicionar pontos em alvos adequados para aquisição de séries de inclinação. A dose baixa serialEM foi configurada e imagens de visualização e visualização de referência foram tiradas e salvas como mapas. Estes últimos mapas poderiam então ser usados imediatamente na instância serialEM falsa para gerar a visualização virtual e a visualização virtual a partir das imagens correspondentes do mapa quadrado.

Os mapas de visualização virtual foram usados para um centro inicial do alvo, seguido por um centro final realizado na ampliação real da série tilt usando o mapa de visualização virtual. Os usuários devem se dar muito tempo para explorar a paisagem da amostra. Depois de ter pesquisado alguns mapas, desenvolve-se uma melhor sensação de áreas de boa qualidade para coletar dados.